综述线粒体融合分裂与细胞凋亡doc.doc

博士生资格考试综述（2005年10月24日）线粒体融合分裂与细胞凋亡吕冰峰北京大学基础医学院免疫学系分子免疫实验室北京大学人类疾病基因研究中心摘要：线粒体是高度动态的细胞器，它们在细胞内彼此连接呈三位网络状。同时，线粒体在细胞内发生着频繁的融合与分裂，融合与分裂的相对速度决定了线粒体的形态与数目。现在已知的介导线粒体融合的分子主要有Mfn1/2，OPA1和Ugo1；介导线粒体分裂的分子主要有Drp1，Fis1和Mdv1。线粒体的融合分裂与细胞凋亡密切相关，凋亡早期线粒体网络往往发生明显的片断化；线粒体形态的调控分子参与了细胞凋亡，调控凋亡的分子也会明显改变线粒体的形态。关键词：线粒体，融合，分裂，凋亡一、线粒体概述ATP是一切生物进行生命活动的动力，而线粒体是所有真核生物进行能量代谢，产生ATP的重要场所。糖分子在线粒体内通过充分的氧化代谢，所产生的ATP是糖酵解的15倍（1）。正是由于线粒体的这种极高效率的生产能力，生命体才能够在各种激烈的生命活动、复杂的外部环境中向前发展。能量代谢过程中产生的多种自由基分子也参与细胞内的信号传导。线粒体还是细胞程序性死亡的重要参与者。细胞的各种死亡信号几乎都要传递到线粒体，导致膜通透性增加，储存在膜间隙的多种分子释放到胞浆，包括细胞色素C，AIF，Smac/Diablo，Endonuclease G等，这些分子通过活化caspase或者直接作用于染色体DNA，致使细胞死亡。结构是功能的基础，对线粒体结构的正确认识将有利于对其功能的深入研究。电子显微镜下，线粒体呈长椭圆形，具有一层高度折叠的内膜并向内突出成嵴和一层相对简单的外膜，双层膜之间为膜间隙，内膜包绕为基质。然而，这种基于二维图像得到的传统形态忽视了线粒体在细胞内立体空间的形态特征，伴随着三维成像技术的发展与应用，越来越多的学者认为线粒体在细胞内彼此连接，呈现立体的管网状结构，并且发生频繁的融合与分裂（2，3）。本文将针对线粒体的空间结构，线粒体的融合与分裂及其与细胞凋亡的关系做以综述。二、线粒体在细胞内的动态平衡线粒体是动态的细胞器，在细胞的不同生命过程中以及外界环境刺激下，它的数量和形态都是可变的。线粒体可以有椭圆形、长管状、网络状，不同形状的线粒体由于频繁的融合与分裂，此消彼长，保持在一个动态的平衡之中（4，5）。线粒体融合与分裂过程中必须保证膜结构的完整性，以防止膜间隙分子漏出，导致细胞凋亡。（一）线粒体的空间形态1998年，Rizzuto利用计算机辅助高速成像系统合成三维图象后发现在HeLa细胞内，线粒体自身相互连接，形成了巨大的、动态的管网状结构，并且进行持续的重排组合，显示出非常强的结构可塑性（2）。实验中mito-GFP被用来指示线粒体的形态，如果把线粒体网络的某一个局部进行荧光漂白后，该处的荧光很快就恢复了。由此作者认为，细胞内的线粒体形成了连通的网络，mito-GFP在其中自由扩散，所以漂白部位的荧光得以快速恢复。另外，用膜电位敏感的荧光探针标记线粒体后，如果对线粒体的某一局部加以去极化刺激，同样会导致网络远处线粒体膜电位的下降，这也说明细胞内线粒体的高度连通性（6，7）。细胞融合实验也证明线粒体是动态的（8，9）。待融合的两组细胞，一组用绿色荧光标记线粒体，另一组用红色荧光标记，两组细胞混合后用PEG诱导细胞融合，融合细胞内具有红绿不同标记的线粒体。一段时间以后，红绿色荧光消失，所有的线粒体都表现为黄色的荧光，由此证明线粒体是高度动态的，线粒体基质成分发生了充分的混合，实验中这个过程大约需要8-12小时。线粒体形态还随细胞周期而变，G1期细胞线粒体以网络状为主，而S期则呈现片断化的结构（10，11）。不同的培养条件下，线粒体的形态也不完全相同（4）。在酵母中，通过mito-GFP定位线粒体也同样显示出分支网络状的结构（12，13）。细胞内线粒体的网络化程度取决于线粒体融合与分裂的相对速度，通常情况下融合与分裂速度相当，线粒体的数目与形态保持稳定。如果线粒体融合过程受到抑制，就会发生线粒体片断化；而如果线粒体分裂过程受到抑制，线粒体的网络化程度就会加强（14，15）。线粒体的融合与分裂活性必须均保持活跃才可以稳定线粒体的形态。当然不难想象，如果线粒体融合通路发生障碍，也可以通过相应地抑制分裂通路来在一定程度上稳定线粒体形态，反之亦然。比如超表达Drp1K38A可以使Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠片断化的线粒体恢复为长管状（8）。既然同时下调线粒体融合与分裂的活性，线粒体的形态也能够维持稳定，为什么细胞还要进化并保持这种活跃的线粒体融合与分裂活性呢？其答案一定是高度动态的线粒体相比静态的更具优势。线粒体融合能够促进线粒体的协作。线粒体连接成网络有利于能量在其中的传递（7）；有利于信息沟通，包括膜电位快速传递以及线粒体内容物的交换。融合还可以使线粒体之间通过线粒体基因组交换进行充分的DNA互补。伴随着生命的衰老，线粒体DNA会聚集很多的突变，通过线粒体网络进行的基因组互补，可以有效地修复这些突变（72），从而保证线粒体正常的生命活动。线粒体分裂可以明确分工，使得细胞内不同区域的线粒体执行各自的功能，并表现出不同水平的钙储藏、膜电位及膜通透性（16）。分裂还可以使线粒体在细胞分裂过程中平均分配到子代细胞中，这也可以解释为什么G1期细胞线粒体成网络状，而S期则呈现片断化的结构（10，11）。线粒体在动态的网络结构中发生频繁而持续的融合与分裂，协作与分工频繁转换，可以精确地调节细胞复杂的生命活动。近年来，许多调节线粒体融合与分裂的基因被发现，其中多数是Dynamin超家族成员（见表一），它们对线粒体的形态具有重要的调节作用，对于这些基因功能的深入研究将有利于对线粒体形态与功能的认识。表一、参与线粒体融合与分裂的主要分子哺乳动物分子酵母分子活性Drp1（17，18）/DVLP（19，20）/DLP1（21，22）Dnm1（14，15）分裂hFis1（23，24）Fis1（25）/Mdv2（26）分裂未知Mdv1（26）/Fis2（25）/Gag3（27）/Net2（28）分裂Mfn1（8，9，29），Mfn2（8，30，31）Fzo1（32，33）融合OPA1（34，35）Mgm1（36，37）融合未知Ugo1（38）融合图一，参与线粒体融合与分裂的主要分子结构图。GTPase，GTP酶结构域；HR，疏水重复序列；TM，跨膜区；MTS，线粒体定位序列；METM，线粒体能量转移基序；Central，Dynamin中间结构域同源区；GED，GFP酶效应结构域。（摘自Current Topics in Developmental Biology, 2004，59：122）（二）线粒体分裂哺乳动物细胞中Drp1和Fis1是线粒体分裂的重要执行分子，另外酵母分子Mdv1/Fis2/Gag3也参与线粒体分裂。1. Drp1Drp1（Dynamin-related protein 1）也被称为DVLP（19），DLP1（22）及Dymple（39），酵母同源物为Dnm1。Drp1是一个大的GTP酶分子（见图一），其N端具有GTP酶结构域，C端为GTP酶效应结构域，中间是Dynamin同源结构域（5）。Drp1主要定位于细胞浆（18），并以多聚体（可能是四聚体）的形式存在（20）。受线粒体外膜分子Fis1的招募而转位至线粒体外膜，并且富集于线粒体潜在的分裂位点（14，17，40）。在此处，多个Drp1分子围绕线粒体形成指环结构，并通过GTP水解改变分子间的距离或角度，逐渐压缩直至线粒体断裂，产生两个独立的线粒体。线粒体分裂后，Drp1重新回到胞浆，如此循环往复（40）。超表达Drp1分子可以加速线粒体的分裂，从而产生大量片断化的线粒体（40）。而通过siRNA或基因敲除的方法抑制内源性的Drp1，则会抑制线粒体分裂，使线粒体网络化程度加强，说明Drp1是线粒体分裂的必需分子。Drp1的突变体分子K38A（位于Drp1的GTP结合位点）可以抑制线粒体分裂。超表达Drp1K38A会导致线粒体网络状结构的解体，并产生大的核周团块（18，21），应用微管解聚诱导剂Nocodazole使团块分散开后可以看到它们实际上是异常增长并彼此相互连接的线粒体（17）。超表达Drp1K38A还可以使Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠片断化的线粒体恢复为长管状（8）。Drp1只参与线粒体外膜的分裂，而不参与线粒体内膜分裂（40）。Drp1还可以参与其它膜结构的分裂，比如过氧化物酶体（41）。2. Fis1/ Mdv2Fis1是一个小的蛋白分子，通过C端的跨膜区均匀定位于线粒体外膜，其N端的TPR结构游离于胞浆，并通过该结构招募胞浆中的Drp1分子，之后共同聚集于线粒体潜在的分裂位点。Fis1缺失突变的细胞中，这种聚集明显减少（25，26），Drp1更多地定位于胞浆，线粒体分裂也受到抑制，说明Fis1是调节线粒体分裂装置的重要分子。荧光共振能量转移和免疫共沉淀已经证实Fis1与Drp1相互结合（24）。超表达人Fis1能够引起线粒体片断化（23，24），Fis1介导线粒体分裂必须依赖Drp1，因为超表达Drp1K38A可以阻断Fis1的活性。Fis1还可以与酵母Mdv1分子相互结合（42，43）。3. Mdv1/Fis2/Gag3酵母Mdv1/Fis2/Gag3分子也是参与线粒体分裂的重要分子（25，26，27，28），它的缺失突变可以增加线粒体的网络化程度。和Drp1/Dnm1一样，Mdv1主要定位于细胞浆，也有部分Mdv1点状定位于线粒体潜在的分裂位点，并与Dnm1共定位。酵母双杂交显示Mdv1与Dnm1相互结合，但结合很弱，所以免疫共沉淀无法检测到。在Dnm1缺失突变体中，Mdv1不再点状定位，而是均匀分布在线粒体外膜，说明Mdv1参与线粒体分裂必须有Dnm1分子的介导。Mdv1的C端具有七个WD重复序列，可能作为接头分子介导Dnm1与其它分子相互结合，形成大的线粒体分裂装置（26，43，44）。但是目前尚未发现Mdv1在哺乳动物的同源物。4. Rab32Rab家族分子Rab32也参与线粒体分裂（45）。Rab32是一个小的GTP酶分子，主要定位于线粒体。超表达Rab32的突变体分子T39N（位于Rab32的GTP结合位点）可以引起线粒体的异常融合。总结线粒体分裂模式（见图一B）：线粒体外膜分子Fis1/ Mdv2招募胞浆中的Drp1，再结合Mdv1/Fis2/Gag3以及其它一些分子，形成大的分裂装置；Drp1的多聚体指环结构逐步缩紧，线粒体一分为二。图二，线粒体融合与分裂的模式图。A，线粒体融合；B，线粒体分裂。（摘自Nature Reviews Molecular Cell Biology，2005，6：658）（三）线粒体融合目前已知的线粒体融合执行分子主要是Mfn1/2，另外OPA1和酵母分子Ugo1也参与线粒体融合。Mfn即线粒体融合蛋白（Mitofusin），在哺乳动物有两个分子，Mfn1和Mfn2，二者具有80%的相似性，其酵母同源物只有一个，即Fzo1。Mfn1/2分子N端具有GTP酶结构域，C端有跨膜区，跨膜区两侧各有一个疏水区，类似于Coiled-coil（5）（见图一）。Mfn1/2表达谱非常广泛，均匀定位于线粒体外膜（8，29，30）。Mfn1/2在线粒体融合过程中发挥重要作用。Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠由于线粒体融合效率下降而导致线粒体片断化，线粒体的移动能力减弱，胚胎发育迟缓并且在妊娠中期胚胎死亡；而如果将Mfn1和Mfn2基因同时敲除，则小鼠胚胎发育迟缓更加明显，胚胎死亡也更早（8）。Mfn1和Mfn2基因敲除小鼠的线粒体形态也具有明显的差别：Mfn1基因敲除后线粒体成小球形或短管状；而Mfn2基因敲除后线粒体形态不一，有大有小（8）。Mfn1基因敲除小鼠如果重新表达Mfn1基因，片断化的线粒体将恢复为长管状，如果重新表达Mfn2基因，也会有明显的的恢复，但程度不如重新表达Mfn1基因；Mfn2基因敲除小鼠则与之相反；Mfn1/2的这种功能必须依赖其GTP酶结构域。由此可见，Mfn1和Mfn2是线粒体融合的必须基因，Mfn1和Mfn2的功能有一定的重叠，但又有不同之处（8）。然而，在正常的MEF细胞中超表达Mfn1或Mfn2并不能够使其线粒体增长或增加线粒体的网络化程度。Drp1K38A由于抑制线粒体分裂，也可以使Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠片断化的线粒体恢复为长管状，而Mfn1的突变体分子K88T和Mfn2的突变体分子K109A则几乎丧失了这种功能（8）。Mfn1/2超表达实验结果比较复杂。超表达人Mfn1或Mfn2可以引起明显的线粒体核周聚集（9，29，30，31）。为什么会这样呢？第一种解释是Mfn1/2引起的线粒体核周聚集与线粒体融合无关，因为实验显示Mfn2引起的线粒体核周聚集不依赖其GTP酶结构域（31），而且据报道，很多与融合无关的线粒体膜分子超表达都可以引起线粒体聚集（46）。另一种解释是因为在线粒体融合过程中Mfn1/2具有介导线粒体结合的作用，所以过量表达时导致线粒体聚集，但是奇怪的是，超表达小鼠Mfn1或Mfn2则不能够引起线粒体核周聚集（8）。另外，Legros报道只有高表达量的Mfn1才能够引起线粒体核周聚集（9），Santel报道Mfn1引起线粒体核周聚集成葡萄样（29）。Mfn1/2两次跨膜于线粒体外膜（30，47），均匀分布，N端的GTP酶结构域与C端的coiled-coil结构域都向着胞浆，两个跨膜区中间的部分位于膜间隙，并介导内外膜的连接，这种连接对于Mfn1/2的功能非常重要，酵母的Fzo1如果在该区域突变，线粒体会发生片断化（47）。线粒体融合时，Mfn1/2聚集到融合位点（30），两个线粒体的Mfn1/2通过Coiled-coil结构域相互结合成同源或异源多聚体（见图一A）（48），此过程依赖于GTP水解作用（49）。这是线粒体融合的第一步，接下来线粒体融合是如何完成的还不清楚，可以肯定的是GTP酶分子OPA1（Optic atrophy 1）参与了这个过程，OPA1定位于线粒体膜间隙及内膜，其酵母同源物是Mgm1。通过siRNA抑制OPA1表达可以引起线粒体片断化（50）。然而OPA1的功能研究比较困难，因为它有八个剪切体，在不同的细胞中表达不同（51，52）。人OPA1突变可以引起常染色体显性遗传病视神经萎缩（34，35）。酵母的线粒体外膜分子Ugo1也是参与线粒体融合的重要分子（38，53，54），但是该分子在哺乳动物的同源物尚未发现。（四）线粒体内膜线粒体内膜比较难于研究，到目前为止对于内膜的认识也比较少。线粒体内膜（包括嵴）也是动态变化的（55），但我们还不太明白线粒体内膜是如何融合分裂以及内外膜是如何协调的。多数情况下，内膜的分裂与外膜是同步的，但在某些情况下，即使外膜没有发生分裂，内膜也会分裂（40，56），比如Labrousse发现在线虫，Drp1的siRNA可以抑制线粒体外膜分裂，但却不影响内膜（40），这说明内膜具有独立的分裂机制。Florence的研究指出线粒体内膜融合也与外膜有很大差异（57）。酵母分子Mgm1可能参与内膜融合（37）。线虫分子Mdm33参与介导线粒体内膜的分裂（58），但该分子在哺乳动物的同源物尚未找到。图三，线粒体的动态学变化。（摘自Current Topics in Developmental Biology, 2004，59：131）三、线粒体融合分裂与细胞凋亡线粒体在细胞凋亡过程中的核心作用已经得到广泛的认可，这里不再赘述。然而近几年的大量研究显示，线粒体的融合分裂与细胞凋亡也是密切相关的（4），凋亡早期线粒体网络往往发生明显的片断化；线粒体形态的调控分子参与了细胞凋亡，调控凋亡的分子也会明显改变线粒体的形态。大量研究显示，在凋亡过程中，线粒体形态发生明显的片断化（59，60，61，62，63，64）。凋亡早期Drp1会从胞浆转位到线粒体成点状聚集（59，65，66），线粒体片断化也发生在凋亡早期，大概与Bax从胞浆转位到线粒体同时，早于caspase活化（59，63，67，68）。超表达Drp1K38A不仅可以抑制线粒体分裂，而且可以抑制或减慢caspase活化及细胞凋亡（59，65，66，69）。另外Karbowski在实验中发现，使用STS 诱导COS-7或HeLa细胞凋亡时，Bax从胞浆转位到线粒体并与Drp1共定位，Drp1的siRNA或超表达Drp1K38A不能抑制Bax转位，却可以抑制线粒体片断化及细胞凋亡（69）。由此可以看出，Bax转位到线粒体后，通过Drp1使线粒体片断化，释放细胞色素C，最终导致细胞凋亡；而Bax在其中也可能参与形成线粒体分裂复合物，因为超表达Bax可以明显促进STS诱导线粒体片断化（59），但Bax是如何参与线粒体分裂的还不清楚。超表达介导线粒体分裂的分子Drp1或Fis1可以促进线粒体分裂，同时诱导细胞凋亡，而抑制Drp1或Fis1则可以抑制凋亡（23，64）。与此相一致的是，超表达介导线粒体融合的分子Mfn1/2或OPA1可以促进线粒体融合，同时抑制凋亡，而抑制Mfn1/2或OPA1则可以促进凋亡（50，64，66）。这些都说明线粒体融合分裂的调节分子也参与了凋亡过程。所以我们可以得出这样的推论，线粒体分裂是某些细胞凋亡的一个中间环节，其理由有：第一，很多细胞凋亡过程中都发生线粒体片断化，而且早于caspase活化；第二，很多时候，Drp1和Fis1是细胞凋亡所必需的，抑制它们的活性可以阻止或延缓细胞凋亡；第三，超表达Drp1或Fis1可以诱导细胞凋亡，超表达Mfn1/2可以抑制细胞凋亡；第四，细胞凋亡时Bax与Drp1共定位于线粒体潜在的分裂位点。然而，线粒体分裂与细胞凋亡也不一定是必然相关的。超表达Fis1一方面诱导线粒体分裂片断化，另一方面也会引起细胞色素C释放及细胞凋亡。但是同时超表达Drp1K38A，可以抑制线粒体片断化及细胞色素C释放，而细胞凋亡不会受到抑制；而同时超表达Bcl-xL可以抑制细胞色素C释放及细胞凋亡，却不能抑制线粒体片断化（23）。这说明Fis1诱导的细胞凋亡不依赖于线粒体片断化，具体机制尚有待研究。线粒体片断化也可能是凋亡的一个后果，因为一些实验表明线粒体片断化明显晚于膜电位下降（70）。线粒体片断化也可能是线粒体功能代偿的一种表现，而不继发凋亡（4）。而对于依赖于Ca2+流动的凋亡信号，线粒体片断化还可以抑制细胞凋亡，因为片断化的线粒体会阻断该信号（71）。由此可以看出，线粒体动力学与细胞凋亡的关系非常复杂，线粒体断裂可能介导凋亡，可能与凋亡无关，也可以抑制凋亡，这可能与不同的凋亡信号传导途径有关。四、总结与展望随着科研手段的进步和科研成果的积累，我们对线粒体有了新的认识。教科书上那种对于线粒体形态的静态描述已经略显片面，高度动态的三维网络状的线粒体已经摆在我们面前，并且更具生物学优势。线粒体融合与分裂是调节线粒体形态的主要方式，持续发生的线粒体融合与分裂造就了变化频繁的线粒体。线粒体的动态变化与细胞凋亡密切相关，互为因果，这也使得线粒体在细胞凋亡中的作用更加突出而复杂。虽然已经发现了一些调控线粒体形态的重要分子，但我们对于线粒体融合与分裂分子机制的认识还处于起步阶段。线粒体内外膜结构差异很大，彼此之间的精确协调非常重要，而目前对于线粒体内膜的研究还很少。现在研究线粒体动态学主要还是在活细胞内，如果能够建立细胞外系统，用生物化学的方法分步骤地研究线粒体融合与分裂，就能够得到更为明确的结果。通过酵母遗传学分析发现了很多线粒体动力学的调控基因，其中一些重要的分子如Mdv1，UGO1等，它们在哺乳动物的同源物还没有找到，单纯生物信息学的方法可能已经不足以解决这个问题。基因敲除小鼠动物模型的建立也是线粒体动力学研究的重要手段。线粒体融合分裂与细胞凋亡的关系也需要更加深入系统的研究。参考文献1. 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