血中安眠药物的固相萃取GCMS分析方法研究.doc

2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#血中安眠药物的固相萃取 GC / MS 分析方法研究孙红雷 , 李文海(山东省泰安市公安局刑警支队 ,山东 泰安 271000)摘 要 : 研究了不同固相萃取柱 、洗脱剂 、洗脱剂用量和缓冲液用量对血液中 13 种镇静类药物和 2 种内标物的回收率的影响 ,建立了常见安眠镇静类药物 ( 包括酸性 、碱性 、中性) 的快速、准确 、系统的分析方法. 结果表明采用 Oa si s HLB cart ridge 固相萃取柱 ,加入 2 mL 磷酸盐缓冲液 ,用 3 mL 氯仿作为洗脱剂时的回收率较好. 该方法具有 操作简便快捷 ,回收率高 、重现性好 、提取物干净等特点 ,可用于安眠镇静药物的提取检验.关键词 : 固相萃取 ; 气相色谱/ 质谱联用仪 ; 安眠镇静类药物中图分类号 : O657 . 32文献标识码 : A文章编号 :100623757 (2008) 0420209205在对血液中安眠镇静类药物的定性分析过程中 ,固相萃取 ( SP E) 法由于操作简便、省力 、省溶剂 等优势 ,已成为临床毒物学和法庭毒物学的药物分 析中样品预处理方法的一个主要工具 1 . 但该方法 亦存在不足 , 由于安眠镇静类药物可分为酸性、碱 性、中性药物 ,若对某一种未知安眠镇静类药物进行 检验 ,需调节检材的 p H 值 ,然后进行提取、浓缩、检 验 ,操作繁琐且需检材量大 2 ,3 . 本文将 3 种不同的 SP E 柱对 13 种安眠镇静类药物和 2 种内标物在血 液中的回收率进行了试验 ,同时研究了洗脱剂种类 、 洗脱剂用量和缓冲液用量对回收率的影响 ,利用气 相色谱/ 质谱联用仪 ( GC/ M S) 进样检验 ,结合自动 质谱去卷积定性系统 ( A MD IS) 4 软件的自动检索 功能进行数据分析 ,确定药物的种类 ,取得了较好的 效果.cc/ 200 mg ) .100 g/ mL 的标准储备液 : 巴比妥 、异戊巴比 妥、苯巴比妥 、烯丙异丙巴比妥、氯丙嗪 、异丙嗪、速可眠、安定、舒乐安定 、利眠宁 、三唑仑、阿普唑仑、氯氮平、眠而通、S KF525 A 各 100 mg 加入到 100 mL 容 量瓶中 ,用乙醇定容至刻度 , 配制成浓度为 1 mg/ mL 的混合溶液 ,再移取 10 mL 混合溶液至 100 mL 容量瓶中精确定容 ,配制好的标准样品浓度为 100 g/ mL .乙醇 、甲醇 、氯仿 、乙醚 、乙酸乙酯 、异丙醇均为 色谱纯 ,天津大茂化学试剂厂 ;p H 6 . 0 磷酸盐缓冲 液 ;空白血样来源于不含上述混合样的健康人血.1 . 2 实验条件1 . 2 . 1 色谱条件Elit e25M S 毛细管气 相色谱 柱 ( 30 m ×0 . 25 mm ×0 . 25 m) ; 载气为氦气 ,纯度 99 . 999 % ,流速1 mL / mi n ;初始柱温为 60 , 然后以 20 / mi n 升温至 220 ,保持 1 mi n ,再以 5 / mi n 升温至 290,保留 5 mi n ;进样器温度 280 .1 . 2 . 2 质谱条件离子源温度 200 ,传输线温度 250 ,电子倍 增器电压 500 V ,质量扫描范围 :40500 m/ z .1 . 3 固相萃取条件1 . 3 . 1 检材处理1 实验部分1 . 1仪器与试剂P E Cla r u s500 气相色谱2质谱联用仪 :美国珀金 埃尔默 ( Per ki n El mer ) 公司产品 ; A MD IS3 . 2 软件 ;12 管固相萃取装置 : GC Scie nce 公司 ;氮吹仪 : 美国P IERC E 公司 ;精密移液器 :大龙医疗设备 ( 上海) 有 限公司 ; 固相萃取柱 : Wat er s 公司 Oa si s HLBca r t ri dge ( 3 cc/ 60 mg) ; va ria n 公司 Bo nd El ut2012-C180(37c-c/02020 #m#g )#; #va#ri#a n#公#司#B#o #nd#E2l u0tC12 2( 3-07-0取2血#样#2#m#L 于#2离#0心#1管2中-,0加71-0 002g / #m#L 标#准#2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#溶液 2 5 0 L 和 p H 6 . 0 磷酸盐缓冲液混匀 , 超声柱、洗脱剂种类和洗脱剂用量 、缓冲液用量按 1 . 3 处理后得到的备检液进行分析 ,将 GC/ M S 数据文件 用 A MD IS 软件进行自动检索 ,快速 、准确的确定安眠镇静类药物的保留时间.2 结果与讨论2 . 1固相萃取柱的选择取 3 份血样各 2 mL 分别加入 100g/ mL 的标 准溶液 250 L ,再加入 0 . 1 moL / L p H 6 . 0 的磷酸盐缓冲液 2 mL ,按照 1 . 3 方法进行处理 ,并用 Oa si sHLB ca r t ri dge 、Bo nd El ut C18 和 Bo nd El ut C2 3 种 不同填料的固相萃取柱萃取 ,测定安眠镇静类药物的回收率 ,结果见表 1 .由 表1 可知 , HLB 柱对安眠镇静类药物的提振荡 5 min , 1 0 0 0 0 r/ min 离心 1 0于试管中.1 . 3 . 2固相萃取柱活化min , 取上清液用 5 mL 甲醇以 1 mL / mi n 的流速淋洗活化柱子 ,然后将上清液以 0 . 5 mL / mi n 的流速通过柱子 , 再将 5 mL 蒸馏水以 1 mL / mi n 的流速过柱洗杂 ,通 氮气干燥 5 mi n ,最后用氯仿以 0 . 5 mL / mi n 的流速洗脱药物 ,收集洗脱液于试管中 ,氮吹仪浓缩至干 ,加 250 L 乙醇溶解 ,供 GC/ M S 检验.1 . 4 A MD IS 处理 GC/ M S 数据文件用 M S Sea rch2 . 0 软件检索出需分析的安眠镇 静类药物谱图 ,然后通过 A MD IS3 . 2 软件的自建谱库功能建立安眠镇静类药物谱库. 将不同固相萃取表 1 不同固相萃取柱萃取血样中安眠镇静类药物的回收率( n = 3 , %)Table 1 The recovery of hypnotic sedative drugs by diiff erent SPE columns固相萃取柱安眠镇静类药物名称 C2 C18 HL B 巴比妥异戊巴比妥 苯巴比妥 烯丙异丙巴比妥 氯丙嗪 盐酸异丙嗪 速可眠氯氮平 眠而通 安定 舒乐安定 利眠宁 三唑仑 阿普唑仑68 . 50 ±3 . 1275 . 53 ±4 . 3629 . 71 ±2 . 4119 . 16 ±1 . 3149 . 24 ±3 . 4564 . 86 ±4 . 6767 . 82 ±2 . 5657 . 54 ±3 . 4949 . 83 ±2 . 9259 . 52 ±3 . 3665 . 08 ±2 . 3970 . 00 ±4 . 0764 . 67 ±2 . 4351 . 68 ±1 . 223 . 95 ±2 . 3330 . 35 ±1 . 7613 . 12 ±5 . 1026 . 86 ±1 . 5218 . 18 ±5 . 4239 . 22 ±3 . 6418 . 18 ±4 . 6816 . 67 ±3 . 059 . 33 ±4 . 1119 . 48 ±4 . 16/19 . 99 ±5 . 8118 . 76 ±2 . 7214 . 23 ±2 . 3299 . 54 ±1 . 9998 . 14 ±2 . 6581 . 22 ±1 . 3093 . 67 ±3 . 0489 . 48 ±4 . 4286 . 02 ±1 . 4990 . 64 ±2 . 3183 . 65 ±1 . 3899 . 85 ±3 . 1695 . 97 ±2 . 7183 . 80 ±2 . 1298 . 29 ±1 . 6091 . 12 ±4 . 2187 . 27 ±2 . 76 S KF525A 62 . 23 ±2 . 19 30 . 51 ±4 . 51 84 . 09 ±2 . 37 注 :/ 表示未检出安眠镇静类药物.取率最高 ,C18 柱的提取效果最差 ,虽然 C2 柱的提取率最高能达到 75 . 53 % ,但提取效果不均匀. 由总离 子流图 ( T IC) 可以发现 , HLB 柱的总离子流图特征 离子峰清晰 , 而 C2 、C18 柱的总离子流图杂峰较多 , 说明洗脱出较多的杂质 ,故 Oa si s HLB ca rt ri dge 固 相萃取柱对安眠镇静药的萃取效果最好.2 . 2 洗脱剂的选择取 4 份血样按照 1 . 3 方法进行处理 ,分别加入行洗脱 ,测定回收率 ,结果见表 2 .由表 2 可知 ,洗脱剂为氯仿时血样中安眠镇静 类药物的回收率最高 ,其次是氯仿 异丙醇 ( 9 1 ,V / V ) 、乙醚、乙酸乙酯. 虽然不同洗脱剂洗脱安眠药的回收率不同 ,但 4 种洗脱剂对巴比妥类安眠药的 回收率都是最高的 ,而对于苯二氮杂卓类安眠药则 都是最低的. 氯仿和氯仿 :异丙醇 ( 9 1 , V / V ) 都获得了较高的回收率 ,但是氯仿 :异丙醇 ( 9 1 , V / V )同时也洗出了一些杂质 ,故选用氯仿作为洗脱溶剂.乙酸乙酯 、氯仿 、乙醚、氯仿 : 异丙醇 ( 9 1 ,V / V ) 进2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#2 . 3洗脱剂用量地选择洗脱剂的用量对萃取效果的影响较大 ,分别使 用 1 、2 、3 、4 mL 氯仿作为洗脱溶剂 ,按照 1 . 3 方法操作步骤进行试验 ,结果见表 3 .由表 3 可知 , 2 mL 氯仿能够较好地把样品组 分析脱出来 ,洗脱溶剂量为 3 mL 时 , 效果最好 , 当 用 4 mL 洗脱时 ,杂质明显增加 ,故选用 3 mL 氯仿作为洗脱溶剂.2 . 4磷酸盐缓冲液用量的选择加入磷酸盐缓冲液目的是保持血样的 p H 稳 定 ,这对于样品组分的提取十分常重要. 实验分别取1 、2 、3 、5 mL 磷酸盐缓冲液加入血样中 ,按照 1 . 3 方法在同一条件下进行萃取 ,结果见表 4 .由 表4 可知 , 加1 mL 磷酸盐缓冲液的萃取效表 2 不同洗脱剂洗脱血样中安眠镇静类药物的回收率( n = 3 , %)Ta ble 2 The recovery of hypnotic sedative drugs by diff erent eluant洗脱剂安眠镇静类药物名称乙酸乙酯氯仿氯仿 异丙醇乙醚巴比妥异戊巴比妥 苯巴比妥 烯丙异丙巴比妥 氯丙嗪 盐酸异丙嗪 速可眠氯氮平 眠而通 安定 舒乐安定 利眠宁 三唑仑 阿普唑仑18 . 14 ±1 . 4417 . 02 ±1 . 275 . 97 ±0 . 4316 . 69 ±2 . 358 . 47 ±3 . 2622 . 73 ±3 . 719 . 63 ±2 . 358 . 44 ±1 . 937 . 53 ±1 . 0210 . 78 ±2 . 27/10 . 49 ±1 . 298 . 48 ±1 . 146 . 41 ±1 . 5399 . 87 ±1 . 43102 . 2 ±2 . 0396 . 04 ±2 . 09107 . 3 ±1 . 3688 . 58 ±1 . 5681 . 44 ±2 . 3785 . 41 ±2 . 1989 . 98 ±3 . 7998 . 01 ±2 . 85106 . 4 ±3 . 2796 . 67 ±2 . 14113 . 2 ±2 . 7288 . 43 ±4 . 1187 . 00 ±1 . 0192 . 74 ±3 . 7892 . 23 ±1 . 9193 . 80 ±2 . 54104 . 9 ±2 . 5770 . 67 ±1 . 2476 . 04 ±1 . 0485 . 73 ±2 . 1177 . 51 ±2 . 8290 . 95 ±4 . 1390 . 47 ±1 . 3698 . 94 ±4 . 7699 . 10 ±1 . 5485 . 24 ±2 . 6975 . 93 ±1 . 1570 . 84 ±2 . 8069 . 74 ±1 . 9348 . 35 ±4 . 1965 . 73 ±2 . 467 . 11 ±2 . 1446 . 21 ±1 . 3247 . 76 ±1 . 1733 . 24 ±3 . 0840 . 67 ±3 . 1555 . 42 ±1 . 5239 . 11 ±2 . 8356 . 69 ±1 . 9838 . 55 ±2 . 6231 . 02 ±3 . 52 S KF525A 17 . 27 ±2 . 48 90 . 96 ±1 . 91 72 . 87 ±1 . 64 37 . 12 ±1 . 73 表 3 洗脱剂氯仿的不同用量洗脱血样中安眠镇静类药物的回收率( n = 3 , %)Ta ble 3 The recovery of hypnotic sedative drugs by diff erent eluant quantities洗脱剂用量/ mL安眠镇静类药物名称 1 2 3 4 巴比妥异戊巴比妥 苯巴比妥 烯丙异丙巴比妥 氯丙嗪 盐酸异丙嗪 速可眠氯氮平 眠而通 安定 舒乐安定 利眠宁 三唑仑 阿普唑仑68 . 07 ±1 . 7963 . 88 ±1 . 0356 . 74 ±1 . 2461 . 56 ±2 . 5158 . 26 ±1 . 7654 . 22 ±0 . 5659 . 91 ±2 . 4558 . 87 ±1 . 1365 . 93 ±3 . 1270 . 74 ±2 . 4866 . 63 ±4 . 0155 . 24 ±1 . 1861 . 82 ±2 . 3142 . 24 ±1 . 2375 . 12 ±2 . 6972 . 23 ±1 . 9266 . 06 ±1 . 5474 . 05 ±2 . 5165 . 01 ±1 . 3276 . 27 ±3 . 0781 . 85 ±1 . 1179 . 67 ±1 . 3466 . 39 ±1 . 4988 . 71 ±2 . 0573 . 19 ±3 . 5270 . 13 ±2 . 7887 . 95 ±2 . 9365 . 11 ±1 . 5093 . 32 ±1 . 3498 . 69 ±2 . 18101 . 9 ±1 . 62106 . 2 ±1 . 7191 . 90 ±1 . 4783 . 58 ±1 . 6998 . 43 ±2 . 45104 . 5 ±3 . 2299 . 68 ±1 . 3595 . 15 ±2 . 66106 . 3 ±3 . 31102 . 6 ±2 . 6793 . 26 ±2 . 1883 . 53 ±3 . 9379 . 33 ±2 . 1983 . 72 ±2 . 7878 . 28 ±3 . 4482 . 19 ±2 . 3378 . 98 ±1 . 3975 . 24 ±4 . 1680 . 05 ±1 . 9786 . 34 ±2 . 7672 . 58 ±3 . 6192 . 29 ±1 . 9482 . 17 ±1 . 8182 . 89 ±3 . 4480 . 67 ±1 . 6470 . 78 ±0 . 88 S KF525A 52 . 47 ±1 . 44 72 . 81 ±2 . 31 83 . 41 ±2 . 67 73 . 52 ±2 . 31 2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#果不理想外 ,加 2 、3 、5 mL 都可取得较好萃取效果 ,但以 2 mL 的效果最好 ,故用 2 mL 磷酸盐缓冲液作 为最佳剂量.2 . 5优化条件下安眠镇静类药物的回收率取 3 份血样按照 1 . 3 方法进行处理 ,加入 2 mL磷酸盐缓冲液 ,混匀 ,经 Oa si s HLB ca r t ri dge 柱萃取 ,用 3 mL 氯仿洗脱 ,获得血中安眠镇静类药物的总离子流图 ,结果见图 1 .由图 1 可知 ,本提取方法对于巴比妥类、苯二氮 杂卓类、吩噻嗪类安眠镇静药物均可得到较好的回收率 ,可以满足实际办案工作中安眠药筛选检验的提取需要.表 4 磷酸盐缓冲液的不同用量对血样中安眠镇静类药物提取回收率的比较( n = 3 , %)Ta ble 4The recovery of hypnotic sedative drugs by diff erent PBS quantities磷酸盐缓冲液用量/ mL安眠镇静类药物名称1235巴比妥异戊巴比妥 苯巴比妥 烯丙异丙巴比妥 氯丙嗪 盐酸异丙嗪 速可眠氯氮平 眠而通 安定 舒乐安定 利眠宁 三唑仑 阿普唑仑60 . 66 ±2 . 4468 . 67 ±2 . 9570 . 29 ±1 . 4570 . 35 ±2 . 2460 . 52 ±3 . 1157 . 02 ±1 . 5169 . 49 ±2 . 1966 . 45 ±1 . 0368 . 15 ±2 . 3179 . 06 ±0 . 3277 . 42 ±2 . 8878 . 25 ±2 . 4776 . 61 ±2 . 0772 . 48 ±3 . 5293 . 48 ±2 . 9691 . 44 ±1 . 8398 . 48 ±1 . 8893 . 79 ±2 . 0481 . 47 ±0 . 2786 . 72 ±1 . 7487 . 47 ±2 . 4690 . 70 ±1 . 2688 . 69 ±1 . 4499 . 41 ±2 . 8495 . 91 ±1 . 7491 . 58 ±3 . 7792 . 88 ±2 . 2782 . 54 ±2 . 9387 . 90 ±1 . 2782 . 52 ±2 . 0484 . 73 ±1 . 5375 . 14 ±1 . 7579 . 15 ±2 . 2676 . 17 ±1 . 9681 . 38 ±2 . 5778 . 51 ±0 . 8379 . 91 ±1 . 3687 . 01 ±2 . 4886 . 66 ±0 . 4984 . 49 ±1 . 1876 . 13 ±2 . 3874 . 76 ±1 . 1277 . 12 ±2 . 4278 . 49 ±1 . 9686 . 75 ±3 . 8876 . 47 ±2 . 5671 . 27 ±1 . 4363 . 43 ±2 . 1278 . 97 ±2 . 6785 . 98 ±3 . 6576 . 32 ±1 . 7782 . 81 ±3 . 6981 . 37 ±3 . 3585 . 49 ±2 . 4776 . 84 ±3 . 4166 . 97 ±1 . 09 S KF525A 53 . 73 ±1 . 56 84 . 97 ±1 . 91 73 . 91 ±3 . 16 62 . 33 ±1 . 15 图 1 优化条件下血中安眠镇静类药物的总离子流图Fig. 1 The TIC of hypnotic sedative drugs in optimum condition2 . 6内标物提取实验实验中选择烯丙异丙巴比妥、S KF525 A 作为内标理 ,2 种内标物的提取率都较高 ,可用作内部质量控制 ,在提取血中安眠药类药物时加入这 2 种内标物 ,物 ,加入到安眠药混合标准液中 ,按 1 . 3 方法进行处可保证提取质量.2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#2012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#镇静药物的提取检验.结论通过对固相萃取柱、洗脱剂、洗脱剂用量和缓冲 液用量对血液中安眠镇静类药物同步提取分析结果 的比较 , 建立了常见安眠镇静类药物的 GC/ M S/ A MD IS 系统分析方法 ,选用 Oa si s HLB ca r ti dge 固 相萃取柱 ,加入 2 mL p H 6 . 0 磷酸盐缓冲液 , 用 3 mL 氯仿作为洗脱溶剂时安眠镇静类药物 ( 包括酸 性、碱性和中性药物) 的回收率达到 81 %以上 ,该方 法具有操作简便快捷 ,提取回收率高、重现性好、提 取物干净等特点 ,可用于麻醉抢劫、杀人案件中安眠3参考文献 :邢若葵 ,温锦峰. 自动固相萃取法提取常见安眠镇静药J . 刑事技术 ,2003 ,3 :12215 .高立勤 ,刘文应. 固相萃取技术及其在生物样本分析 中的应用与进展J . 药学进展 ,1997 ,21 (1) :8211 . 王雅芬 ,赵敬真. 生物组织中混合安定类药物的检验 J . 公安大学学报 (自然科学版) ,2001 ,6 :9212 . 李文海 ,孙红雷. GC/ M S/ A MD IS 在法医毒物分析中 的应用J . 法医学杂志 ,2007 ,23 (3) :1962198 . 1 2 3 4 The Research on the Analysis of Common Hypnotic Sedat iveDrugs in Blood by GC/ MS with SPESU N Ho ng2lei ,L I We n2hai( Taia n Public Sec ut riy B urea u , Taia n 271000 , Chi na)Abstract : U si ng t he new t ech nolo gy of t he sa mp le p re2t reat me nt SP E a nd A MD IS to e st a bli sh a si mp le a ndf a st met ho d to e xt ract a nd a nal y se co mmo n hyp no tic se dative dr ugs ( i ncl udi ng aci dit y , al kale sce nce a nd lit mu sle ss) . Co mp a ri ng Oa si s HLB ca r t ri dge 、C18 a nd C2 t h ree cat ego r ys SP E col u mn to e xt ract si mult a neit y13 se dative dr ug s a nd 2 i nt er nal st a nda r d s i n t he bloo d , a nd t he eff ect o n co ver y by diff e re nt el ua nt , diff e re nt el ua nt qua ntitie s diff ere nt PB S qua ntitie s. The co ver y of Oa si s HLB ca rt ri dge were o ver 83 % fo r t he mo st of dr ugs ;chlo rofo r m we re mo st eff ect l y el ua nt by 3 mL a nd 2 mL PB S we re op ti mal qua ntitie s. The met ho d ha d t he cha ract eri stic of si mp le a nd quic k op e ratio n , hi gh reco ve r y , goo d rep eat a bilit y a nd clea n e xt ract , It ca n be app lied to t he ca se s of det e r mi nati ng hyp no tic sedative dr ugs i n t he bloo d.Key words : SP E ; GC/ M S ; hyp no tic se dative dr ugsCla ssif ying n umber :O657 . 322012-07-02#2012-07-02#2#0#12-07-02#