实时定量PCR仪绝对定量实验入门指南ABI73007500.doc

绝对定量实验简介和绝对定量示例实验美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪设计绝对定量实验Primer Extended on mRNA5Synthesis of 1st cDNA strand35 cDNAReversePrimerOligo d(T) or random hexamer5 cDNA3执行反转录运行绝对定量反应板分析绝对定量数据© Copyright 2004, Applied Biosystems. All rights reserved.For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Authorized Thermal CyclerThis instrument, Serial No_, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front feecomponent of a license under United States Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by RocheMolecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internalresearch and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchasedfrom Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an AuthorizedThermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems. Its use with AuthorizedReagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents.Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCRprocess. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting theDirector of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404.DISCLAIMER OF LICENSE: No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, areconveyed expressly, by implication or by estoppel under any patent or patent applications claiming homogeneous orreal-time detection methods, including patents covering such methods used in conjunction with the PCR process orother amplification processes. The 5' nuclease detection assay and certain other homogeneous or real-timeamplification and detection methods are covered by United States Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375 and5,994,056, owned by Roche Molecular Systems, Inc.; by corresponding patents and patent applications outside theUnited States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd; and by United States Patent Nos. 5,538,848 and 6,030,787, andcorresponding patents and patent applications outside the United States, owned by Applera Corporation. Purchase ofthis instrument conveys no license or right under the foregoing patents. Use of these and other patented processes inconjunction with the PCR process requires a license. For information on obtaining licenses, contact the Director ofLicensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, or The LicensingDepartment, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, USA.TrademarksApplied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation orits subsidiaries in the US and/or certain other countries.AB (Design), ABI PRISM, Applera, Assays-by-Design, Assays-on-Demand, Celera Genomics, FAM, iScience,iScience (Design), and MultiScribe are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certainother countries.AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation.All other trademarks are the sole property of their respective owners.Part Number 4347963 Rev. A3/2004ii7300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南3 30, 2004 10:02 ¬Á, GSG_FrontCover.fmSAMPLE DOCUMENT" t/ 1 1<" t/77300/7500PCR" t/" t/" t/72 " t/-t" t/- qG- -(RT-PCR)- < 3 Primer Extended on mRNA5Synthesis of 1st cDNA strand35cDNAReversePrimerOligod(T)orrandomhexamer5cDNA3· RNA)RNA RNAcDNA(Primer Extended on mRNA5Synthesis of 1st cDNA strand35cDNAReversePrimerOligod(T)orrandomhexamer5cDNA34 -" t/OPCR )O " t/ p" t/ -5 " t/)<" " t/7300/7500t/ PCR" t/ iiiiv7300/7500t/ PCR" t/ 目录绝对定量实验工作流程前言iiivii如何使用本指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii如何获取更多信息 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii如何获取服务与支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii将您的意见和建议发送给我们 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii第 1 章简介和绝对定量示例实验1概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1关于 7300/7500 PCR 仪 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2关于绝对定量分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2关于绝对定量实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3绝对定量示例实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6第 2 章设计绝对定量实验11工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11概述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12设定绝对定量实验 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12选择化学荧光 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13选择一步法或两步法反转录 - 聚合酶链反应 (RT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14选择探针和引物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15第 3 章执行反转录17工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17准备 RNA 指南 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18将总 RNA 转化为 cDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19第 4 章运行绝对定量反应板21工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21开始之前 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22准备 PCR 扩增预混试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .227300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南v准备反应板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23创建绝对定量 (AQ) 反应板文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24指定热循环条件并开始运行反应板 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28第 5 章分析绝对定量数据31工作流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31设置分析参数 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32调整基线和阈值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33分析并查看绝对定量数据 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39忽略样本 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44导出绝对定量反应板数据 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45附录 A附录 B附录 C创建探针生成标准曲线指南熔解曲线分析474951vi参考文献索引53557300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南前言如何使用本指南本指南的目的假定文字体例用户警示文字本指南为使用美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪 （7300/7500PCR 仪）执行绝对定量实验分析的主要研究人员及实验室人员而编写。本指南假定您已具备以下条件：· 熟悉 Microsoft® Windows® XP 操作系统。· 具备处理 DNA 和 RNA 样本及为 PCR 准备样本的一般知识和技能。· 具备有关硬盘驱动器、数据存储、文件传输、复制和粘贴数据的一般常识。如果您希望将 7300/7500 PCR 仪集成到现有的实验室数据流系统中，则需具备网络经验。· 粗体 表示用户动作。例如：键入 0，然后对剩余的每个字段按一下 Enter 键。· 斜体 表示新的或重要的内容，也用于表示强调。例如：在开始分析之前，请始终准备好新鲜基质。· 右箭头状尖括号 (>) 用于分开您从下拉菜单或快捷菜单中依次选择的命令。例如：选择 File （文件） > Open （打开） > Spot Set （点设置）。在美国应用生物系统公司用户文档中，包括以下用户警示文字。每种警示文字表示需遵守事项或执行动作的不同重要性级别，如下所述：注释：提供使用产品的有趣或帮助性信息，但并非使用产品不可或缺的事项或操作。重要！提供正确操作仪器、精确使用化学试剂或确保安全使用某化学品所必须遵守的要求或必须执行的操作。表示存在潜在的危险状况，如果不加以避免，则可能导致轻度或中度人身伤害。也用于提醒避免不安全的操作。表示存在潜在的危险状况，如果不加以避免，则可能导致死亡或严重人身伤害。7300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南vii前言如何获取更多信息安全注意事项有关重要的安全注意事项信息，请参阅 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪安装和维护入门指南和 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪场地准备指南。如何获取更多信息有关使用 7300/7500 实时定量 PCR 仪的更多信息，请参阅：· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪联机帮助· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪等位基因鉴别实验入门指南（货号 4347964）· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪阳性 / 阴性实验入门指南（货号 4347965）· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪相对定量实验入门指南（货号 4347966）· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪安装和维护入门指南（货号 4347967）· 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪场地准备指南（货号 4347968）· 序列检测系统化学指南（货号 4348358）如何获取服务与支持有关不同地区产品服务和技术支持的最新信息，请登录网站 并单击 Support （支持）链接查阅。在 Support （支持）页上，您可以：· 搜索并查阅常见问题与解答 (FAQ)· 直接向技术支持人员提交问题进行咨询· 订购美国应用生物系统公司用户文档、材料安全数据表 (MSDS)、分析证书及其它相关文档· 下载 PDF 文档· 获取有关客户培训的信息· 下载软件更新和补丁程序此外，在 Support （支持）网页上还提供全球各地美国应用生物系统公司技术支持和销售机构的电话和传真号码。将您的意见和建议发送给我们美国应用生物系统公司欢迎您对我们的文档提出您的宝贵意见和建议，以不断提高我们的用户文档质量。请将您的意见或建议发送电子邮件至：techpubsviii7300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南第 1 章概述简介和绝对定量示例实验简介和绝对定量示例实验关于 7300/7500 PCR 仪参阅第 2 页设计绝对定量实验关于绝对定量分析参阅第 2 页1Primer Extended on mRNA5Synthesis of 1st cDNA strand35cDNAReversePrimerOligod(T)orrandomhexamer5cDNA3执行反转录关于绝对定量实验参阅第 3 页运行绝对定量反应板分析绝对定量数据注释7300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南绝对定量示例实验参阅第 6 页1第 1 章 简介和绝对定量示例实验关于 7300/7500 PCR 仪关于 7300/7500 PCR 仪说明绝对定量分析美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪 （7300/7500 PCR 仪）使用基于化学荧光的 PCR 检测手段，提供采用实时分析法的核酸序列定量检测，和采用终点和熔解曲线分析法的核酸序列定性检测功能。7300/7500 实时定量 PCR 仪允许使用 96 孔板格式的反应板或试管执行几种检测分析。本指南描述绝对定量 (AQ) 实验分析。有关其它实验检测与分析的说明，请参阅 美国应用生物系统公司序列检测系统化学指南 (SDS Chemistry Guide) 和美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量PCR 仪联机帮助 (Online Help)。关于绝对定量分析定义实时 PCR 分析使用绝对定量反应板文件进行阳性 /阴性分析和等位基因鉴别分析绝对定量分析用于确定未知样本中某个目标核酸序列的绝对量值。绝对定量 (AQ) 分析以实时 PCR 方式执行。在实时 PCR 分析过程中，PCR 基因扩增一直在您的监控之中。在 PCR 进行期间进行数据采集，而不是在 PCR 结束时（终点 PCR）才获取数据。在实时 PCR 中，反应是在目标的扩增最早被监测到时用循环中的时间点来描述的，而不是在 PCR 结束时通过目标的累积数来描述。尽管阳性 / 阴性分析和等位基因鉴别 (AD) 分析是终点分析，美国应用生物系统公司仍建议您使用 7300/7500 PCR 仪执行扩增，并观察实时 PCR 结果。若一旦实验失败，您可通过研究扩增图谱来帮助确定实验失败的原因。使用绝对定量反应板文件来存储阳性 / 阴性分析和等位基因鉴别 (AD) 分析的实时数据。用于阳性 / 阴性分析和等位基因鉴别分析的绝对定量反应板文件，不需要标准曲线。注释27300/7500 实时定量 PCR 仪绝对定量实验入门指南关于绝对定量实验绝对定量实验工作流程关于绝对定量实验1绝对定量实验工作流程本文中 “绝对定量 (AQ) 实验”术语是指绝对定量实验分析的整个过程，以从核糖核酸 (RNA) 生成互补脱氧核糖核酸 (cDNA) （反转录）为起点，直到分析绝对定量数据结束。绝对定量实验工作流程包括几个步骤，如第 iii 页流程图所示。绝对定量分析使用标准曲线计算某个未知目标序列的数量。绝对定量实验的结果采用标准曲线中所使用的相同测量单位。7300/7500 PCR 仪存储从绝对定量反应板文件中的反应板上收集的实时 PCR 数据。每次运行包括一个反应板。 7300/7500 PCR 仪提供几种视图用来分析数据。反应板上的反应7300/7500 PCR 仪SDS 软件绝对定量反应板文件