T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的关系.doc

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1与胃癌细胞侵袭移行能力的关系文章来源 毕业论文网 毕业论文            作者：朱金明 余佩武 李翠芳 吴淼【摘要】  目的 检测胃癌细胞中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)的表达及其与肿瘤侵袭、移行能力的关系，同时观察胃癌细胞在形态学方面的变化。方法 采用层黏连蛋白黏附法，由胃癌MKN45细胞株(M0)中筛选获得高(MH)、低(ML)黏附亚株。应用流式细胞仪检测Tiam1在胃癌细胞中的表达，以Boyden小室法测定M0、ML、MH细胞的体外侵袭、移行能力，并分析其与Tiam1表达间的关系，同时采用苏木精伊红及细胞骨架蛋白染色、扫描电镜技术观察胃癌细胞形态。结果 MH细胞的体外侵袭、移行能力及Tiam1表达均强于M0、ML细胞(P<0.05)，且Tiam1表达与胃癌细胞体外侵袭、移行能力呈正相关(r=0.997和1.000)；同时与M0、ML相比，MH胞体伸展，表面突起增多，片状伪足宽厚，丝状伪足细长而密集，异型性明显，且细胞骨架结构较紊乱，斑点状肌动蛋白小体增多。但M0、ML细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Tiam1表达水平升高可能促进胃癌细胞侵袭、移行。这或许是通过调整胃癌细胞骨架结构重组，增强其变形、游走能力而实现的。 【关键词】  胃癌； T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1； 侵袭； 移行； 形态学Correlation between invasion and migration ability of gastric cancer cells and Tiam 1    【Abstract】  Objective  To investigate the expression of T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1 (Tiam1) in gastric cancer cells and its relationship with the invasion and migration ability of gastric cancer cells, and observe the morphological changes of gastric cancer cells. Methods  High adhesive subgroups (MH) and low adhesive subgroups (ML) were separated from MKN45 cell strain (M0) by laminin adhesion method in vitro. The expressions of Tiam1 in M0, ML and MH cells were detected by flow cytometry, the invasion and migration ability of M0, ML and MH cells in vitro by Boyden chamber. The correlation between invasion and migration ability of M0, ML, MH cells and expression of Tiam1 in M0, ML, MH cells was analyzed. The morphological differences among M0, ML and MH cells were observed by hematoxylin eosin stain, cytoskeletal protein stain and scanning electronic microscope. Results  The invasion and migration ability and the expression of Tiam1 in MH cells were higher than those in M0 and ML cells (P<0.05). The expression of Tiam1 was positively correlated with the invasion and migration ability of gastric cancer cells (r=0.997, 1.000). Compared with the M0 and ML cells, the MH cell bodies elongated with wide and thick lamellate pseudopodia, slender and intensive filamentous pseudopodia, more projections on the surface, derangement of cell skeleton and more dotlike actin bodies. There was no significant difference between M0 and ML cells (P>0.05). Conclusions  The high expression level of Tiam1 may promote the invasion and migration of gastric cancer cells through adjusting the cytoskeletal reconstruction and enhancing the deforming and migration ability of gastric cancer cells.    【Key words】  Gastric cancer;  T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1;  Invasion;  Migration;  Morphology    肿瘤细胞的侵袭转移与其运动能力密不可分，而有效迁移行为的达成又来源于细胞内、 外调节因子对细胞骨架动力装置所赋予的驱动力以及细胞骨架成分介导黏附所提供锚定力间的协调运作。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)正是作为重要的细胞骨架结构调节因子， 而与肿瘤侵袭转移密切相关1-3。本实验通过检测Tiam1蛋白在具有不同侵袭、 移行能力胃癌细胞中的表达， 初步探讨了Tiam1表达与胃癌细胞侵袭、移行的关系，并对其细胞形态学结构基础进行了简要分析。1  材料与方法11  主要试剂    层黏连蛋白、碘化丙啶、考马斯亮蓝R250为美国Sigma公司产品；Boyden小室为美国Millipore公司产品；Matrigel人工基质为美国B&D Biosciences公司产品；兔抗人/鼠Tiam1多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品；FITC标记山羊抗兔荧光2抗为北京中杉金桥公司产品。12  胃癌细胞高、低黏附亚株筛选    胃癌MKN45细胞株(M0)购自上海仁济医院上海市消化疾病研究所，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 饱和湿度、5% CO2条件下培养，其高(MH)、低(ML)黏附亚株系经“层黏连蛋白黏附法”筛选分离获得4。实验所用均为末次筛选所得ML、MH传代5次以内的细胞。13  胃癌细胞中Tiam1蛋白检测    取对数生长期经胰蛋白酶消化的M0、ML、MH细胞， 以4%多聚甲醛固定并洗涤、 离心(2000 r/min)后重悬，4 封闭与离心(1500 r/min)，加入1100稀释的兔抗人Tiam1抗体200 l。阴性对照组加入1100稀释的兔抗IgG，37 孵育并离心(1500 r/min)后，加入150稀释FITC标记的山羊抗兔2抗100 l， 室温避光孵育并离心(1500 r/min)、洗涤，200目尼龙网过滤后，重悬于0.5 ml流式细胞缓冲液中， 流式细胞仪488 nm波长下检测， Cellquest软件分析并作图。 每样本测定10 000个细胞，以荧光标记抗体阳性细胞百分率作为Tiam1蛋白表达的计量标准。14  胃癌细胞体外侵袭、移行能力检测    将对数生长期M0、ML、MH制成2.5×105个/ml的细胞悬液备用。(1)体外移行实验：将无Matrigel包被的Boyden小室置于24孔培养板内，在每1Boyden小室的下室中加入含趋化因子的条件培养液0.6 ml，上室加细胞悬液0.4 ml，常规培养12 h。(2)体外侵袭实验：将包被有Matrigel的Boyden小室置于24孔培养板内，在每1Boyden小室的下室中加入含趋化因子的条件培养液0.6 ml，上室加细胞悬液0.4 ml，常规培养72 h。以上实验结束后，取出小室并拭去滤膜上表面的未迁移细胞，苏木精伊红(HE)染色后高倍镜下计数穿透滤膜并黏附于下表面的细胞。15  胃癌细胞形态学观察    取对数生长期经胰蛋白酶消化的M0、ML和MH细胞，接种于预置有消毒盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴壁生长至玻片面积的60%80%时，取出盖玻片，分别进行HE染色、细胞骨架染色5和扫描电镜观察。16  统计学分析    应用SPSS 10.0统计软件，计量资料采用单因素方差分析，均数间差别多重比较的LSD检验，相关分析采用双变量间的Pearson检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果21  Tiam1在M0、ML、MH中的表达情况    M0、MH、ML细胞中Tiam1蛋白阳性表达率分别为(72.83±6.54)%、(56.17±9.06)%、(52.87±8.30)%， MH显著高于M0、ML， 差异有统计学意义(P<0.05)；但在M0与ML细胞两者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。22  M0、ML、MH体外侵袭、移行能力比较    MH细胞跨越Boyden小室滤膜网孔的体外移行能力及穿透包被有Matrigel基质的Boyden小室滤膜网孔的体外侵袭能力均高于M0、ML细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；但在M0和ML细胞间其体外移行及侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1  胃癌细胞体外侵袭移行能力比较(略)23  Tiam1蛋白表达与胃癌细胞体外侵袭、移行能力的相关性    相关分析结果显示，Tiam1蛋白表达强度与胃癌细胞M0、ML和MH的体外移行及体外侵袭能力均呈正相关(相关系数分别为r=0.997和1.000)。 24  M0、ML、MH的形态学差异    HE染色可见，M0、ML和MH细胞体均呈圆形、卵圆形，偶见多角形，大小不1，折光性强；细胞膜清晰、完整，核质比大；胞核界限清楚，可见1至多个核仁，核分裂相多见。总体上看，MH胞体较M0、ML胞体伸展，胞膜表面突起增多，异型性更明显，但M0与ML细胞两者间无明显差异(图1)。细胞骨架蛋白染色观察，各组胃癌细胞质内清晰可见骨架蛋白(微丝、微管和中间纤维)呈蓝色丝网状结构，近核侧较致密，相邻细胞间有骨架束彼此穿行。整体上看M0和ML细胞骨架结构分布类似，排列较规则，而MH细胞骨架结构略显紊乱，斑点状肌动蛋白小体、胞体突起及胞膜表面长丝状结构增多(图2)。扫描电镜下，胃癌细胞均呈大小不等的椭圆形或短梭形，但MH胞体表面突起较M0、ML细胞明显增多，片状伪足宽厚，丝状伪足细长而密集(图3)。3  讨论    Tiam1是Dbl(diffuse Bcell lymphoma oncogene family)家族成员，可作为小G蛋白Rho的特异性鸟苷酸转换因子，促使其向活化状态转变，进而调节细胞骨架结构重组与形体极化，促进细胞运动和迁移6。通常Tiam1除在人大脑和睾丸组织中表达外，在其他正常组织中不表达或仅呈低度表达。近年的研究表明，Tiam1在T/B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤细胞中呈阳性表达，且与其侵袭转移密切相关1-3。    我们的研究已证实Tiam1在胃癌组织中呈高表达，且与其侵袭转移等病理生物学行为密切相关7。本实验则借助“层黏连蛋白黏附法”，由人胃低分化管状腺癌来源的MKN45细胞株(M0)中，筛选获得起源相同但表型有异的高、低黏附亚株(MH和ML)4。经Boyden小室检测发现， MH细胞的体外侵袭、 移行能力均强于M0、 ML细胞(P<0.05)，但在M0、ML细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。经流式细胞仪检测发现，Tiam1蛋白在MH细胞中的表达也强于其在M0、ML细胞中的表达(P<0.05)，但在M0、ML细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。进1步的相关分析显示，Tiam1 蛋白表达水平与M0、ML、MH细胞的体外侵袭、移行能力成正相关。上述结果提示，Tiam1表达水平升高可能促进胃癌细胞侵袭、移行。    已知肿瘤细胞中常发生微管解聚、微丝束及其末端的膜黏着斑破坏，应力纤维网架结构紊乱，肌动蛋白聚集、重排，出现大量点状或短树根样的肌动蛋白小体，使胞体刚性降低，顺应性增强，易于在组织中变形、游走，且在高侵袭转移细胞的膜表面突起和伪足较多，更利于其运动与侵袭8-9。本实验中HE染色显示，MH细胞较M0、ML细胞异型性大，形态不规则更加明显。在扫描电镜下观察可见，MH细胞形体延展性好，胞膜表面突起或皱褶增多，片状伪足宽厚，丝状伪足长且密集。进1步经细胞骨架染色显示，MH细胞骨架结构较M0、ML细胞略显紊乱，肌动蛋白小体增多，使其形体顺应性增强，从而易于在组织中变形和游走。总之，所有这些胃癌细胞形态结构上的差异可能恰好反映了其侵袭、移行等生物学行为的不同。    近期研究显示，Tiam1既可通过调节整合素31介导的层黏连蛋白5分泌与沉积，进而影响角质形成细胞的形体延展与移行10，还可通过分子结构中PHnCCEx功能域与CD44V3单体耦联，介导肿瘤细胞与胞外基质成分透明质酸的结合，促进其侵袭、转移11。因此，有关Tiam1如何影响胃癌细胞侵袭移行及其形态学基础的相关机制，值得深入探讨。【参考文献】  1Minard ME, Kim LS, Price JE, et al. 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