蔬菜中农残检测技术(刘潇威).ppt

蔬菜中农残检测技术,农业部环境质量检测中心 刘潇威,主要内容：,一、概述二、农药残留检测技术 1、技术发展概况 2、检测工作基本流程 3、NY/T 761-2008 4、问题与建议三、实验室检测质量控制,一.概述,1.农药定义 用于预防消灭或控制危害农业、林业的病虫、草及其它有害生物以及有目的调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其它天然物质或者几种物质的混合物及其制剂。,2.农药分类,按来源分类*按化合物类型分类,无机化合物,化学合成农药,生物源农药,矿物源农药,有机合成化合物,天然有机物,抗生素,生物农药,有机氯化合物有机磷化合物拟除虫菊酯氨基甲酸酯杂环类化合物其它（苯氧羧酸类、脲类化合物）,按作用方式分类,胃毒性农药（敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、马拉硫磷）触杀性农药（对硫磷、敌敌畏、甲胺磷、马拉硫磷）内吸性农药（乐果、甲胺磷、氧乐果、久效磷）薰蒸性农药（溴甲烷、磷化铝、敌敌畏）特异性农药（乙烯利、赤霉素、灭幼脲）,按主要防治对象分类,杀虫剂（杀螨剂）杀菌剂除草剂植物生长调节剂其它（杀鼠剂、杀线虫剂等）,3.我国常用农药,A、有机磷类 滴滴畏、甲拌磷、乐果、对氧磷、对硫磷、喹硫磷、伏杀硫磷、敌百虫、氧化乐果、磷胺、甲基嘧啶磷、马拉硫磷、辛硫磷、亚胺硫磷、甲胺磷、地亚农、甲基毒死蜱、毒死蜱、倍硫磷、杀扑磷、乙酰甲胺磷、巴胺磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、异柳磷、乙硫磷等,B、有机氯类-666、-666、-666、-666、op DDE、pp-DDE、op DDD、pp-DDD、pp-DDT、op-DDT、异菌脲、五氯硝基苯、林丹、乙烯菌核利、三氯杀螨醇、功夫、氯硝胺、百菌清、粉锈宁、甲氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等。,C、氨基甲酸酯类涕灭威砜、涕灭威亚砜、灭多威、3-羟基呋喃丹、涕灭威、呋喃丹、甲萘威、叶蝉散、仲丁威、速灭威等,4.合理使用农药、安全间隔期 及最大残留限量标准,（1）农药合理使用准则目的：用以指导合理、科学、安全使用农药，达到既能有效防治农作物病虫害又使产品中农残低于规定限量标准（MRL）。内容：包括适用作物、农药制剂、每亩每次最高施药量或施药浓度（稀释倍数），每季作物最多使用次数，最后一次施药距收获的天数，最高残留限量（MRL）参考值。,(2)最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）在农畜产品中农药残留的法定最高允许浓度，又称最高残留限量，以每千克农畜产品中农药残留的毫克数（毫克/千克）表示。制订目的：控制食品中过量农药残留以保障食用者安全，对超标的产品采取措施，即禁止食用。推行和指导合理用药，农产品监测超标时，表明未按规定用药。减少国际贸易纠纷，各国均制订本国的MRL。制订方法：按照农药标签上规定的施药剂量和方法使用农药后，在农产品中的最大残留浓度，其数值必须是毒理学上可以接受的，由各国政府部门按法规公布。GB2763-2005,规定了136种农药最高残留限量。国家标准作为一项加强农药管理的措施。,(一）、农药残留检测技术发展现状（二）、农残检测基本步骤(三）、检测方法（NY/T 761-2008)（四）、检测中常见问题及解决办法,二.农药残留分析技术,（一）、发展现状,1、基本概念：农药残留（Pesticide Residue）:农药使用后残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。以mg/kg,ug/kg,ng/kg表示。,*对待测样品中微量农药残留进行定性、定量分析为新农药提供其在农作物上的残留动态和最终残留制定农药最大残留限量和合理使用准则评价在农药对农畜产品和环境的安全性为制定防治污染措施提供依据,农药残留分析（Pesticide Residue Analysis),农药残留分析的特点,目的物种类多，结构差异大目的物含量低，样品中目的物仅以ug,ng甚至pg、fg存在样品种类多，干扰物成分各异方法要求灵敏、准确、快速、简便、成本低对样品的前处理和仪器分析提出更高要求,对待测样品中多类多种农药残留同时进行定性和定量。单种类农药的多残留分析（有机磷、有机氯）多种类农药的多残留分析已知多残留分析未知多残留分析（快速扫描）,多残留分析（Multi-Residue Analysis）,2、农药残留检测技术发展（1）.检测流程,样品采集,1.提取2.净化,仪器分析,（2）农药残留样品的提取方法：,振荡法;索氏提取法；匀浆捣碎法；超声波提取法；微波辅助提取法;加速溶剂萃取法；,（3）农药残留检测样品的净化方法：,液液分配法；层析柱法；固相萃取法：磺化法；薄层色谱法。,（4）新的前处理方法：,固相微萃取（SPME）;基质固相分散萃取（MSPDE）;超临界液体萃取（SFE）;免疫亲和色谱技术（IAC）;分子印记技术（MIT）;凝胶渗透色谱（GPC）,5.测定技术 仪器分析，化学分析，生化分析（免疫分析）定性、定量、在线监测,仪器检测技术,痕量无机物定量,无机元素形态分析,气相色谱或液相色谱电感耦合等离子体质谱联用,电感耦合等离子体质谱(ICP-MS）,原子发射光谱（AES）,原子吸收光谱（AAS）,毛细管电泳质谱（CE-MS）,气相色谱串联质谱(GC-MS/MS),色谱,液相色谱,气相色谱,高选择性 分离单组份定性定量 高效能高灵敏度 检出限量低至10-1l g的物质，适于微量和痕量分析。,色谱法的特点,A.色谱检测技术,气相色谱分析,系统构成 气路系统，进样系统，分离系统，检测系统工作原理 样品高温瞬间汽化-色谱柱分离-检测适用 易挥发的小分子有机物 难挥发性成分经衍生化检测,气相色谱-分离系统,色谱柱 填充柱，毛细管柱色谱柱选择：按样品极性 弱极性样品，可选OV-1，SE-30，OV-101，SE-52，SE-54 中极性样品，可选OV-17，OV-1701，XE-60，OV-225，OV-210 极性样品，可选PEG-20M,FFAP,OV-275,DEGS,气相色谱-检测系统,氢火焰离子化检测器（FID）：破坏型 含碳的有机物电子捕获检测器（ECD）：非破坏型，选择性 电负性强的化合物火焰光度检测器（FPD）：破坏型，选择性 含硫磷的化合物热导池检测器（TCD）：非破坏型，选择性 永久性气体,气相色谱分离与质谱定性定量结合1.对食品中残留物进行分析 MS是一个通用型检测器，对大多数有机化合物都有比较好的响应，根据特征离子强度定量多种成分的同时分析-残留分析的趋势之一 适合大批量农残检测。2.对未知物分析 准确测定未知组分的相对分子质量。,气相色谱与质谱的联用分析,食品中42种农药的气相色谱-质谱选择离子测定 样品处理方法 液液萃取-固相萃取联用：样品中农药经二氯甲烷提取后，Envi-Carb柱和Sep-Pak-NH2柱双柱净化，净化后直接进样分析 色谱条件 色谱柱:HP-5MS(30 m 0.125 mm 0.125m);载气:高纯氦气,流量1 ml/min;柱温:70,保持2 min,以25/min升至150,再以3/min升至200,再以8/min升至260,保持10 min;进样口温度:250;进样方式:不分流进样,1.15 min后打开分流阀和隔垫吹扫。质谱条件 离子源(EI)温度:230,电子轰击能量70 ev,GC-MS接口温度:280。,分析特征量 42中农药的线性范围:0.0011.0g/mL 样品的加标回收率：89%-94%,RSD 10%方法的最低检出限：0.0010.005 mg/kg(S/N=3)检测农药种类 有机磷、拟除虫菊酯、有机氯、氨基甲酸酯和除草剂 检测的样品种类 肉类，蛋类，乳品，蔬菜和水果,高压液相色谱法,高效液相色谱仪的应用,分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。氨基甲酸酯类农药；敌敌畏、辛硫磷极性农药，如多菌灵、磺酰尿类农药；苏丹红；三聚氰胺；,液质联用HLPC-MS-MS,以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在液相色谱部分分离，经质谱离子化，质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。色谱和质谱优势结合，应用广泛。,适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化 合物的分析。适于复杂基质样品,特别是农产品，生物样品中的农兽药残留的定性定量分析。利于多组分分析。,样品前处理 液液萃取-固相萃取：样品经过乙腈和二氯甲烷提取后，过C18固相萃取柱净化色谱条件 色谱柱:Agilent SB-C18,211 mm 10 mm,1.18m;柱温:50;进样量:20L;流动相A:0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸铵;流动相B:乙腈;流速:0.13 mL/min;梯度洗脱条件:04 min,A由99%变化至50%,415 min,A 由50%变化至 40%,1520 min,A由40%变化至20%,2025min,A 由20%变化至1%,2530 min,A保持1%,3035 min,A 由1%变化至99%后运行8 min,液相色谱-质谱联用对复杂食品基质中407种多农药残留量的测定,质谱条件 电离源模式:电喷雾离子化 电离源极性:正模式 雾化气:氮气 雾化气压力:2.18 105 离子喷雾电压:4000 V 干燥气温度:350 分析特征量 407种农药的线性范围为0.5500g/L，RSD 10%检测目标有害物 多效唑，乙草胺等407种农药检测的样品 苹果、蜂蜜、谷物和肉类,电泳技术和现代微柱分离相结合的分析技术高分辨率，高速度，样品用量少，成本低非常适合水溶性或醇溶性成分的多组分分离分析 应用领域 化学，生命科学，临床医学和药学，特别是 药物分析和分离方面得到广泛 的应用。目前在食品中功能成分 的分析和添加剂的检测等方面 有广泛的应用,高效毛细管电泳色谱,样品前处理 C18固相萃柱富集净化色谱方法 毛细管柱：熔融石英毛细管有效长度75 cm，内径75 um 缓冲液：50 mMNaAc/HAc+10%ACN，pH 5.0 分离电压：20 KV 检测波长：254 nm,高效毛细管电泳色谱-分析实例1,固相萃取和毛细管区带电泳法测定磺酰脲除草剂,分析特征量 线性范围：0.2-50 mg L-1，最低检测限：0.05-0.10 mg L-1 样品添加回收率：65-103，RSD 5%检测的目标物 醚磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、噻磺隆、甲磺隆和绿磺隆检测的样品 饮用水,高效毛细管电泳色谱-分析实例1,CE与MS相结合可为复杂的生化、环境等样品的定性、定量分析提供强有力的工具M.Hugener 等采用CEC-ESI-MS 对食品中的色素和芳香葡萄糖苷酸进行分析Gucek 等采用毛细管电色谱-电喷雾质谱(CEC-ESI-MS)对肽的混合物进行分析,检测灵敏度可达到阿摩尔(attomole)级。,毛细管电泳色谱质谱联用技术,电感耦合等离子体质谱,上世纪80年代初建立的一种将等离子体与四级质谱仪相连接的分析仪器。,电感磁场与氦气作用产生高达7000K的高温等离子体,基本上能使所有元素电离成单电荷的离子,然后进入质谱仪,定性和定量检测各种一定质荷比的离子,灵敏度高，一般检出限可达ppb级线性范围宽,一般浓度范围跨越五个数量级选择性高,元素之间测定相互干扰少操作快速,并能进行多元素分析有同位素信息在一定质量数范围内,仪器能提供稳定均匀的响应。,电感耦合等离子体质谱,主要特点,其他类串联质谱检测新技术,全二维气相色谱/飞行时间质谱,全二维气相色谱飞行时间质谱仪把分离机理不同而又互相独立的两根色谱柱通过一个调制器,以串联方式结合成二维气相色谱。,优点,提供更高的峰容量组分的分离和检测灵敏度提高。采用适当的色谱操作条件，可以得到包含结构信息的二维结构谱图，辅助定性,超高效液相色谱/飞行时间质谱 UPLC采用了1.7 m 的小粒径色谱柱填料,与传统的HPLC相比有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度(pgfg级)。,其他类串联质谱检测新技术,高分辨飞行时间质谱能够测定化合物的精确质量，并具有MS/MS功能，两者联用成为复杂体系分离分析以及化合物结构鉴定的良好平台。,免疫分析技术,原理 基于抗原、抗体的特异性识别和结合反应的分析方法，通过对抗原或抗体进行标记(酶、荧光物质、放射性同位素标记等)，利用标记物的信号放大作用,与现代测试技术相结合，对样品中特定的目标物进行定性定量检测。方法建立：半抗原合成 人工抗原合成 抗体制备 方法建立 样本前处理方法 方法评价特点 特异性强、灵敏度高 方便快捷、分析容量大、检测成本低 可提供系列化的产品以及技术，产品可以商业化。,免疫分析检测技术,应用：农药：有机磷、拟除虫菊酯类、有机氯类、氨基甲酸酯类兽药类生物毒素致病菌。,（二）.农残分析基本步骤,样本采集,测定,制备,贮藏,净化,确证,提取,浓缩,采样在大量产品（分析对象中）抽取有 一定代表性样品，供分析化验用，这项工作叫采样。,样品的采集1、样品的采集,正确采样的意义 尽管一系列检验工作非常精密、准确，但如果采取的样品不足以代表全部物料的组成成分，则其检验结果也将毫无价值，甚至得出错误结论，造成重大经济损失以至误伤人命，酿成大祸。,正确采样的原则,（1）采集的样品要均匀、有代表性，能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。（2）采样方法要与分析目的一致。（3）采样过程要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散（如水分、气味、挥发性酸等）。（4）防止带入杂质或污染。（5）采样方法要尽量简单，处理装置尺寸适当。,2、样品的分类检样由整批食物的各个部分采取的少量样 品，称为检样。检样的量按产品标准的 规定。原始样品把许多份检样综合在一起称为原始 样品。平均样品原始样品经过处理再抽取其中一 部分作检验用者称为平均样品。应一式三份,分别供检验、复验及备查使用。每份样品数量一般不少于0.5公斤。,3、采样的一般方法,第一种采集方法是随机抽样。均衡地、不加选择地从全部产品的各个部分取样。但随机随意。随机要保证所有物料各个部分被抽 到的可能性均等。具体作法：,（1）掷骰子简便易行，适于生产现场用。,（2）用随机表。（3）用计算器、计算机。（4）用抽奖机。第二种采集方法是代表性抽样：可按不同生产日期也可在流水线上按一定的时间间隔抽样按分析的目的取样,如：粘稠不好混匀的液体，从包装内上、中、下分别取样。蔬菜的营养成分（全菜）要从茎、枝、叶分别取，粉碎后，混匀。测鱼头部分的成分就只取鱼头。总之要根据测定的目的而定采样方法。,4.蔬菜样品采集,块根类和块茎类蔬菜 采集块根或块茎，用毛刷和干布去除泥土及其他黏附物。样本采集量至少为6个12个个体，且不少于3kg。代表种类有：马铃薯、萝卜、胡萝卜、芜菁、甘薯、山药、甜菜、块根芹。鳞茎类蔬菜 韭菜和大葱：去除泥土、根和其他黏附物；鳞茎、干洋葱头和大蒜：去除根部和老皮。样本采集量至少为12个24个个体，且不少于3kg。代表种类有：大蒜、洋葱、韭菜、葱。,叶类蔬菜 去掉明显腐烂和萎蔫部分的茎叶。菜花和花椰菜分析花序和茎。采集样本量至少为4个12个个体，不少于3kg。代表种类：菠菜、甘蓝、大白菜、莴苣、甜菜叶、花椰菜、萝卜叶、菊苣。茎菜类蔬菜 去掉明显腐烂和萎蔫部分的可食茎、嫩芽。大黄：只取茎部。采集样本量至少为12个个体，且不少于2kg。代表种类有：芹菜、朝鲜蓟、菊苣、大黄等。,豆菜类蔬菜 取豆荚或籽粒。采集样本量鲜豆（荚）不少于2kg，干样不少于1kg。代表种类有：蚕豆、菜豆、大豆、绿豆、豌豆、云豆、利马豆。果菜类（果皮可食）除去果梗后的整个果实。采集样本量为6个12个个体，不少于3kg。代表种类有：黄瓜、胡椒、茄子、西葫芦、西红柿、黄秋葵。,果菜类（果皮不可食）除去果梗后的整个果实，测定时果皮与果肉分别测定。采集样本量为4个6个个体。代表种类：哈密瓜、南瓜、甜瓜、西瓜、冬瓜。食用菌类蔬菜 取整个子实体。至少12个个体，不少于1kg。代表种类有：香菇、草菇、口蘑、双孢蘑菇、大肥菇、木耳等。,4、样品的制备,样品的制备指对样品的粉碎、混匀、缩分等过程。四分法：,样品的制备方法因产品类型不同而异,液体、浆体或悬浮液体 摇匀，充分搅拌。互不相容的液体（如油与水的混合物）先分离，再分别取样。固体样品 切细、粉碎、捣碎、研磨等。罐头 除核、去骨、去调味品、捣碎。,B.样品的制备,小体积蔬菜和水果均匀混合后，按四分法缩分，用组织捣碎机或匀浆器处理后取250g500g保存待测。大体积蔬菜和水果切碎后，按四分法缩分，取600g800g保存待测。冷冻样品冷冻状态下破碎后进行缩分。如需解冻处理，须立即测定。,（三）样品的检测方法：,方法评价指标；经典方法介绍；NY/T 761-2008;,*空白样品中加入一定浓度某一农药（C1）后，其样品中此农药浓度测定值（C2）对加入值的百分率（F)。F=C2/C1*100%添加回收率旨在衡量测定值与真值之间的误差，是制定农残分析方法准确度和可行性的指标；一般以MRL值水平高一个数量级、低一个数量级作为三个浓度水平进行添加实验，测定添加回收率；可以单个农药添加做单残留添加回收率，也可多个农药同时添加，为多残留添加回收率；单残留回收率：80120%，多残留回收率一般在70130%。,A.添加回收率（Fortified Recovery）,1、方法的评价指标,B.变异系数（Coefficient of Variation),衡量回收率偏差程度，判定农残分析方法的精密度（重现性）指标。变异系数=标准偏差/平均回收率*100%样品添加浓度水平低，变异系数范围亦大。一般20%,C.检出限（Limit of Detection，LOD）,衡量仪器或方法灵敏度的指标。要低于测定目标物的MRL值（最好低一个数量级）。分为仪器检出限和方法检出限。,（1).仪器检出限,*在与样品测定完全相同的条件下，某种分析仪器能够检出分析目的物的最小量（在无基质存在下）。最低检出限（LOD):在色谱图上可清楚确认的分析目的物色谱峰的下限。通常为噪音3倍（S/N=3）。最低定量限（LOQ):在色谱图上可清楚定量分析目的物色谱峰值的下限。通常为噪音10倍（S/N=10）。用某分析目的物最低浓度标样测定。Agelint仪器化学工作站可以测定S/N。如-BHC为0.01ppm，S/N=30，则LOD=0.001ppm LOQ=0.003ppm,（2).方法检出限,*在与样品测定完全相同的条件下，某种方法能够检出分析目的物的最低量或浓度（在有基质存在下）。最低检出限（LOD）：S/N=3最低定量限（LOQ）：S/N=10用添加某分析目的物最低浓度水平的样品，经过该方法的全部操作程序测定某S/N。如-BHC在韭菜中，CDFA方法添加0.01ppm水平，6890-ECD进仪器浓度为0.01ppm,S/N=12,LOD=0.0025ppm,LOQ=0.008ppm。,农残分析方法认证指标,准确度（Accuracy)-真值、回收率精密度（Precision)-可变性、变异系数灵敏度（sensitivity)-灵敏度、检出限、定量限线性范围（Linearity)-标准曲线（五个不同浓度，覆盖三个数量级）,质量保证和质量控制（QA/QC）,溶剂空白实验（Solvent Blanks）本底空白实验（Matrix Blanks）农药标样（溶剂中，本底中）,2、目前各国涉及的多残留检测方法,为了配合实施肯定列表制度，日本2005年由厚生劳动省组织、编制了食品中残留农药、饲料添加剂及兽药检测方法共包括对545种农药184种检测方法在184种检测方法中，有关蔬菜农残检测方法有98个。,单残留方法有80种，涉及农药80种多残留方法（GC）有17种，涉及农药119种多残留方法：285种农药GC/MS：223种农药LC/MS：62种农药,日本厚生劳动省食品中农用化学品残留检测方法 农药种类和个数：有机磷、有机氯、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药等共223种使用仪器：GC/MS,GC/MS农用化学品同时检测方法（农产品）,20g样品，加入50 mL乙腈，均质后，抽滤,石墨碳/酰胺丙基甲硅烷基化硅胶,加入10g氯化钠和20mL 0.5mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，振摇10min，静置,过滤，40水浴浓缩后,加入10mL丙酮,40浓缩至1mL,加入20mL乙腈，均质后，抽滤,乙腈+甲苯(31),40浓缩至1mL,丙酮正己烷(11)溶解残留物，准确至1mL,分取乙腈层20mL,10mL预淋,20mL洗脱,前处理过程,收取滤纸上残留物,合并滤液,加入乙腈准确至100mL,水层弃去,乙腈层加入无水硫酸钠,再加入5mL丙酮,40浓缩去溶剂,2mL乙腈+甲苯(31)溶解残留物,GC/MS,日本厚生劳动省食品中农用化学品残留检测方法 农药种类：杀虫剂，杀菌剂和除草剂等共38种使用仪器：LC/MS或LC/MS/MS,LC/MS农用化学品同时检测方法（农产品）,20g样品，加入50 mL乙腈，均质后，抽滤,石墨碳/酰胺丙基甲硅烷基化硅胶,加入10g氯化钠和20mL0.5mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，振摇10min，静置,过滤，40水浴浓缩后,加入10mL丙酮,40浓缩至1mL,加入20mL乙腈，均质后，抽滤,乙腈+甲苯(31),40浓缩至1mL,甲醇溶解残留物，准确至4mL,分取乙腈层20mL,10mL预淋,20mL洗脱,前处理过程,收取滤纸上残留物,合并滤液,加入乙腈准确至100mL,水层弃去,乙腈层加入无水硫酸钠,再加入5mL丙酮,40浓缩去溶剂,2mL乙腈+甲苯(31)溶解残留物,LC/MS或LC/MS/MS,日本厚生劳动省食品中农用化学品残留检测方法 农药种类：杀虫剂，杀菌剂和除草剂等共24种使用仪器：LC/MS或LC/MS/MS,LC/MS农用化学品同时检测方法（农产品）,20g样品，加入50 mL乙腈，均质后，抽滤,硅胶小柱(500mg),加入10g氯化钠和20mL0.5mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，振摇10min，静置,过滤，40水浴浓缩后,加入20mL乙腈，均质后，抽滤,加入10mL丙酮三乙醇胺正己烷(200.580)，舍弃流出液,甲醇溶解残留物，准确至4mL,分取乙腈层20mL,5mL甲醇,5mL丙酮和10mL正己烷预淋,收取滤纸上残留物,合并滤液,加入乙腈准确至100mL,水层弃去,乙腈层加入无水硫酸钠,20mL丙酮甲醇(11),40浓缩,2mL丙酮三乙醇胺正己烷(200.580)溶解残留物,LC/MS或LC/MS/MS,前处理过程,美国农业部农业研究服务中心 农药种类和个数：有机磷，有机氯，氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药等共229种使用仪器GC/MS或LC/MS/MS,QUECHERS Method,15g样品加15mL乙腈（含1%乙酸）,3450r/m离心1min,3450r/m离心1min,加入内标物，6g无水硫酸镁和1.5g 醋酸钠,前处理过程,取1mL上层液,加入50mg PSA,50mg C18和150mg无水硫酸镁,取上层液,LC/MS/MS,GC/MS,稀释后,加保护剂后,剧烈振摇1min,混合20s,检测农药种类500种与肯定列表中蔬菜440种农药比较肯定列表中248种农药不包括在标准内,GB/T 19648-2006,20g,加入40 mL乙腈15000r/m匀浆1 min加入5g氯化钠，再匀浆1min,2cm无水硫酸钠加于Envi-Carb和Sep-Pak氨丙基串接柱上,Envi-18,40水浴浓缩至1mL,3次2mL洗样液瓶,2次5mL正己烷溶剂交换,分取乙腈层20mL,3000r/m离心5min,乙腈+甲苯(31),40水浴浓缩至0.5mL,样液约为1mL后加入内标,氮气吹干,GC/MS,LC/MS/MS,乙腈水(32)定容1mL,A,B,C,D组农药(383种),E组农药（63种）,4mL预淋,25mL洗脱,前处理过程,蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留检测方法 农药种类和个数：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药等共104种使用仪器：GC、HPLC,3、NY/T 761-2008,方法特点,乙腈作为提取溶剂的多残留检测方法；采用固相萃取代替传统的液一液萃取，用氮吹仪代替旋转蒸发仪，大大简化了样品前处理步骤；采用双柱（DB-1，DB-17）、双检测器（有机磷-火焰光度；有机氯、菊酯-电子捕获；氨基甲酸酯-C8、或C18柱，柱后衍生化，荧光）同时定性定量代替单柱，单检测器分析；,添加回收率及最低检出限实验,104种农药在八种代表性的蔬菜、水果（番茄、菜豆、黄瓜、油菜、甘蓝、韭菜、苹果、柑桔）；3个浓度水平，每个浓度水平3个平行样；辽宁、北京、云南、河北、广西、山东、湖北7个农业环境监测站对该方法进行了系统地方法验证实验；,新增农药品种：,28种有机磷农药：百治磷，乙拌磷，嘧啶磷，灭菌磷，三唑磷，灭线磷，地虫硫磷，溴硫磷，乙基溴硫磷，丙溴磷，吡菌磷，蝇毒磷，治螟磷，特丁硫磷，久效磷，除线磷，皮蝇磷，甲基硫环磷，伐灭磷，益棉磷，二溴磷，速灭磷，地毒磷，水胺硫磷，杀虫畏，硫环磷，苯硫磷，保棉磷；19种有机氯及拟除虫菊酯农药：西玛津，莠去津，七氯，艾氏剂，腐霉利，联苯菊酯，顺式氯菊酯，氟氯氰菊酯，氟胺氰菊酯，敌稗，硫丹，氟氰戊菊酯，六氯苯，丁草胺，狄氏剂，异狄氏剂，乙酯杀螨醇，胺菊酯，氯氰菊酯；2种氨基甲酸酯农药：速灭威，仲丁威。,前处理：,添加回收率及最低检出限实验,105种农药在八种代表性的蔬菜、水果（番茄、菜豆、黄瓜、油菜、甘蓝、韭菜、苹果、柑桔）；3个浓度水平，每个浓度水平3个平行样；辽宁、北京、云南、河北、广西、山东、湖北7个农业环境监测站对该方法进行了系统地方法验证实验；,方法的添加回收率在70%120%之间，变异系数小于20%；方法检出限在0.0001 mg/kg 0.3 mg/kg 之间；取得了近200000个数据。,技术指标,G.样品确证,1996年，IUPAC规定指出“鉴定或确认方法必须尽量提供待测物的化学结构”，如果单一技术不能提供结构信息，或缺乏充分的“唯一性”，则需要由数种适合的技术，包括样品净化、色谱分离、波谱鉴定，其中色质联用法为首选方法。,色质联机的作用,分离混合物对各组分进行定性分析对各组分进行定量分析,解决重叠组分的定性、定量问题,GC-MS/MS分析方法的建立,将标准样品用GC-MS(全扫描方式)分析,被检测农药可以很好地分离。对混合标准样品分别用电子轰击电离（EI）和化学电离（CI）方式进行质谱分析。将待测 农药按保留时间分配到不同时间段中.对所分析农药选择母离子。尽量选择其中质量数大、相对丰度高的离子作为母离子。优化GC-MS/MS参数。,4.检测中常见问题及解决办法,1.样品或仪器污染2.鬼峰或分叉峰 4.何时需要更换隔垫或衬管 5.基线噪音过高,问题汇总,前处理,标样,仪器,数据处理,导致的结果偏差,考核样品空白效果图茄子,考核样品空白图西葫芦,返回,前处理净化效果不够理想,目标峰被杂质峰掩盖,标样的问题,甲胺磷和氧乐果由于标样响应不好导致样品检测结果谝大,仪器状态不好基线漂移,基线漂移,仪器状态不好基线漂移,仪器状态基线噪音过大,基线噪音偏大影响结果的准确性,积分偏差,三氟氯氰菊酯,杂质,返回,三、检测过程应注意的几个问题,（一）农药理化性质的影响水溶性挥发性稳定性本底效应分离难度,水溶性,甲胺磷 水中溶解度2kg/l久效磷 水中溶解度1kg/kg敌敌畏 水中溶解度10g/l对硫磷 水中溶解度24mg/l毒死蜱 水中溶解度2mg/l,挥发性,饱和蒸气压越大，挥发性越大毒死蜱 25蒸气压2.5mPa对硫磷 20蒸气压5.0mPa甲胺磷 30蒸气压 40mPa敌敌畏 20蒸气压1.6Pa,稳定性,甲拌磷、辛硫磷、三氯杀螨醇等农药稳定性差，易氧化、加热易分解,基质效应,甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果 基质效应较明显,分离难度,对硫磷、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷；甲氰菊酯和联苯菊酯在某些型号柱子上难以分开，需用双柱或质谱定性,仪器设备因素,完备的仪器及前处理设备选择合适的检测器合适的进样方式良好的仪器状态,质量控制,确立合适的质量控制样品正确分析应用质控结果,三、实验室质量控制,实验室内质控自我控制发现随机误差和新出现的系统误差评价分析质量的稳定性是分析的基础、必需、常规,实验室间质控外部质控发现系统误差和实验室间数据的可比性评价实验室的测试系统和分析能力有效的校核是参加与标准实验室的比对,质控的评判：标准值不确定度 两个样品中有一个不确定度不合格即判为不合格；两个样品的不确定度合格即判为考核合格。质控的评判：标准值不确定度+Z分值 Z分值作为判定标准。Z分值不合格即判为不合格。不确定度不合格但Z分值合格也合格。Z分值：Z2（合格）满意 2Z3 基本满意 Z3 不合格,实验室间的质量控制,实验室内部质量控制,灵敏度 意义：痕量分析中检测的样品含量几乎与零管在同一数量级；反映分析实验室和测试系统的本底和基础；反映实验室及分析人员的水平。,实验室内部质量控制,灵敏度判断方法每次测2份全程序空白平行样，共测6天，计算检测限。式中：X为各个空白测试值，B为每天n个空白 测试值之和，t0.05 为t值表中单侧概率为0.05，自由度为f f=m（n-1）的值。结果判定：检测限L应等于或略小于方法规定的检测限。,实验室内部质量控制,精密度：1.批间精密度做10次独立检测，每次2-3个浓度(双平行）计算每个浓度10次共20个结果的均值、标准差和变异系数2.批内精密度一次检测2-3个浓度的样品，每个浓度做15个平行样计算两个浓度的均值、标准差和变异系数,实验室内部质量控制（5）,加标回收率 随机抽取1020%的样品进行加标回收测定.回收率的意义：1.绘制回收率质控图2.结果不得超过方法规定的范围3.通常允许范围80-120%回收率具有局限性：1.样品中某西些干扰因素对检测结果具有恒定偏差2.样品和加标样操作相同，损失与污染对二者也相同，使误差相互抵消而难以发现问题3.待测物的价态和形态、加标量多少、本底浓度均影响结果,实验室内部质量控制（6）,标准曲线的绘制、检验和回归意义：1.反映方法的精密度和灵敏度；2.分析仪器的精密度；3.量取标准溶液量具的准确度；4.分析人员的操作水平；评价标准曲线：1.相关系数|r|0.999；2.0管和300管的光密度差值应达到0.8；3.任取标准曲线的2点代入方程，其理论值和拟合值的相对偏差5%。注意：1.线性不好情况下，用数理统计的方法拟合回归曲线，回引入无法消除的系统误差；2.回归方程仅限于估算检测范围内的变量，而不能随意外推。,实验室内部质量控制（7）,平行双样测定意义：1.减少随机误差；2.对同批测定的精密度进行估计。结果判断：1.常规批量分析中，应随机抽取样品总量的10-20%做平行测定2.分光光度法痕量检测，平行双样相对偏差不大于10%，最好是5%；3.平行双样测定值的相对偏差不得大于标准方法规定的2 倍；同批检测或一段时间累计检测平行双样合格率大于95%。,实验室内部质量控制,标准物质的对照分析意义：1.标准物质作为一个相对真值，其量值传递为不同时间、地点的测试结果提供了可靠的参考；2.分析人员对分析质量进行判断（特别是准确度），查找系统误差，寻求改进；3.供实验人员练兵之用，提高技术素质。注意：在实验室分析系统有良好的精密度的基础上使用标准物质，才能获得预期的效果。,标准物质的应用,用于实验室的内部控制用于实验室间的质量控制（外部质量评价）用于评价检测方法的准确度实施合作项目时使用标准物质用于评价和仲裁用于制备实验室的内质控样品,使用标准物质是发现系统误差的有效方法,使用标准物质是发现系统误差的有效方法,使用标准物质发现随机误差改进检测质量,200,210,220,190,180,1次,2次,3次,4次,5次,7,8,9,10,6次,检测结果,实验室内部质量控制,内质控图制备内质控样品（1）直接用标准物质（2）实验室自己制备内质控样品,收集样品,初筛,低,中,高,混匀分装,-20。C储存,（1）随机从全部制备的内质控样品中抽取约5%的样品（2）按程序检测这些样品（3）结果的变异系数应小于10%，最好为5%以内（标准物质）定值（1）每天检测一次（单次或平行），共检测20天（2）计算均值和2SD，3SD（3）绘制质控图,均匀性检验,如何使用质控样品,（1）批质控样品（2）由监督人员使用的盲样（3）将质控样品检测结果标在质控图中,标准曲线,QC,样品,QC,样品,QC,（1）如果3个浓度的质控样（平行样的均值）中均在2S范围，接受此批结果。（2）如果3个浓度的质控样（平行样的均值）中有一个在2S之外，下列规则中任何一条成立则判断为失控而拒绝结果：其中一个浓度的样品（平行样的均值）超出3S界限三个浓度中有两个（平行样的均值）超出2S界限，并均值的同侧三个浓度中有两个（平行样的均值）超出2S界限，并分布在均值的两侧某一个浓度的质控样品，累计连续9次结果在均值的同侧,接受和拒绝检测结果的规则,失控原因的分析,实验室有无新的变化如仪器和试剂,有,无,针对性检查这些变化对检测的影响,重测同一质控样品开一瓶新的质控重测,重测,原因找到了,没找到,检查仪器状态和试剂是否过期,内质控数据的管理,每月处理当月的内质控数据每月归档保存内质控数据每月分析内质控情况并写报告定期评价内质控数据并更新质控图,