染色质免疫共沉淀PPT.ppt

染色质免疫共沉淀(ChIP),目录,一、简介,DNA与蛋白质相互作用研究,一、简介,ChIP 是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。,二、原理,在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。,三、技术流程,具体操作流程,1、甲醛交联细胞,具体步骤,2、染色质超声断裂,1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min.每1min颠倒摇动一次离心管。2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。不同样本都进行超声条件优化实验。3.14000rpm离心10min（4），转移上清于1.5ml离心管。,3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物,？,？,4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）,40lProtein A/G Agarose Beads,1000rpm,离心5min,4,a 低盐洗脱溶液1ml洗一次b 高盐洗脱溶液1ml洗一次c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次d TE溶液(pH8.0)1ml洗两次,每次洗时，在摇床上摇10min,4，4000rpm离心5min,弃上清,5、洗脱免疫复合物,6、去除甲醛交联,加5mlNaCl使用NaCl终浓度为0.2mol/l阴性对照+350lChIP洗脱溶液+16l 5mol/l NaCl。65,过夜,去交联。,7、DNA纯化,酚/氯仿抽提,12000rmp离心5min,8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定,(1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。,四、应用,组蛋白修饰研究转录调控分析药物开发研究有丝分裂研究DNA损伤与凋亡分析,五、优缺点,优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。,谢谢大家！,