实验三 差速离心法提取线粒体及线粒体的活体染色.ppt

实验二 差速离心法提取线 粒体及线粒体的活体染色,一、实验目的,学会差速离心方法及活体染色一般方法。,二、实验原理,离心力 RCF=1.11910-5r n2线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。,三、实验用品,材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液,四、实验步骤,1、小白鼠断颈致死，用70%乙醇消毒外部后，剖腹取肝。2、用预冷到近0的匀浆介质洗肝，干净滤纸吸干水分，称重。3、将肝剪碎，按每克肝组织加8ml匀浆介质，加入到玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆。4、待肝组织基本碎裂后，移出到离心管中，在冷冻离心机上4800rpm离心15min，吸取上清液。,5、上清液再在冷冻离心机上11000rpm离心20min。6、弃去上清液，沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬浮液，吸1滴于载玻片上，加1滴詹纳斯绿染色液，染色（室温下）约20min。7、加盖玻片，置显微镜下观察。,实验步骤：,取材，制成悬液（组织块、细胞、细胞核、线粒体等）,4800rpm离心15min,沉淀（组织块、细胞和细胞核等,上清液,11000rpm离心20min,沉淀（Mit,Lys等）,上清液（GB,ER）,詹纳斯绿染色,去掉脂肪层,（3）对照片（无色）,（1）,（2）,1、2阳性；3阴性,五、作业,1、分析实验结果。2、试比较差速离心法和密度梯度离心法的异同。,