液相色及其检测技术.ppt

液相色谱及其检测技术,李俊玲2013年8月1日,主要内容,液相色谱基本知识液相色谱常见故障及维护保养液相色谱的应用检测方法前处理技术报告及数据分析液质联用技术,1 液相色谱基本知识,1.1 液相色谱的发展,20世纪初，俄国植物学家茨维特（Tswett）提出经典液相色谱法。1938年有了薄层色谱。1944年有了纸色谱。20世纪50年代后，气相色谱迅速发展，液相色谱发展缓慢。20世纪60年代末期，随着微粒固定相的研制成功，及高压输液泵和高灵敏度检测器的出现，高效液相色谱方法在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上建立起来。20世纪70年代，往复式双柱塞恒流泵占主导地位，Kirkland制备出多孔球形硅胶，平均粒径7m。20世纪80年代，研制出二极管阵列紫外吸收检测器。20世纪90年代，HPLC高速发展，联用技术，多维色谱成为活跃的新技术领域。2000年后，亚二微米填料（色谱柱50mm），高分离度快速（超高效）液相色谱提高了分析的速度。,早期的柱色谱,玻璃柱填料：硅胶氧化铝纤维素,样品,溶剂,重力洗脱,1.2高效液相色谱的组成,什么是高效液相色谱(HPLC)高效液相色谱的定义为：高压泵驱动液体(流动相)通过装填有涂层颗粒的柱管(色谱柱)将混合物分离为单一组分的色谱分离技术。,HPLC的主要组成部分溶剂输送系统(泵)溶剂流动相进样器(进样阀)色谱柱固定相检测器数据系统,HPLC的特点.高压：系统压力10-40MPa；(1 MPa=10 bar=147psi).高速：分析时间短,仅几分钟到几十分钟；.高效：柱效高为5000-30,000塔板数/m.高选择性：适于复杂、多组分样品的分离.高灵敏度：最低检测线（LOD）UVD 10-9g;FLD 10-12g；RID 10-6g；,液相色谱仪各个模块,液相色谱仪由输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录数据处理系统五部分组成。.2.1 输液系统)流动相和储液罐流动相有机溶剂，纯水，缓冲盐溶液等储液罐玻璃，不锈钢，塑料容器，0.5L-4L 连接管路塑料管，配有不锈钢或玻璃过滤器，孔径为0.45m左右。,图片,液相色谱仪各个模块,2）输液泵A.对泵的要求 a)泵要耐腐蚀，一般采用不锈钢材料制成，b)在高压下能连续工作，压力一般为40-50MPa,24h工作，c）输出流量范围宽，填充柱：0.1-10（mL/min）微孔柱：0.01-10(mL/min）d)流量稳定，流量的控制精度应小于。,液相色谱仪各个模块,B.常用泵 气动放大泵、往复泵、螺旋注射泵、隔膜泵等几种，由于气动放大泵和螺旋注射泵存在流量调节不便、溶剂更换困难、不利于进行梯度洗脱等缺点,应用越来越少。往复式柱塞泵的应用更为普遍。a)恒流泵 如往复泵（）注射型通过控制电机转数来改变柱塞移动速度,操作方便,缺点是液缸容积小,不利于连续工作。(）往复型有并联和串联两种,如安捷伦1100、1200的泵就是双柱塞、往复式串联泵。b)恒压泵如气动放大泵 是输出压力不变的泵，系统阻力不变时可保持恒定流量，否则流量改变。,液相色谱仪各个模块,3）梯度洗脱装置梯度洗脱是在洗脱过程中，连续或间断的改变流动相中含有的两种或两种以上不同极性溶剂的比例，即调节流动相的极性，使样品中的组分可在最短的时间内达到满意的分离。实现梯度洗脱，需要二元或多元泵，梯度控制装置及软件。a 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。b 高压梯度（或称内梯度系统）：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。,气动放大泵（恒压）往复式柱塞泵（恒流）,液相色谱仪各个模块,1.2.进样系统定量地将试样注入色谱系统的装置。1)六通阀进样器耐高压，死体积小，不锈钢材料制成，定量管体积5-10L。2)自动进样器由计算机控制，按预先编制的进样程序进行，进样量连续可调，重复性好。,液相色谱仪各个模块,1.2.分离系统包括色谱柱和柱箱及控温部分）色谱柱内壁抛光的直型柱管，内装固定相，标准柱长一般为10-50cm，内径4.6mm，微孔柱内径0.5-1.0 mm。,液相色谱仪各个模块,）柱箱及控温部分要求控制柱温的情况：a.标准分析中，要求保留时间再现；b.通过改变柱温提高分离效率；c.分析高分子化合物或大黏度样品：d.有生物活性的样品柱温要低于室温；e.复杂样品采用二维色谱技术，需在不同温度下操作。柱箱控温范围：低于室温10-80，对凝胶渗透色谱，柱温从室温到150。,液相色谱仪各个模块,1.2.检测系统检测器是液相色谱三大关键部件之一，用于监测色谱柱分离后组分浓度的变化，由记录仪绘出色谱图来进行定性定量分析。理想的检测器应具有以下特征：a.灵敏度高，b.对所有溶质都有快速响应，c.线性范围宽，d.适用范围广等。常用的检测器有:紫外吸收检测器,荧光检测器,示差折光检测器,电导检测器等。,液相色谱仪各个模块,1)紫外吸收检测器 A)固定波长 由光源(低压汞灯),滤光片，流通池,光电池接收器等组成.波长为254nm,280nm,流通池体积为5-10L,光路为 5-10mm。光电池接收信号经放大输出。B)可变波长 一般采用氘灯和钨灯作光源，波长在190-700nm范 围内,由光栅将光分为单色光，由光电二极管接收某一特定波长的信号。,液相色谱仪各个模块,1)紫外吸收检测器C）光二极管阵列检测器是一种新型的紫外吸收检测器，进入流通池的不是单色光，获得的信号是全部紫外光波长的色谱信号，因此不仅可以进行定量检测，还可以提供组分的光谱定性信息。采用钨灯和氘灯做光源，光照射到流通池上，透过光经光栅色散后，投射到由1024个二极管组成的阵列上被检测。全部检测过程由计算机控制，不仅可以绘制随时间的变化进入检测器的液流的光谱吸收曲线吸光度随波长的变化曲线，可以画出三维立体谱图。,液相色谱仪各个模块,）荧光检测器 利用某溶质在受紫外光激发后可发射荧光的性质进行检测的是一种高灵敏度选择性检测器。激发光源常用氙灯，可发出250-600nm连续波长的强光，经透镜单色器分出有一定波长的激发光，照射在流通池上，溶质受激发后产生的荧光，经聚光和单色器，选择出需要检测波长的光，聚焦在光电倍增管上，将光转变成电信号，经放大输出到微处理机。,液相色谱仪各个模块,）示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光率之差来测量试样的浓度的，是一种通用型检测器。由于它对流动相的任何变化都有响应，因此不能用于梯度洗脱。另外受温度影响波动大，灵敏度低，使用时有一定限制。,液相色谱仪各个模块,）电导检测器是一种选择性检测器，通过测量流动样品的电导或电阻进行检测，主要用于检测以水溶液为流动相的离子型溶质，在离子色谱中应用广泛。有代表性的电导检测器是双电极微型检测器和五电极电导检测器。,液相色谱仪各个模块,1.2.5 色谱数据处理系统 1)记录仪,绘制色谱图。2)微处理机，与色谱仪连接构成一个比较完整的色谱分析系统。它包括一定容量的程序存储器，方法存储器，数据存储和谱图记录和显示器等，通过键功能给出操作参数指令。3)色谱工作站，全部操作参数的控制，多台仪器控制，网络运行功能等。,1.3 液相色谱的分离模式,HPLC的分离模式，主要有四种反相色谱正相和吸附色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱,1.3.1 反相色谱柱填料是非极性的(如，C18,C8,C3,苯基，等.)流动相是水（缓冲液）+可与水混溶的有机溶剂(如，甲醇、乙腈）反相色谱（RPLC 或RPC）是最常用的模式 90%以上的色谱工作者都用这种模式，或者说大多数液相色谱的检测，都是这种模式。这种技术可用于分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子.RPC 的适用性非常广泛,对于包含各种化合物的样品来说，经常要采用梯度洗脱.开始时流动相以水为主，然后随着时间延长逐渐加入有机溶剂。有机溶剂增加了溶剂强度，洗脱在RPC填料上保留很强的化合物。,1.3.2 正相色谱在这一模式中，柱填料是极性的（如，硅胶、氰丙基键合、氨基键合等），而流动相是非极性的（如己烷、异辛烷、二氯甲烷、醋酸乙酯）进行正相分离的实验不到10%这项技术有以下应用：.水敏性化合物.几何异构体.顺-反异构体,1.3.3 离子交换色谱,离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。,阴离子交换柱的功能团主要是NH2，及NH3：阳离子交换剂的功能团主要是SO3H及COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。,1.3.4 尺寸排阻色谱,空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)，是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。其固定相为化学惰性多孔物质凝胶，凝胶具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。,2 液相色谱仪的日常维护与常见故障排除,2.1 液相色谱仪的日常维护,2.1.1 储液器 流动相使用HPLC级试剂/溶剂；含缓冲盐的流动相过0.45m膜除去微粒物质;更换流动相时,应彻底清洗，防止交叉污染；定期清洁储液器及过滤白头，防止滋生微生物。,2.1.2输液泵,密封垫易损坏引起故障，每天实验结束一定要认真冲洗泵,注意防止堵塞,使用缓冲盐流动相时,更要小心。可以配备泵的在线清洗装置。使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高,要适当调整压力,一般压力上限在10-20MPa，下限为0.5MPa，注意防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧坏电机。,2.1.3 进样器,停机前一定冲洗干净进样器内残留的样品或缓冲盐，防止样品和无机盐沉积造成进样阀转子面磨损或堵塞。注射器最好使用仪器自配尖头、平头针，不要用其它仪器的。,2.1.4 色谱柱防止柱性能下降,1 溶剂的化学腐蚀性不能太强；2 避免颗粒物在柱头沉降；3 柱压不能太高，防止冲击太大；4 流动相pH值小于7时，最好用大粒度同种填料的予 柱；5 柱头加滤片（烧结不锈钢),需要时加保护柱；6 经常清洗柱；7 长时间不用时要保存好,一定要洗去缓冲盐,加入有机溶剂（如乙腈、甲醇均可），将柱两端拧紧,保持柱填料湿润。,2.1.5 检测器,1.保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗；2.使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内；3.检测器灯有一定寿命，不用时不开灯。,2.1.6 记录器数据处理系统,记录仪:热敏式打印头要注意记录纸的质量,开机前注意检查走纸部件,不要卡纸。色谱工作站:防止网上病毒损坏软件。不用移动硬盘或是U盘等拷贝工作站上的数据，如果必须拷贝，也只用仪器专用的。,2.2 常见故障的排除,2.2.1 储液器1）脱气不充分(噪声大，出毛刺)用He脱气 真空脱气 超声脱气 加热回馏脱气(混合流动相不宜),2）流动相供给不畅，泵压力不稳 流动相接近用完，可能吸入部分气体；过滤器（过滤白头）堵塞（有颗粒，长霉）；可能是流速过高,阻力大,造成走空现象。解决办法：更换流动相，清洗过滤器，降低流速，加大管路内径;抬高储液器。,3）储液器或流动相被污染 产生有规则的噪声；基线上升，梯度洗脱出鬼峰；原因:溶剂质量差（含杂质多）；配流动相的玻璃器皿不干净,微生物影响；配制流动相的操作不当（过滤、脱气、搅拌),2.2.2 输液泵,1）单向阀a.球和阀座粘在一起，堵死，打不出溶剂，(缓冲盐流动相)用高质量的溶剂冲洗，不同极性溶剂冲洗,如水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷，更换新单向阀。b.球和阀座密封不严，压力不稳，气泡进入阀中，紧贴在阀体内，使球难以返回阀座，引起倒流，压力和流速变化大，可能有小晶体颗粒。清除气泡的办法：打开排液阀，大流量冲洗，用脱过气的甲醇冲洗，一般可解决问题。,2）泵垫圈磨损或破碎：高压下压力不稳，从泵头往外渗漏流动相，色谱峰的保留时间会改变。解决办法：更换新垫圈。更换方法按维修说明书上的方法一步步操作。或是请工程师上门，尤其是头一次维修。注意：输液泵的垫圈要和流动相匹配协调。多数垫圈和流动相是协调的,但有的垫圈适用于甲醇、水、乙腈，在四氢呋喃中溶解、变粘、变软。需换垫圈时,应向厂商咨询垫圈的规格型号。色谱工作者一般应学会换密封垫圈。,3）柱塞杆故障 磨损、漏液 使用不当被折断 柱塞杆被卡住，不能运动。更换新柱塞杆 请维修工程师帮助解决，或参照专门的操作手册自己动手更换。,2.2.3 进样系统,1）渗漏 转子密封垫圈松紧不合适；垫圈不配套；组装不对。2）堵塞,样品打不进去。样品管堵塞：环管用反冲法或超 声清洗排除（或换新管).,手动进样系统器,3）注样孔 a)装样时针头周围渗漏：孔道堵塞，或者放空管和样品管太细，阻力太大；针头密封管规格不对，针头太细。b)样品滞留阀在进样位置停留时间不够。要求停留时间至少应让流动相流过的体积是环体积的10-20倍。(一般是在下一针进样前才将阀扳到装样位置),2.2.3进样系统,a.样品瓶不配套 瓶小针弯、折断 瓶大样品少，抽不上样 瓶破碎 更换合适的样品瓶。b.注意样品瓶隔垫，防止污染。c.进样器针头堵塞（样品、缓冲盐、隔垫碎片、针头本身)，可用溶剂清洗，金属丝疏通，或换新针头。,自动进样系统,2.2.3进样系统,d.样品滞留：空白溶剂出色谱峰.加倍清洗，或调整样品瓶顺序，（从低浓度开始，高浓度放后 面）或在样品瓶前放清洗液瓶.,自动进样系统,2.2.4 色谱柱,色谱柱是色谱系统的心脏正确选择色谱柱是液相成功分析的关键1)塔板数下降 a.样品处理不合适，选择适当的样品净化方法，选择合适流动相。b.柱头塌陷，填装修补，最好专业人士来做。2)峰形变坏 出现拖尾峰，分叉峰，非高斯峰。与塔板数下降有关，峰形坏保留时间不变，可能是柱堵塞(不锈钢烧结片)，或柱头有空穴。,不同分离模式的色谱柱反相色谱柱：C18，C8，C3，苯基，氰基等正相色谱柱：硅胶，氨基，氰基，二醇基等离子交换柱：有强阴，强阳，弱阴，弱阳之分体积排阻柱：凝胶渗透色谱柱与凝胶过滤色谱柱手性柱：用于手性化合物拆分亲和色谱柱：依据溶质与填料上配基之间的分子识别特性而实现分离,2.2.4 色谱柱,3)柱压突然增大 样品沉积在柱内,用能溶解样品的溶剂冲洗（断开柱和检测器）可正向冲，反向冲。柱内硬件有问题：滤片堵塞，换新片;塌陷：用相同填料填充、修补。,2.2.4色谱柱,4)保留时间改变 不同柱保留时间的变化,主要是填料差异造成的,不同牌号柱出峰顺序不变，保留时间有小的变化。若峰顺序变化，保留时间变化较大，应考虑换柱或优化分离条件。对专门的分析最好用同一批号的柱子。,由色谱柱引起的故障,理论塔板数,理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：N=（tR/）2=16(tR)2/W=5.54(tR/W1/2)2W：峰宽；：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）,2.2.5 检测器,1）紫外可见光检测器 a.灯故障:基线噪声大,灵敏度低,氘灯寿命:1000-3000h 钨灯寿命:2000h 一般至少使用6个月以上，可能接近寿命期限。b.流通池 基线有波动，或是基线变高、噪音明显 流通池内有气泡：用脱气甲醇，不同流量冲洗。池堵塞（入口、出口、池内）：用可溶堵塞物的溶剂冲洗（缓冲盐用 水冲洗）池污染：异丙醇、二氯甲烷、6mol/L HNO3冲洗.,2.2.5检测器,C 非线性响应 超出线性范围:样品量太大;检测器的衰减超出了其线性动力学范围;流动相的紫外吸收比较强.,2.2.5检测器,2)温度影响 环境温度变化引起基线漂移。流动相温度变化引起折射率改变，紫外光传导变化。柱温变化引起基线漂移。,2.2.5检测器,3)信号线故障记录仪和数据处理系统信号线插接不紧,接触不良，信号很弱，出现不需要的噪音,此时按说明书检查线路连接。地线对仪器很重要,仪器外壳和信号线的接地很严格，接地不良会出现较大的基线噪声，接错线会造成短路，烧毁仪器。,2.2.5检测器,4)波长问题正确选择波长:既照顾到灵敏度,又考虑到稳定性。HPLC中，波长选择是依据待测物质最大吸收波长来决定的。通常，高效液相色谱检测器为紫外检测器，所以HPLC中波长的选择和紫外波长选择一致，均为选择最大吸收波长，这样能保证检测的灵敏度和响应值最高。,3 与液相色谱仪配套使用的设备,3.1 设备所在仪器室的辅助设施3.2 与液相色谱配套的前处理设备,3.1 设备所在仪器室的辅助设施,空调：控制温度排气罩：排除有机溶液温湿度计：适时记录温度、湿度避光的窗帘：避光双层窗户：防尘大功率的电源线：10A、16A、20A。,台面的承重、距离墙面有50-70cm的距离、仪器台面的宽度：边台一般80cm、中央台150cm,3.2 与液相色谱配套的前处理设备（提取）（净化）浓缩,水浴锅分液漏斗振荡器恒温水浴振荡器振荡器超声波振荡器涡旋混合器固相萃取仪真空泵（无油隔膜泵）溶剂过滤装置,旋转蒸发仪氮吹仪平行蒸发仪离心机（配置不同的转子或适配器）各种规格的移液器瓶口分配器冷却循环水装置,3.3 应急设施,延时电源：应对突发事件，如突然停电EPS应急电源:提供一种符合用户要求的具有独立回路的应急供电系统，该系统能够在应急状态下提供紧急供电，用来解决只有一路市电、缺少第二路电源，或代替发电机组构成第二电源。,规格范围：3KW800KW安装形式：落地式（标准配电柜）静态、无噪音、无排烟、无公害、无火灾隐患；自动切换。可实现无人值守；节能，非应急供电时，基本不耗电；性能稳定，安全可靠，使用寿命长；与发电机组相比缩合造价低，性能价格比好。,3.4 液相色谱实验室的管理,日常管理：包括卫生、开关门窗、水、电、气、空调、温湿度记录等等。设备的使用记录：使用前后仪器的状态是否正常、检测样品名称或编号、检测参数、检测人、温湿度等；维护保养也要记录、维修也要记录。,H:检验室管理检查表.doc,仪器室管理内容,1、管理人员上午上班查看整理内容地面：整洁；物品按规定区域存放；操作台面：台面干净、物品摆放整齐；试剂架：干净、试剂摆放整齐；橱子内外：物品整齐、内外干净；抽屉内外：抽屉内物品整齐，抽屉边框干净；通风橱：边框玻璃干净，台面整洁，物品摆放整齐；空调：干净整洁；试剂：过期试剂及时清理，试剂瓶干净，标签粘贴一致规范；窗台窗框：擦拭干净；门：门里、门外、门框清洁干净；仪器：表面整洁、按区域存放；仪器使用记录：固定区域存放，检查有无漏签，干净整齐；温度湿度：早8：309：00记录室内温度和湿度，及时补充温湿度计所需的水；其他：灭火器、线路等保持清洁、顺畅。,2、管理人员在下午下班时逐项检查并记录的项目：水：检查回流水、水管是否关闭、滴漏；电：检查照明、仪器等的电源是否关闭，如有仪器正在使用要注明；气：检查钢瓶、气路是否关闭，如有仪器正在使用要注明；窗：应关闭，如有必要开窗，注明原因；门：关闭。3、填表方式：符合要求的打“”；不符合要求的打“”；“水、电、气、窗”等正在使用或需要打开的注明原因，或填上在用设备编号。温度湿度：早8：309：00记录室内温度和湿度，及时补充温湿度计所需的水；,H:检验室管理检查表.doc,3.5 液相色谱仪的管理,专人管理、有限人员的使用定期检定定期维护定期核查新上岗人员一定培训后经考核合格才能上岗对新上岗人员做好监督,3.5 液相色谱仪的管理,起草操作规程：开机前准备工作，如何开机，各个模块如何操作，如何编辑检测方法、如何检测样品、图谱如何让处理、如何让关机、关机后的清理工作等等。起草维护保养规程：多长时间、对什么部件、如何保养。核查规程：核查方法？核查结果分析判定。,4 液相色谱在检测工作中的应用,食品分析主要内容,食品添加剂残留天然化合物酸类化合物抗生素氨基酸抗氧化剂霉菌毒素,糖防腐剂农药酯类人工甜味剂环境污染物维生素着色剂无机离子香料化合物,举例1-农兽药残留检测,鸡肉中十种磺胺类药物残留的高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV）分析方法。采用C18柱，甲醇水/甲醇甲酸为流动相梯度洗脱，鸡肉样品经过甲醇提取，正己烷脱脂，SLW固相萃取柱净化，用HPLC法测定鸡肉中十种磺胺类药物的含量。结果表明，当鸡肉样品添加十种磺胺类药物为0.050.2mg/kg时，方法回收率为67.4%95.6%，变异系数为4.8%11.5%，十种磺胺类药物最低检出浓度为0.01mg/g。,食品添加剂检测,采用ODSC18柱，甲醇乙酸铵作为流动相，针对不同类型样品，采用不同前处理方法，样品处理液最后于液相色谱仪进行分析定量。结果:乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、阿斯巴甜在00.32mg/ml浓度范围内，标准曲线线性关系良好，RSD为0.67%6.8%；乙酰磺胺酸钾加标回收率为93.1%99.6%、苯甲酸为90.5%98.7%、山梨酸为91.5%102.5%、糖精钠为91.8%100.9%、脱氢乙酸为92.3%99.8%、阿斯巴甜为90.3%103.5%。,霉菌毒素检测,采用高效液相色谱法，使用Agilent1100色谱柱；在柱温30；乙腈甲醇水（112）为流动相；流速为1.0ml/min；荧光检测器；测出黄曲霉素在花生中的含量，方法重复性的RSD为0.38%，平均回收率为78.4%。采用甲醇水溶液提取粮食中的黄曲霉毒素，提取液经过过滤、稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇为流动相洗脱，用高效液相色谱法直接测定。方法重复性的RSD为1.5%，平均回收率为90%105%。,食品安全分析应用的特点.样品种类繁多、基质复杂.极性高或热不稳定的品种越来越多.法规标准、待测物种类与数量数量迅速增加.检测标准日益提高LC及LC/MS已经成为安全食品领域极其重要而有效的分析技术！,5 检测方法前处理技术,样品前处理的重要性,最低检测限量的限制仪器(LC/LC-MS等)的对样品洁净度的高要求样品基质中的内源性物质（如脂肪、蛋白、色素、盐份等等）对目标物的分离与检测的干扰样品的增多，要求前处理方法简单快速,5.1 溶剂萃取,溶剂萃取方法主要有液-液萃取、液-固萃取和液-气萃取，它们都是属于两相间的传质过程，即物质从一相转入另一相的过程。溶剂萃取技术在我们液相色谱分析的样品制备过程中，是用到最为广泛的一种技术。,在液-液萃取中非常重要的操作是急速的振动样品，这样可以确保两的完全接触，有助于质量传递。由于物质剧烈的振动，使得乳化现象经常发生，特别是那些含有表面活性剂和脂肪的样品。为了防止乳化形成，常采用加热或加盐的方法破乳。,常用于破乳的技术有：（1）加盐；（2）使用加热-冷却萃取容器；（3）通过离心作；（4）加少量的不同的有机溶剂。,5.2 固相萃取（phaseextractionSPE）,固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离。然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。与液液萃取相比固相萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相深的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，它采用高效、高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品的预处理过程，同时所需费用也有所减少。一般来说固相萃取费用为液液萃取的五分之一，但其缺点是目标化合物的回收率和精密度要略低于液液萃取。,固相萃取实质是上一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同，可分为正相（吸附剂极性大于洗脱液极性），反相（吸附剂极性小于洗脱液极性），离子交换和吸附。固相萃取所用的吸附剂与液相色谱常用的固定相相同，只是在粒度上有所区别。最简单的固相萃装置就是一根直径为数毫米的小柱，小柱可以是聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料，还可是不锈钢的。现在很多厂家开发了固相萃取的专用装置，固相萃取仪。,SPE柱构造,固相萃取小柱构造,固相萃取的一般操作程序分为以下几步聚：（1）活化吸附剂；（2）样品过柱（3）淋洗（4）分析物洗脱不同的模式固相萃取小柱活化所用的溶剂不同；洗脱所用溶剂也不同。,5.3 凝胶渗透色谱（GPC）,GPC是被用来去除脂肪和其它分子量相对较高的化合物，适用的样品范围极广，回收的农药品种多，回收率也高，不仅对油脂净化效果好，而且分析的重现性好，柱子可以重复作用，已成为药物残留分析中的通用净化方法。其作用类似一组分子筛，将样品溶液加到柱子上后，用溶剂淋洗，分子量大于农药的类脂肪，色素，蜡质等先被淋洗出来，然后农药按分子量大小相继被淋洗出来。常用的淋洗剂有环已烷，二氯甲烷，甲苯，乙酸乙酯等，这种技术在欧美国家应用非常普遍。,5.4固相微萃取（solidphasemicro-extractionSPME）,固相微萃取（SPME）是在固相萃取上发展起来的一种新型、高效的样品预处理技术它集采集、浓缩于一体，简单、方便、无溶剂，不会造成二次污染，是一种有利于环保的很有应用前景的预处理方法。与液液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适用于分析挥发性与非挥发性物质，重现性好等优点。固相萃取过程是一个平衡过程，萃取的平衡时间与搅拌速度、固定相的膜厚以及被分析样品的分配常数，扩散系数，萃取温度有关。大分子质量的物质比小分子质量的物质需更长的分析时间。搅拌有利于减少达到平衡所需时间，当达到平衡时，固相微萃取方法的灵敏度最高。,固相微萃取(SPME)非常小巧,状似一只色谱注射器，由手柄(Holder)和萃取头或纤维头(Fiber)两部分构成。萃取头是一根外套不锈钢细管的1cm长、涂有不同色谱固定相或吸附剂的熔融石英纤维头，纤维头在不锈钢管内可自由伸缩，用于萃取、吸附样品;手柄用于安装或固定萃取头，可永久使用。,5.5 微波萃取技术（microamplitudeextractionMAE）,微波萃取就是利用极性分子可迅速吸收微波能量来加热一些具有极性的溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮和水等。因非极性溶剂不能吸收微波能量，所以在微波萃取中不能使用100的非极性溶剂作为萃取溶剂。一般可在非溶剂中加入一定比例的极性溶剂来使用。MAE就是将样品放在聚四氟乙烯材料样品杯中，加入萃取溶剂后将样品杯放入密封性好、耐高压又不吸收微波能量的萃取罐中。由于萃取罐是密封的，当萃取溶剂加热时，由于萃取溶剂的挥发使罐内压力增加。压力的增加使用萃取溶剂的沸点也大大增加，这样就提高了萃取温度。同时由于密封，萃取溶剂也不会损失，也就减少了萃取溶剂的用量。,5.6 加速溶剂萃取（ASE）,加速溶剂萃取是在提高的温度（50200）和压力（10003000psi或10.320.6MPa）下用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖样品前处理方法。,将样品装入萃取池 Time(min),溶剂充满萃取池 0-1,萃取池加热加压 5,样品保持一定的压力 5 和温度(静态萃取）,向萃取池中注入清洁溶剂 0.5,用N2 吹扫萃取池 1-2,萃取液准备分析.Total 12-14,Solvent,Oven,Collection Vial,Vent,Extraction Cell,Pump,ASE提取过程,三、提取技术,ASE提取的特点,有机溶剂用量少、快速、回收率高克服了超临界萃取选择性差、回收率低的问题被美国EPA（环保局）的标准方法所采用国际上在食品安全检测中开始采用这一技术，设备价格昂贵,5.7 分散固相萃取MAS,MAS的含义是：Multi-function Impurity Adsorption SPE，即“多重机制杂质吸附萃取净化法”。主要通过多官能化的复合吸附材料，将生物样品中的主要干扰基质吸附，而将强水溶性的被测物质留在样品溶液中而达到净化和富集的目的。填充料一般为C18或C8,样品和填充料的比例通常为1:4。,MAS流程示意图,将样品及提取溶剂同时放入离心管中，震荡或超声提取；加入SPE填料吸附净化样品基质干扰，离心后检测目标物被留在了溶液里。取上清液进行后处理或直接检测。,快速，简单，提取和净化一步完成 避免了样品乳化、浓缩造成的待测组分的损失 经济，成本低,Mas 优点,MAS方法特点,常规SPE是吸附再洗脱得到目标化合物，而MAS是只吸附杂质MAS与一般吸附杂质的样品净化法的主要区别在于使用多官能团吸附试剂，同时除去多种杂质该方法的核心之一是对于蛋白质、多肽、氨基酸、磷脂等生物干扰基质具有较好选择性吸附的分离材料。通过选择合适的条件（溶剂组合、pH）可以将样品中大部分的生物干扰基质去除，而保证强水溶性被测物质具有70%以上的回收率。,6、样品处理的基本方法及经验,前处理方法的建立,6.1 概述目的：分离-检测基本内容：提取、净化、浓缩、衍生化6.2 样品预处理采集制备贮存,前处理方法的建立,6.3 提取方法1）样品种类饮料、果汁、奶、蛋、动物组织（肉、肝、肾等）2）提取溶剂-相似相溶原则-一般采用乙腈、甲醇和丙酮等水溶性溶剂-混合溶剂，增加选择性,前处理方法的建立,3）提取方法-组织捣碎法（homogenization)-振荡法(shaking)-索氏提取法(Soxhlet extraction)-超声波辅助提取（SAE）-强化溶剂萃取（ASE）-微波辅助萃取（MAE）-消解法：酸消解、碱消解、酶消解-其他,前处理方法的建立,6.4 净化方法1）液液萃取LLE2）固相萃取SPE3）固相微萃取（SPME）4）制备色谱法（HPLC、TLC）5）凝胶渗透色谱法（GPC）6）基质固相分散技术（MSPD）：兽药残留7）免疫亲和柱（IAC）：毒素8）分子印迹技术（MIPs)：痕量成分9)其他技术,前处理方法的建立,6.5 浓缩与富集-旋转蒸发浓缩-氮吹仪-浓缩器浓缩、平行蒸发仪-真空离心浓缩浓缩过程组分最容易损失,前处理方法的建立,6.6 衍生化-反应速度快-容易重复-定量完全、转化率稳定-产物易纯化-产物易于分离和检测-HPLC衍生化方法：多用荧光检测器-衍生化方式：柱前、柱后,分析应用对前处理技术的要求,提高检测灵敏度，可靠性（假阴性，假阳性）提高分析检测的整体速度,样品前处理方法比较LLE-化合物在不互溶的两相中的溶解度的不同达到分离,PPT(蛋白沉淀法)血样中去除蛋白,SPE保留目标物,GPC-根据分子量大小的差异到达分离，去除油脂、色素等大分子量的杂质,SPE(固相萃取)机理,Source:www.mycotoxins.org/,免疫亲和柱的净化过程,优点特异性强可浓缩样品液缺点耗时只针对单一毒素价格昂贵,前处理技术比较 小结,SPE：较通用LLE：水油两相PPT：蛋白质较多的样品，医药SPME：半挥发-挥发性样品，多与GC联用GPC：去除大分子杂质（油脂，大分子色素）ASE：加速溶剂萃取,样品前处理技术比较,SPE方法的优点,萃取过程简单快速，易于多样品平行操作易于自动化，提高分析效率样品更干净高样品回收率和良好的重现性降低溶剂的消耗以有限的预算、仪器、人力来应付更多的样品，更复杂的样品基质和更低的检测限,6.7 样品的采集、制备和储存,（一）正确采样的重要性：两个原则 第一，采集的样品有代表性 第二，采样过程中要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散或带入杂质（二）采样步骤,从大量的分析对象中抽取有代表性的一部分样品作为分析材料（分析样品），称为样品的采集。,（二）采样步骤,6.7 样品的采集、制备和储存,为获得均匀的样品，必须对样品进行粉碎、混均、缩分，这项工作即为样品制备。样品的制备方法因产品的类型不同而异：1.液体、浆体或悬浮液体 一般将样品摇均，充分搅拌。如：酱油、牛奶、饮料、蜂蜜等。常用工具为玻璃搅拌棒、电动搅拌器。2.固体样品 用切细、粉碎、捣碎、研磨等方法将样品制成均匀可检状态。水分含量少、硬度较大的固体样品（如谷物）可用粉碎法；水分含量较高，质地软的样品（如水果、蔬菜）可用匀浆法；韧性较强的样品（如肉类）可用捣碎法。常用工具有粉碎机、组织捣碎机、绞肉机等。3.罐头 水果罐头在捣碎前须清除果核；肉禽罐头应预先清除骨头、鱼类罐头要将调味品（葱、辣椒等）去除后再捣碎。常用的捣碎工具有高速组织捣碎机等。,（三）样品的制备,一、样品的采集、制备和储存,制备好的样品如果需要保存，应放在密闭洁净的容器内，置于干燥、通风、阴暗处保存，如谷物类。易腐烂变质的样品应保存在05冰箱内，如水果、蔬菜。禽肉类及鱼类样品须在-18冷冻保存，同时根据样品自身特性来规定适宜的保存期。,（四）样品的保存,6.7 样品的采集、制备和储存,黄曲霉毒素取样,取样与次取样,取样/二次取样 碾磨机,7、报告及数据分析,7.1 定量结果外标法（标准溶液的保质期）单点定位（样品与标准溶液的浓度接近）标准曲线（至少5个点，相关系数0.995）内标法（内标的选择、性质相近、保留时间接近）单点定位（样品与标准溶液的浓度接近）标准曲线（至少5个点，相关系数0.995）,7.2 定性保留时间定性二极管阵列检测器，特征峰两个色谱柱两个检测器,7.3 异常数据原因前处理过程：步骤、试剂、条件标准溶液：浓度、有效期色谱条件：流动相、流速、柱温、检测器等仪器本身是否正常,7.4 报告内容：检测原始记录色谱图样品的信息仪器信息检测环境信息检测结论,8 液质联用技术的应用,8.1 液质联用的优点,分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；分析时间快，LC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；自动化程度高，LC-MS具有高度的自动化。,8.2 目前比较常用的质谱仪器有：串联四极杆质谱仪、四极杆离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和离子回旋共振质谱仪等。,8.3 液质使用注意事项,如果进样，在每个序列完成后清洗离子源；如果序列中样品多，至少每日清洗一次离子源。在清洗前，使质谱处于Standby状态。流动相的水相瓶选用质谱上专用的棕色瓶，流动相瓶子洗涤时用纯净水清洗后，用少量Finsher色谱纯甲醇润湿瓶内壁后倒出，并保存试剂瓶于仪器傍边的指定位置。流动相的水用屈臣氏的纯净水（保证整瓶水是新鲜的，且未滋生细菌）。检测完毕冲洗色谱柱前，更换下盛水相的试剂瓶，换为Finsher色谱纯的甲醇或乙腈，Purge整个管路和脱气机腔体。,用液质联用仪检测的样品前处理时，用到的离心管等器皿专门存放，不与液相等器皿共用。洗涤时不得使用任何洗涤剂，即用自来水冲洗后，过蒸馏水即可。做加标回收和未知样品的前处理过程中注意不要交叉污染，因质谱仪灵敏度较高。,基质效应,是指样品中除了待测物以外的其他基质成分对待测物测定值的影响。它源自色谱分离过程中与被