表达载体的构建【PPT】 .ppt
中国海洋大学 科学馆319,一 表达载体介绍二 构建表达载体的基本步骤三 载体构建具体范例四 构建表达载体注意事项,中国海洋大学 科学馆319,一 表达载体的介绍,1.载体的分类：1.1 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体,中国海洋大学 科学馆319,1.2 按功能分成：（1）克隆载体：通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，目的在缩主细胞内复制形成大量的基因克隆，被克隆的基因不表达。（2）表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）使目的基因能够表达的载体。是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。,中国海洋大学 科学馆319,二 构建表达载体的基本步骤,引物设计,目的基因(CDS区）的克隆,目的基因进行酶切,质粒进行酶切线性化，电泳，胶回收纯化,a遵循引物设计原则;b引物两端加入酶切位点；c保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS上，能够正确读码；,一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。,中国海洋大学 科学馆319,模板与线性化质粒连接,转化到大肠杆菌DH5,鉴 定（PCR,测序,酶切）,通过PCR选出阳性克隆，测序鉴定表达载体是否构建成功,将表达载体导入表达菌株,中国海洋大学 科学馆319,三 载体构建具体范例：,大菱鲆GHR基因构建入pEGFP载体中,中国海洋大学 科学馆319,1.GHR从大菱鲆cDNA模板中扩增,5非翻译区,3非翻译区,CDS区,初次PCR引物设计（外引物）,内引物,中国海洋大学 科学馆319,2.分析酶切GHR基因酶切位点,将GHR基因mRNA序列的CDS区（蛋白编码区）导入DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析：,中国海洋大学 科学馆319,3.引物的设计,引物直接在GHR编码区起始和末端设计,然后在引物5端加上相应的酶切位点。,特别注意：1.因为需要与GFP融合表达，所以下游引物要去掉终止密码子TGA2.不要改变GFP表达的编码框,Forward 5-ATGCCACTAAGCACAGCTG-3,GAATTC,CC,Reverse 5-TCAGTTCACAGAGTGGCA-3,CCGCGG,ACGC,中国海洋大学 科学馆319,4.GHR PCR 扩增，纯化，EcoRI和SacII酶切，纯化5.质粒提取纯化,EcoRI和SACII酶切线性化，低浓度琼糖电泳，胶回收纯化6.模板与线性化质粒连接7.转化感受态大肠杆菌8.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）,中国海洋大学 科学馆319,四 构建表达载体注意事项,1.尽可能除去无关的DNA序列 从而增加载体容量。2.选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达，融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。3.选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。4.在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密码子,中国海洋大学 科学馆319,3 对照的设立 为验证双酶切是否成功，可做如下对照：（1）酶切反应时加各单酶分别切两管，用同一种Buffer，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功。做转化时，也要进行对照：（2）即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功。（3）酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。（4）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。,中国海洋大学 科学馆319,使用时，直接删除本页！,精品课件，你值得拥有！,精品课件，你值得拥有！,中国海洋大学 科学馆319,使用时，直接删除本页！,精品课件，你值得拥有！,精品课件，你值得拥有！,中国海洋大学 科学馆319,谢 谢,
