香菇多糖的生产..林志豪.ppt

香菇多糖的生产,生物技术1111林志豪,香菇多糖简介,香菇多糖（简称LNT），存在于香菇中，分子量为100万，是一种非特异性免疫刺激剂。具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能（T细胞促进作用)，现在已被广泛用于不能手术和化疗后的癌症病人的康复治疗。与其他抗肿瘤药物相比，香菇多糖几乎无任何副作用，是目前已知最强的免疫增强剂之一。到目前为止，香菇多糖仍是从香菇子实体中提取，香菇子实体生长周期长，受环境条件的影响与限制、产量低，从而导致香菇多糖的生产成本高，价格昂贵。,项目原理,本实验主要采用传统的热水浸提法。中性多糖常用水作溶剂来提取，可以用水浸煮。香菇中色素较高，活性炭有脱色素、脱去异味等作用。蛋白质不溶于氯仿等有机溶剂，可对香菇多糖进行除去杂蛋白。而香菇多糖在氯仿中溶解度大于在热水中的溶解度，所以可以用氯仿对香菇多糖进行萃取。,项目原理,乙醇沉淀法提取多糖时，乙醇的浓度及提取方式对多糖的得率影响较大。最有效的方法是向多糖溶液中加入乙醇，使乙醇的最终浓度依次达到40%、60%、70%、80%，离心每次沉淀，乙醇沉淀得到的不一定是纯的多糖，还需用凝胶柱色谱进行分离纯化。用苯酚硫酸法显棕色，可以对多糖进行定性检测。,香菇子实体有含量较多的脂类的物质，可以用石油醚、乙醚等低级性溶剂除去脂溶性杂质。因为香菇肉质太厚，萃取时氯仿很难渗透至其深处，则萃取物的产率低。热水提取法多糖在260nm和280nm波长处有较明显的吸收峰,项目器材与试剂,实验器材：组织捣碎机、恒温水浴锅、循环水式真空泵、冷冻离心机、凝胶柱、脱脂棉、再字夹、紫外分光光度计、容量瓶、试管、烧杯,紫外检测仪、记录仪、流量泵、试剂：氯仿、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚-硫酸试剂：苯酚3g,浓硫酸5mL，溶于95mL无水乙醇中。原料:香菇,项目步骤,多糖的提取热水浸提：称取香菇10g,于组织捣碎机内粉碎，倒入烧杯中，加20倍量的水，将烧杯放入恒温水浴锅中（90）加热30min,然后用布氏漏斗和真空泵进行抽滤，取滤液。脱色，除味：在滤液中加入活性炭（1mg/ml），搅拌吸附1h，抽滤，取滤液。,萃取、除杂蛋白：在滤液中加入氯仿溶液，充分混合后，过滤，取滤液。重复萃取、除杂3次。乙醇沉淀：在萃取液中加入无水乙醇，使其乙醇浓度达80%，沉淀12h,于冷冻离心机中（4000/min）离心30min，取沉淀脱脂：沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，即得香菇多糖提取物。,多糖纯化 取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物。按照项目三SephadexG50凝胶装好柱，用蒸馏水平衡48h（控制好流速：4滴/min），然后将上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度5ml/min（可用恒流泵控制洗脱速度）,200nm波长紫外检测，收集主要峰部分（当记录仪上出现波峰时即用试管开始收集洗脱液），冷冻干燥得白色香菇多糖，并称重。,香菇多糖分析检测,定性检测苯酚-硫酸法 将苯酚-硫酸试剂喷洒在冷冻干燥好的白色香菇多糖上110，加热香菇多糖几分钟糖显棕色即为多糖。,定量检测,标准曲线的制备 精密称取(可用分析天平）60干燥至恒重的甘露糖标准品0.1g，置于100ml的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度处。用移液管量取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0ml.分别置50ml容量瓶中，加蒸馏水定容在各精密吸取1ml，置于带塞试管中，准确移取8%苯酚溶液1ml，快速加入浓硫酸5ml.,置于水浴锅中加热15min,取出冷却至室温，橘黄色由浓度从小到大而逐渐加深，将溶液于490nm波长的分光光度计处测定吸收度，绘制标准曲线。,香菇多糖检测,样品多糖的测定 精密称取香菇多糖10.0mg,加水溶解，定量转移入100ml容量瓶中，加水定容，均摇。准确吸取2.00ml,按上述试验方法显色，测定吸光值，计算香菇多糖含量。,谢谢观看,