分枝杆菌分离培养作业指导书.doc

会理县人民医院检验科 作业指导书文件编号： JH02 分枝杆菌分离培养作业指导书第 1 页 共 4页第 1 版 第0次修订颁布日期： 2015年8月1日1.目的: 规范分枝杆菌分离培养操作程序，提高检验质量。2.适用范围：适用于本实验室工作人员，工作人员应在二级生物安全柜内开展分枝杆菌分离培养，按操作程序完成接种。3.职责：检验人员按此操作执行，科室负责人和质量监督员进行监督4.操作程序：4.1简单法4.1.1准备4.1.1.1将酸罗氏培养基从冷藏环境中取出，室温下放置4.1.1.2接通生物安全柜电源预热3分钟4.1.1.3将病人姓名或实验序号标记在前处理管上4.1.1.4待酸罗氏培养基恢复至室温，在培养基斜面的背面标记病人的姓名、实验序号、接种日期4.1.2前处理碱处理直接法4%(W/V)NaOH的配制：取4 gNaOH加入80ml蒸馏水中，完全溶解后补充蒸馏水至终积100ml。根据标本的粘稠程度，加入12倍体积的4%NaOH，涡漩振荡器振荡，使标本匀化，室温放置。自加入4%NaOH到标本接种应在20min内完成。4.1.3接种、培养与观察 会理县人民医院检验科 作业指导书文件编号： JH02 分枝杆菌分离培养作业指导书第 2 页 共 4页第 1 版 第0次修订颁布日期： 2015年8月1日 4.1.3.1取前处理后的标本0.1ml，无菌操作接种于培养基斜面，每份标本同时接种两支培养基上。 4.1.3.2.接种后的培养管在370C温箱孵育，接种后3天、7天分别观察结果一次，然后每周观察结果一次。发现菌落生长者，经抗酸染色证实为抗酸杆菌，可报告分枝杆菌培养阳性。若满8周仍无菌落生长，方可报告阴性。观察时要注意菌落外观和色素产生情况。4.2浓缩集菌法4.2.1准备4.2.1.1将改良罗氏培养基从冷藏环境中取出，室温下放置4.2.1.2接通生物安全柜电源预热3分钟4.2.1.3将病人姓名或实验序号标记在50ml前处理管上4.2.1.4待改良罗氏培养基恢复至室温，在培养基斜面的背面标记病人的姓名、实验序号、接种日期4.2.2前处理4.2.2.1对照标记，在生物安全柜内将约2ml痰标本置于相应的前处理管中4.2.2.2视标本性状，在生物安全柜内向前处理管内加入1-2倍体积NALC-NaOH混合溶液4.2.2.3旋紧盖子，在涡旋振荡器上震荡30-60秒4.2.2.4将前处理管室温静置15分钟4.2.2.4在生物安全柜内打开离心管，向离心管中加入PBS缓冲液，不超过40ml，旋紧离心管4.2.2.5配平离心管，将配平的离心管放入离心筒中，3000xg离心20分钟 县会理县人民医院检验科 作业指导书文件编号： JH02 分枝杆菌分离培养性作业指导书第 3 页 共 4页第 1 版 第0次修订颁布日期： 2015年8月1日4.2.2.6在生物安全柜中打开离心筒，弃上清，加入0.5mlPBS缓冲液，混匀待用4.2.3接种、培养与观察同简单法4.3结果与报告4.3.1.接种并孵育后3天、7天各观察一次菌落生长情况，发现菌落生长者，经抗酸染色证实为抗酸杆菌，可报告分枝杆菌培养阳性。此后每周观察结果一次，记录菌落生长及污染情况。生长手经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。培养阴性结果须在满8周后未见菌落生长者方可报告。4.3.2.分枝杆菌培养报告方式：分枝杆菌培养阴性（阴）：斜面上无菌落生长。分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4。分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2。分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4。分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面。分枝杆菌培养阴性应以“培养阴性”报告，不得以“”表示。菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。4.4质量控制 4.4.1培养基质量控制冷却后的整批培养基或抽取其中一部分 ，置于370C孵育24h进行无菌试验。 对质量不合格的培养基，如气泡、干涸、量不足及发生污染等，必须废弃。同时，每批培养基应抽取部分接种质控菌株（H37Rv标准株），观察其生长情况，以确定培养基的质量。4.4.2培养污染率应在25%范围内，污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等到环节有误，应当分析原因，采取相应措施。 会理县人民医院检验科 作业指导书文件编号： JH02 分枝杆菌分离培养性作业指导书第 4 页 共 4页第 1 版 第0次修订颁布日期： 2015年8月1日4.5 废弃物的处置 所有标本瓶、接种物品及培养管等应尽采用一次性物品，使用后均应就地高压灭菌，方可处置。5.支持性文件：结核病诊断实验室检验规程分枝杆菌分离培养法中国防痨协会基础专业委员会2006年1月。6.分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册2012。编写人：余 谦 复核人：余 谦 批准人：刘克芳