离心技术专题讲座PPT.ppt

离心技术,1,离 心 技 术,离心是利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作技术。,2,主 要 内 容,离心的基本原理离心设备的分类离心机的选择离心技术应用实例,3,一、离心的基本原理,利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮力密度差的物质分离开。,4,离心力,离心力（F）：当离心机转子以一定的角速度（弧度/秒）旋转，颗粒的旋转半径为r（厘米）时，颗粒所受的向外的力即离心力。,5,:旋转角速度 r：旋转体离旋转轴的距离,相对离心力（RCF）：又称分离因数，是衡量离心程度的参数，是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/秒2）。RCF=2r/980=42n2r/3600*980=1.119*10-5n2r,低速离心时常以每分钟的转数rpm（即n）来作为离心力单位；而高速离心则以g表示。,相对离心力,n：转子每分钟的转数（rpm）,6,Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图,半径,相对离心力,转数,7,沉降系数 Sedimentation coefficient(S),离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，离心沉降的速度v其中S即为沉降系数。S表示单位离心场中粒子的移动速度。r1:离心前粒子距离转轴的距离 r2:离心后粒子距离转轴的距离,8,S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。,9,样品颗粒的大小 形状 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度,沉降系数,蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。,10,11,沉降速度 sedimentation velocity,(1)定义：指在强大的离心作用下，单位时间内物质运动的距离。,r：球形粒子的半径 d：球形粒子的直径：流体介质的粘度 p：粒子的密度m：介质的密度,12,p-m=0 即p=m V=0 S=0 粒子平衡,p-m0 即pm V0 S0 粒子沉降,p-m0 即pm V0 S0 粒子逆着离心方向上浮,13,沉降时间(Sedimentation Time,Ts),公式变换得,上式积分得,X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离;X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离；Ts以小时为单位,S以Svedberg为单位。,14,二、离心设备分类,离心机,转子,主机,附件,15,分类标准多种多样：（一）根据转速分类：低速、高速、超速,16,1.低速离心机(2000-6000rpm)转子 电动机 转子带有放置离心管的孔转子的中央位于离心机的驱动轴上离心机的转速和温度控制不够准确 一般最高转速在6,000rpm以下实验室中常用于分离制备。,17,2.高速离心机(10000-26000rpm)制冷设备温度控制在0-4范围内 制动器（刹车）实际速度和温度可通过仪表显示 配有一定类型及规格的转子 最高转速在26,000rpm以下 常用于生物大分子的分离制备,18,3.超速离心机 驱动和速度控制 温度控制 真空系统 转子,常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。,19,20,（二）.根据转子形式分类(Rotor)固定角式转子(fixed-angle rotor)水平转子(swing-out rotor)垂直转子(vertical rotor)带状转子(zonal rotor)连续转子(continuous rotor),转子的材质：,铝质 较轻,耐受强度较弱,适合在较低 的转速下使用;不锈钢 耐受强度最好,但材质本身太重；钛合金 耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。,21,22,常见的角度 20 28 34 40,1.固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。,沉降界面,沉淀,23,24,25,角式转子的特点：（1）重心低,转速可较高；（2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于 离心管的直径;（3）“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到 离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形 成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉 淀较紧密。,设40000rpm时R1最小、3.8cmR2平均、5.9cmR3最大、8.1cmRCF值分别67,910g 105,400g144,700g,26,在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同,R1,R2,R3,27,2.水平转子（1）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行,（2）转子旋转加速时,离心管中心线由平 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90角,（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致，有少量的“管壁效应”。,水平转子的特点,（1）转子的重心位置较高,（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于管直径,（3）对于多种成分样品分离特别有效,（4）常用于速率区带离心和等密度离心,28,29,30,3.垂直转子 离心管垂直插入转子孔内,在离心过程中始终与旋转轴平行,而离心时液层发生90角的变化,从开始的水平方向改成垂直方向,当转子降速时,垂直分布的液层又逐渐趋向水平,待旋转停止后,液面又完全恢复成水平方向。,31,4、区带转头：,1、无离心管；由转子桶和可旋开的顶盖组成。,2、转子桶内装有十字形隔板，把桶内分隔成多个扇形小室，隔板内有导管；,3、区带转头的“管壁效应”极小，分离效果好，转速高，容量大，回收容易；,区带转头的样品及介质与转头直接接触，要求转子耐腐蚀，并且操作复杂。,特点：,缺点：,32,33,5、连续转头：,34,自动排出沉渣的离心澄清机,35,分批自动排出沉渣的离心澄清机,36,（三）根据用途分类：实验室或工厂、分析或制备,37,（四）根据离心形式分类：离心过滤：指在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程。离心沉降：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或离心管中进行悬浮液沉降的过程。离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分离不同比重的液体的过程。,38,（五）根据结构特点分类：转子形状：角式、外摆、管式、碟片式转轴位置：直立、水平、倾斜驱动方式：手摇、气动、磁悬、电动,39,操作方式：连续、半连续、间歇卸料方法：人工、重力、刮刀、振动、蠕动泵、喷嘴、螺旋等使用温度：冷冻和常温,40,三.离心分离方法,根据离心原理,按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分三类,离心分离法,平衡离心法,沉降平衡离心法,差速离心法,速率区带离心法,等密度离心法,41,42,1.平衡离心法 根据粒子大小、形状不同进行分离。差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法(rate zonal centrifugation)。,2.等密度离心法(isopynic centrifugation)又称等比重离心法,依粒子密度差进行分离,等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。,3.经典式沉降平衡离心法 用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。,43,(一).差速离心法1、原理 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。,差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。,2.注意点：可用角式、水平式转头可用刹车难以获得高纯度,44,例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞 500g,10分钟 沉淀 上清液(细胞核）10,000g,10分钟 沉淀 上清液(细胞膜碎片,线粒体,)100,000g,3小时 溶酶体 沉淀 上清液(核糖核蛋白体）(可溶性成份),45,(二).速率区带离心法1.原理 离心前离心管内先装入密度梯度介质,形成密度梯度，介质最大密度要小于所有样品颗粒的密度。样品铺放在梯度溶液表面，离心后不同大小、形状，有一定沉降系数差异的颗粒形成若干条界面清楚的不连续区带。,2.注意点：严格控制离心时间颗粒密度大于介质密度pm事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液不能用角式转头、只能用水平式转头不能用刹车,可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。,46,(三).等密度离心法1原理 预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后,梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。,特点：（1）与样品粒子的密度有关（2）与样品粒子的大小和其他参数无关（3）转速、温度不变,则延长离心时间也不改变这些粒子的成带位置。,47,2.注意点：离心时间要长可用角式转头或水平式转头粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用刹车,收集区带的方法：,用注射器和滴管由离心管上部吸出;,有针刺穿离心管底部滴出;,用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出;,用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集.,48,速度区带法与等密度离心法的比较,49,密度梯度离心操作步骤,1、梯度制备2、样品的装入和离心3、取出梯度4、梯度的分析,50,四.密度梯度溶液的制备,(一).梯度材料的选择原则:,1、与被分离的生物材料不发生反应。,2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和 pH变化较小。,3、不会对离心设备发生腐蚀作用。,4、容易纯化,价格便宜或容易回收。,5、浓度便于测定,如具有折光率。,6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性质,热力学性质应该是已知的。,51,52,常用的梯度材料：糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右糖酐、糖原 无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等 有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶胶:如Percoll。蛋白质:如牛血清白蛋白重水 非水溶性有机物:如氟代碳等,53,(二).梯度材料的应用范围 1.蔗糖:水溶性大 性质稳定 渗透压较高 最高密度可达1.33g/ml,价格低 容易制备,常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。,54,2.聚蔗糖:商品名Ficoll,渗透压低 粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用 以降低粘度 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细 胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞,55,3.氯化铯:离子性介质 水溶性大 最高密度可达1.91g/ml 重金属盐类,在离心时形成的梯度有较 好的分辨率 被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋 白的分离 价格较贵,56,4.卤化盐类:KBr和NaCl可用于脂蛋白分离KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐 NaI梯度可分离天然或变性的DNA。,57,5.Percoll:SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮渗透压低对生物材料的影响小颗粒稳定在冷却和冻融情况下还是稳定的 粘度高在酸性pH和高离子强度下不稳定用于细胞、细胞器和病毒的分离,离心机使用的注意事项,使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物。,离心管装液不可超过管容量的2/3，尤其是角转子。,在低温下离心时，转头需预冷。,离心过程中不得随意打开离心机盖。,每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。,58,普通制备离心机的选择（1）过滤式离心机（2）沉降式离心机（3）分离式离心机,五、离心机的选择,59,超速离心机的选择,估算离心力和离心时间超离心方法的选择转子、离心管的选择梯度、介质的选择,60,超速离心法,61,62,分析性超速离心机,椭圆形的转子一套真空系统一套光学系统,分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。,63,分析室：容量为1毫升,呈扇形排列在转子中。其有上下二个平面的石英窗,离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质,通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监视。,64,1.测定生物大分子的相对分子重量,3.分析生物大分子的构象变化,2.生物大分子的纯度估计,应用范围,65,内容回顾,离心的基本原理,离心力,相对离心力,沉降系数,沉降速度,沉降时间,离心设备的分类,转速：低速、中速、高速,转子：角转子、水平转子、垂直转子等,用途：实验室用、工厂用,离心形式：离心过滤、离心沉降、离心分离,66,离心分离法,差速离心法,速率区带离心法,等密度离心法,密度梯度溶液的制备,梯度溶液的选择原则,1、与被分离的生物材料不发生反应。,2、可达到要求的密度范围；,3、不会对离心设备发生腐蚀作用。,4、容易纯化,价格便宜或容易回收。,5、浓度便于测定,如具有折光率。,6、物理性质,热力学性质应该是已知的。,67,常用的梯度材料,蔗糖,聚蔗糖,氯化铯,硅溶胶,离心机使用的注意事项,平衡离心管和其内容物。,离心管装液不可超过管容量的2/3，尤其是角转子。,在温下离心时，转头需预冷。,离心过程中不得随意离开离心机盖。,转头不得过速使用。,68,谢谢！,69,