食品安全快速检测技术4 课件.ppt
生物技术-免疫学技术,基本概念抗原（antigen）进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质 分完全抗原和半抗原抗体(antibody)：抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白,第三章,免疫学技术-抗原抗体反应,可对抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测抗体抗原以非共价键结合不可见反应：几秒-几分钟 可见反应：数分钟（小时、日）影响因素 电解质 温度 酸碱度,第三章,免疫学技术,酶联免疫法放射免疫法 将同位素分析的灵敏性和抗体抗原反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术 缺点：需特殊仪器设备;一定的防护条件;半衰期短及试验废物难以处理荧光免疫法 以荧光素和罗丹明作为标记物，可在荧光显微镜下检查显示荧光的复合物和所在部位 主要用于医学实践中各类病原微生物的快速诊断以及组织切片中特异抗体的检测其他 胶体金标记,第三章,酶联免疫法（enzyme immunoassay),以酶标记抗体或抗原进行的抗体抗原反应酶结合物应具有双功能：高度特异的免疫反应、生物催化放大作用基本方法 间接法 双抗体夹心法 竞争法生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）某些新进展,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,间接法1、将已知可溶性抗原吸附于载体2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗体的待检液4、温育后清洗5、加入酶标记的二抗6、温育后清洗7、加入酶作用底物8、测定反应颜色深浅,双抗体夹心法1、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液4、温育后清洗5、加入酶标记特异性抗体6、温育后清洗7、加入酶作用底物8、测定颜色反应深浅,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,竞争法1、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液4、温育后清洗5、加入酶作用底物6、测定颜色反应深浅,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,生物素-亲和素系统（biotin-avidin system）基本概念 生物素：是一种维生素H，经活化后，可与抗体、抗原、酶以多 配一的方式共价结合，且不影响它们的活性 亲和素：从卵蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可与酶偶合，以1配多的方式对生物素有很强的亲和力BAS用于检测的基本方法：BAB法或BRAB法 BA法 ABC法,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,均相酶免疫测定法 无需“固定在载体上”；无需“温育后清洗”斑点免疫结合试验 以微孔薄膜为载体，酶免疫反应阳性结果在膜上出现色斑点 胶体金标记较酶标记更为简便,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay）,猪肉和尿液盐酸克伦特罗的免疫胶体金法快速检测,“瘦肉精”学名为盐酸克伦特罗，医学上又称克喘素，常用于治疗哮喘。由于盐酸克伦特罗添加于饲料饲喂动物后可明显促进动物生长,提高 瘦肉率,所以养殖户称其为“瘦肉精”，曾在国内外广泛用于动物饲养 生猪食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，个别会出现腿抽搐，站不 稳，爬坡困难；宰后猪的肌肉特别鲜红，后臀肌肉饱满，肥肉非常薄,瘦肉精介绍,瘦肉精介绍,“瘦肉精”化学性质特别稳定，加热到170时才能被分解，故一般家庭厨房加热不能将其分解破坏食用后在胃肠道吸收快，作用维持时间持久。中毒后主要症状表现为头疼、头晕、心悸、心慌、面色潮红、四肢发抖等症状 违法者使用该物质以提高猪的瘦肉率和颜色鲜艳程度，不知情的市民 错误地认为这样的肉才是“好肉”而特别喜欢选购,食品卫生法食品添加剂卫生管理办法（GB2760）动物性食品中兽药残留最高限量（农业部公告第235号，2002年12月24日）规定：禁用药物，动物性食品中不得检出：瘦肉精、沙丁胺醇、西马特罗等31种 违法者的法律责任：民事赔偿、行政处罚、刑事处罚,法律规定,盐酸克伦特罗残留检测方法,动物性食品中克伦特罗残留量的测定（GB5009.192-2003）第一法：气相色谱质谱法，检出限：0.5ppb 第二法：高效液相色谱法，检出限：0.5ppb 第三法：酶联免疫法（ELISA筛选法），检出限：0.5ppb 动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱/质谱法（NY/T 4682006），检出限：2.0ppb 动物尿液中盐酸克伦特罗的测定气相色谱/质谱法（NY/XQ 4212003），检出限：1.0ppb尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法（NY/T933-2005），检出限：3.0ppb,猪肉全程监控中瘦肉精检测方法的选择,生猪饲养,屠宰场,大型批发市场,零售市场,饲料检测猪尿检测,猪尿检测猪肉检测,猪肉检测,猪肉检测,酶联免疫法免疫胶体金,免疫胶体金酶联免疫法,免疫胶体金,筛检阳性,GC-MS确认大型仪器确认,政府部门监督抽检GC-MS,餐饮业,猪肉检测,免疫胶体金,销毁和溯源,阳性,GC-MS确认大型仪器确认,阳性,免疫胶体金快速检测板的外观图,免疫胶体金快速检测板(试剂)的结构图,检测原理,盐酸克伦特罗快速检测试剂板的中央膜面上固定有两条隐形线，克伦特罗抗原固定在测试区作为检测线（T线），二抗固定在质控区作为对照线（C线）。当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因层析作用往上扩散。如果样品溶液含有相应药物的残留，药物将和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至T线时，胶体金颗粒上抗体活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T线上药物抗原结合；所以当样品中盐酸克伦特罗含量1ppb(检测限)以上时，试剂板上的T线将较C线显色淡或甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在1ppb以下或无残留时，试剂板上的T线显色与C线相近或偏深，判定为阴性,灵敏度 肉样或组织样：1ppb(标准前处理)或5ppb（简单前处理）尿样：1ppb(标准前处理)特异性：与沙丁胺醇等苯乙胺类药物没有交叉反应；准确性：与瘦肉精ELISA试剂盒的检测结果符合率90有效期：半年（冷藏闭光保存）,胶体金免疫层析法检测瘦肉精的技术指标,操作步骤,于5ml离心管中加入5g左右剪碎或是高速匀浆过的猪肉组织样，盖紧管盖,1,将装有样品的离心管在90以上水浴锅中加热10 分钟,加热完成后取出冷却至室温；可以明显看到底部有溶液渗出,3,2,吸取3滴（约100ul）煮出的样品渗出液到1.5ml的离心管中,4,操作步骤,吸取3滴（约100ul）盐酸克伦特罗组织样专用稀释液到1.5ml离心管中。充分混合均匀,从包装铝箔袋中取出检测卡平放。吸取3滴（约100ul）混匀溶液加入到试剂板加样孔中,5,6,7,样液滴入加样孔后开始计时，510分钟左右判定结果,
