芦笋皂苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对Caspase3,8,9酶活性的影响.doc

史上最快最全的网络稳定批量下载，尽在：芦笋皂苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及其对Caspase-3,8,9酶活性的影响季宇彬 许贺 汲晨锋 （哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心 哈尔滨 150076国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心 哈尔滨 150076）摘要：目的：本文研究芦笋皂苷对人肝癌HepG-2细胞的凋亡作用及其与Caspase8、Caspase9和Caspase-3酶活性的关系，以探讨芦笋皂苷诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制。方法：芦笋皂苷以不同浓度在不同时间下体外作用于人肝癌细胞HepG-2，利用MTT法测IC50、流式细胞仪AnnexinV/PI双标法分析细胞凋亡率、透射电镜观察肿瘤细细胞形态，并用比色法检测Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3酶活性变化。结果：芦笋皂苷对HepG-2细胞增殖有明显抑制作用，半数抑制浓度为101.15mg·L-1。给药72h后的肿瘤细胞的凋亡率随浓度的升高而增大。透射电镜下可明显观察到细胞出现凋亡特征形态。药物作用24h、48h后Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的相对活性分别随着药物浓度的升高而升高，且与阴性对照组比较有显著性差异（P<0.01）。其中作用24h后caspase-8和Caspase-9活性相对较高，作用48h后Caspase-3活性相对较高。结论：芦笋皂苷可以抑制Hepg-2肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制是通过激活上游的caspase-8和Caspase-9，导致下游的caspase-3激活最终诱导细胞凋亡的。关键词：芦笋皂苷；Hepg-2；细胞凋亡；机制Study on HepG-2 Apoptosis Induced by Saponins isolated from Asparagus and the Effects on the Activities of Caspase-3,8,9 Ji Yubin Xu He Ji Chenfeng (Center of Research on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, ChinaEngineering Research Center of Natural Anticancer Drugs , Ministry of Education, Harbin 150076,China)基金项目:国家自然科学基金项目(30400592);哈尔滨市后备带头人基金项目(2004AFXXJ030).作者简介:季宇彬,男,博士生导师,主要研究方向为抗肿瘤药物研究. E-mail: jichenfeng.Abstract: Objective: To study the effect of saponins of asparagus on apoptosis and the variations of Caspase8、Caspase-9 and Caspase-3 activity in the process of asparagus induced apoptosis in HepG-2,to investigate the apoptosis mechanism further. Methods: Asparagus on apoptosis effects on tumor cells cultured-HepG-2 with different concentrations at different time, IC50 value was measured by MTT assay、the apoptosis rate was determined by FCM with AnnexinV/PI staining、their apoptotic morphology are observed by electron microscopy and Colorimetric method was used to measure Caspase-8,9and Caspase-3 activities. Results: Experiments of antitumour in vivo show that saponins of asparagus can inhibit the growth of tumor cell of HepG-2 in evidence,IC50 is 101.15mg·L-1. Cultured for 72h, the apoptosis rate has positive increased with concentrations. Apoptotic morphology was observed by electron microscopy. The activities of Caspase-8、Caspase-9 and Caspase-3 has positive increased with concentrations. And have significant difference compared with negative control group (P<0.01). The activities of Caspase-8 is high at 24h,but the activities of Caspase-9 and Caspase-3 is high at 48h.Conculsion:Aaponins of asparagus can inhibit the growth of tumor cell of HepG2,and the underlying mechanism mightbe related to up regulation of Caspase-8,9 activity which subsequently transforms Caspase-3 into its active form.Key words: saponins of asparagus; HepG-2; cell apoptosis; mechanism1.引言芦笋(Asparagus officinalis Linn)为百合科天门冬属的多年生草本植物。芦笋具有很高的营养保健及药用价值。研究发现，芦笋活性成分具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老抗疲劳、降血脂、保肝解毒等特殊的生物学功能，而皂苷是其抗癌主要活性成分之一1-3。本实验采用现代生物技术，通过体外实验探讨了芦笋皂苷对人肺癌细胞HepG-2的诱导凋亡作用，并对其凋亡机制作初步探讨。2.材料2.1材料与试剂 阿霉素（山西泰盛制药有限公司）；RPMI 1640（Gibco）；胰酶Gibco；胎牛血清(FCS)（Hyclone）；MTT（Sigma）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司）；Caspase-3,8活性检测试剂盒（碧云天公司）；芦笋皂苷提取物。2.2细胞株 癌细胞HepG-2由哈尔滨商业大学药物研究所提供。 2.3实验仪器 SANYO MC0175型CO2培养箱（NAPCO）；WELLSCAN MK3型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；CLOUTER EPICS-XL流式细胞仪（美国Beckman Coulter）；透射电镜；高速低温离心机（Beckman Coulter）。3.方法3.1细胞培养 人肝癌细胞HepG-2培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,置37 、5的CO2培养箱中培养，实验时取对数生长期细胞。3.2 MTT测定法取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×104·L-1，加到96孔培养板中，每孔100L，置37、5湿化的CO2培养箱中培养24h。将芦笋皂苷分别加到96孔板中，每孔100L，使终浓度分别为1mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、1000mg·L-1；空白对照组，加RPMI1640培养基100L；阳性对照组，每孔加阿霉素100L，使终浓度为0.01mg·L-1、0.1mg·L-1、1mg·L-1、10mg·L-1。每个剂量设6个平形孔，置37、5湿化的CO2培养箱中继续培养72h。以快速翻板法弃上清液，每孔加MTT试液（0.5g·L-1）100L，继续培养4 h后弃上清液，每孔再加DMSO200L，置微量振荡器上溶解，用酶标仪测定每孔吸光度值，检测波长570nm。计算细胞存活率、细胞生长抑制率、药物的半数抑制浓度。3.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105个/ml，培养24h。加药，置37、5湿化的CO2培养箱中继续培养48h、72h。把细胞培养液吸出转移至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用含有1%EDTA的胰酶消化液消化细胞。细胞消化下来后，收集细胞，1000g离心5min，弃去上清液，用PBS轻轻重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取510×104个重悬的细胞，1000g离心5min，弃去上清液，加入195µLAnnexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。加入5µL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温(20-25)避光孵育10min（可以使用铝箔进行避光）。1000g离心5min，弃去上清液，加入190µL Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞。加入10µL碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置15min。300目筛网过滤后上流式细胞仪检测，检测波长488nm。3.4透射电镜观察细胞凋亡形态 取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞浓度为106个/ml，培养24h。加药，置37、5湿化的CO2培养箱中继续培养72h后收集细胞，用PBS洗2次，用1%戊二醛迅速原位固定30min，置细胞于离心管中，低速离心后向沉淀中加入1.5%戊二醛继续固定1h，用0.18mol/L蔗糖冲洗液冲洗3次，每次1h，并在冲洗液中过夜，用1%琼脂包埋沉淀的细胞，用1%锇酸后固定2h，冲洗后，用丙酮梯度系列脱水；以100%丙酮与包埋剂(1:1)混合物37浸透3h，Epon812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，电镜下观察、拍照。3.5 Caspase-8,Caspase-9和Caspase-3相对活性检测 细胞培养同及加药同3.2，给药时间24h和48h。实验方法参看Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3活性检测试剂盒说明书。用酶标免疫测定仪测定波长为405的吸光度值(OD405值)，以此来表示Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的相对活性。3.6 统计学分析SPSS14.0软件处理。各组数据以±s表示，样本比较采用方差检验。4.结果4.1MTT测定结果 结果见表1。结果可见，芦笋皂苷可明显抑制HepG-2细胞的增长，并呈剂量依赖性,高剂量组的OD值与阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。芦笋皂苷对HepG-2细胞的最大抑制率为89.92%，IC50为101.15mg·L-1。Tab.1 Inhibitory effect of saponins of asparagus on HepG2 cell（±s，n=6）Content(mg·L-1)NumberOD value IR（%）IC50(mg·L-1)Control1101001000666660.744±0.0250.730±0.021*0.571±0.003*0.378±0.006*0.075±0.037*-1.888.349.1989.92101.15*P<0.01 vs control4.2流式细胞仪测定细胞凋亡率结果结果如图1和表2所示。（如图左下为肿瘤细胞；右下为凋亡早期细胞；右上为凋亡晚期和坏死细胞）。结果表明芦笋皂苷能够有效地诱导HepG-2肿瘤细胞凋亡，并且细胞凋亡率随着浓度的升高呈现一定的剂量-依赖性，且各给药组与阴性对照组比较存在显著性差异。A) HepG-2 cells treated with RPMI-1640 B) HepG-2 cells treated with 5g/mL ADMC) HepG-2 cells treated with 50mg/L D) HepG-2 cells treated with 100mg/L E) HepG-2 cells treated with 200mg/LFig 1 Apoptosis rate of HepG-2 cells induced by saponins of asparagus at 72hTab 2 Effect of saponins of asparagus on apoptosis rate of HepG-2 cells at 72hGroupDoseAnnexinV (%)(±s)(mg·L-1)象限象限象限Control-79.7±0.097.9±0.0211.6±0.04Saponins of asparaus50 46.0±0.06*10.7±0.01 41.0±0.07*100 43.7±0.08*9.3±0.03 42.0±0.08*200 36.8±0.03*15.5±0.04 46.6±0.04*ADM50.5±0.01*0.1±0.02 74.7±0.08*P<0.01 vs control4.3透射电镜观察HepG-2细胞凋亡形态结果如图可见，随着药物浓度的增加细胞凋亡特征性形态逐渐明显。空白组有核仁且细胞器丰富；低剂量组核形不整且出现气泡；中剂量组和高剂量组细胞其变性，明显可见凋亡小体；阳性组细胞裂解。结果如图2。 A. morphology of control group B. HepG-2 cells treated with AMD C. HepG-2 cells treated with 50 mg·L-1 D. HepG-2 cells treated with 100 mg·L-1 E. HepG-2 cells treated with 200 mg·L-1Fig 2. electron microscopy appearance of HepG-2 cells at 72h（5000X）4.4芦笋皂苷对Caspase-8,Caspase-9，Caspase-3活性影响结果如表3、4所示。结果显示，与阴性对照组比较，芦笋皂苷对HepG-2细胞作用24h、48h后Caspase-8，9，3的相对活性随着药物浓度的升高而升高，呈现一定的剂量-依赖性，且与阴性对照组比较有显著性差异（P<0.05）。芦笋皂苷对HepG-2细胞作用24h、后caspase-8活性相对较高；药物作用HepG-2细胞48h后caspase-3和caspase-9活性相对较高。Tab 3 Effect of saponins of asparagus on Caspase-8,3,9 activity of HepG-2 cells at 24hGroupsDose(g /mL)NumberCaspase-8activityCaspase-9activityCaspase-3activityControl-60.053±0.0020.055±0.0050.021±0.003asparaus Saponins5060.07±0.004*0.089±0.003*0.038±0.003*10060.112±0.003*0.093±0.008*0.041±0.007*20060.130±0.005*0.127±0.01*0.048±0.005*ADM560.169±0.02*0.096±0.009*0.084±0.006*P<0.01 vs controlTab 4Effect of saponins of asparagus on Caspase-8,3,9activity of HepG-2 cells at 48hGroupsDose(g /mL)NumberCaspase-8activityCaspase-9activityCaspase-3activityControl-60.016±0.0030.013±0.040.022±0.003asparaus Saponins5060.024±0.004*0.091±0.009*0.052±0.006*10060.026±0.002*0.147±0.02*0.102±0.008*20060.036±0.005*0.156±0.008*0.104±0.03*ADM560.041±0.007*0.168±0.03*0.130±0.04*P<0.01 vs control5.讨论细胞凋亡（apoptpsis）是一种普遍的生理现象，是指在一定的生理或病理条件下，按程序进行的细胞死亡过程，亦称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）4。近些年来对芦笋皂苷抗肿瘤作用时有报道6，本实验采用MTT法测得芦笋皂苷能明显抑制HepG-2肿瘤细胞的增殖，芦笋皂苷对HepG2细胞的最大抑制率为88.54%，IC50为101.15mg·L-1；利用流式细胞仪检测到芦笋皂苷能够有效地诱导HepG-2肿瘤细胞凋亡，细胞凋亡率随着浓度的升高呈现一定的剂量-依赖性；利用透射电镜观察到，随着药物浓度的增加细胞凋亡特征性形态逐渐明显，高剂量组明显可见凋亡小体。Caspase是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族,以Caspase前体酶原的形式存在大多后生动物的细胞中，Caspase的活化是导致细胞凋亡的中心环节。Caspase在凋亡信号的作用下首先激活位于级联反应的最上游的启动型Caspase5（Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等）引发Caspase级联反应,然后通过活化并激活下游的执行型Caspase（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）等裂解特异性底物导致细胞凋亡。由于Caspase本身可以自我活化并相互激活，因此凋亡过程一旦触发,即呈现级联放大效应6-8。芦笋皂苷诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚无明确的报道。根据本实验结果表明，不同浓度芦笋皂苷作用肿瘤细胞24h、48h后caspase-8、caspase-9和caspase-3活性与阴性对照组比较均有显著的增高，提示芦笋皂苷诱导肿瘤细胞凋亡可能与其激活caspase-8、caspase-9和caspase-3有关，且从结果可见药物作用24h后caspase-8活性较作用48h后活性相对较高，而caspase-3和caspase-9活性在药物作用48h后相对较高，提示芦笋皂苷诱导HepG-2细胞凋亡的过程中，首先激活了上游的启动型Caspase：Caspase-8和caspase-9，而Caspase-8和caspase-9的激活引发了Caspase级联反应，导致下游的Caspase-3的激活，而作为执行型Caspase的Caspase-3最终导致细胞凋亡。 参考文献1 孙春艳,赵伯涛,郁志芳,钱骅.黄晓德芦笋的化学成分及药理作用研究进展. 中国野生植物资源,200423(5):1-52 周利亘,王春辉,王君虹,陈新峰,管延金.芦笋的活性成分及其生物学功能.安徽农学通报,2006,12(2):23-253 林友胜,胡松青.芦笋的药理和临床研究要述.辽宁中医学院学报,2005,6(7):637-6384 Habib MR,Joel AH,Qing F.Modulation of apoptosis by nitric oxide:implications in myocardialischemia and heart failureJ.Pharmacology and Therapeutics,2005,106:147-1625 杨平,曹杰,王辉,孙政,李旺林,谭明华.奥沙利铂诱导结肠癌细胞株480凋亡过程中Caspase-8的活化.广东医学,2007,28(3):345-3486 estrap AP, Doran E, Gillespie JP. et a1. Mitochondria and cell deathJ. Biochem Soc Trans,2000,28(2):170-1777 梁先敏.Caspase和JNKPSAPK、p38MAPK与细胞凋亡.国外医学卫生学分册,2008,35(1):5-108 王筱冰,张小翠,夏妙红.Caspase的活化机制.现代生物医学进展,2006,6(3):53-55