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ESBL的检测、分型及产ESBL菌药敏分析中国抗生素杂志 2000年第3期第25卷 论著作者：穆新林何礼贤周昭彦周春妹贾漫林胡必杰瞿介明单位：穆新林(蚌埠医学院附属医院呼吸科)；何礼贤周昭彦周春妹贾漫林胡必杰瞿介明（上海医科大学呼吸病研究所上海医科大学中山医院肺科，上海200032）关键词：超广谱-内酰胺酶；肺炎克雷伯氏菌；大肠埃希氏菌摘要采用双纸片试验、等电聚焦电泳及微量稀释法对临床标本中分离出的肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌中的产ESBL菌的流行及产ESBL菌对12种抗菌药物敏感情况进行研究。1998年3月1998年10月共分离出肺炎克雷伯氏菌216株、大肠埃希氏菌318株，从中筛选出产ESBL菌77株，其中肺炎克雷伯氏菌59株(27.3%)，大肠埃希氏菌18株(5.7%)。产ESBL菌所产-内酰胺酶以pI7.6的酶为主，其次是pI8.2的酶。产ESBL菌在医院内分布广泛，27个病区中23个有产ESBL菌检出。产ESBL菌对-内酰胺类抗生素均有较高的MIC，对环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星的耐药率也达40.3%、68.8%、35.1%，仅亚胺培南的MIC较低，敏感率达100%。Detection,identification of ESBL and antibacterial susceptibility test of ESBL-producing strainsMu Xinlin，He Lixian，Zhou Zhaoyan，Zhou Chunmei，Jia Manlin(Institute of Respiratory Disease of Shanghai Medical University,Department of Respiratory Diseases of Zhongsan Hospital)ABSTRACTTo study the epidemiology of ESBL producing strains in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolated from clinical specimen and susceptibility of ESBL-producing strains to 12 antibiotics,double disk test,isoelectric focusing and broth microdilution method were used.Results showed that 216 Klebsiella pneumoniae and 318 Escherichia coli were isolated during Mar.1998 to Oct.1998,from which 77 ESBL-producing stains were detected,including 59 Klebsiella pneumoniae,18 Escherichia coli.-lactamase of isoelectric point(pI) 7.6 was the main enzyme producing by ESBL-producing stains,followed by -lactamase of pI8.2.ESBL-producing stains were widely distributed in our hospital.ESBL-producing stains were isolated from 23 wards.ESBL-producing strains had higher MICs to all -lactams.Resistance rate of ESBL-producing strains to ciprofloxacin,gentamicin and amikacin was 40.3%,68.8% and 35.1% respectively.ESBL-producing strains had lower MIC to imipenem.KEY WORDSExtended-spectrum -lactamase；Klebsiella pneumoniae；Escherichia coli超广谱-内酰胺酶(Extended-Spectrum -lactamases，ESBL)是一类能够水解青霉素类、头孢菌素类及单环类抗生素的-内酰胺酶，其活性能被某些-内酰胺酶抑制剂抑制。自1983年在德国首次发现ESBL以来世界各地均有产ESBL菌流行及暴发感染的报道。因其底物谱广、传播速度快而引起广泛关注。近年来随着第三代头孢菌素在上海地区的广泛使用，相应的耐药菌逐年增加，因此考虑本地区存在产ESBL菌的流行。本研究对我院临床标本中分离出的肺炎克雷伯氏菌及大肠埃希氏菌产ESBL情况进行检测，以初步了解本院产ESBL菌的流行情况，同时测定产ESBL菌对临床常用抗生素的敏感性。1材料1.1细菌1998年3月至1998年10月从临床标本中分离出的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌(剔除重复菌株)，用于产ESBL菌检测。产-内酰胺酶参考菌株由美国Labey Hitcbock医疗中心Jacoby GA博士赠送，用于-内酰胺酶等电点测定。细菌产酶情况见表1。1.2主要仪器高速冷冻离心机为德国Hermle公司产品，ECPS3000高压电泳仪为瑞典Pharmacia产品，DYY-36型等电聚焦电泳槽为北京六一仪器厂产品，-70冰箱为美国Forma Scientific公司产品，-20冰箱为美国ScienTemp公司产品。1.3培养基及试剂MH琼脂由中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心提供，胰蛋白胨、酵母粉为英国Oxoid公司产品；丙烯酰胺为瑞典Pharmacia公司产品，N，N甲叉双丙烯酰胺为Serva产品，两性电解质载体(Ampholine)为瑞典Pharmacia产品，硝基噻吩(Nitrocefin)英国Oxoid公司产品。细菌生化鉴定板24K-GNB1型为宁波托普生物技术公司产品。表1参考菌株产酶情况细菌质粒-内酰胺酶等电点E.Coli j53R1TEM-1pI5.4RP4TEM-2pI5.6PCFF04TEM-3pI6.3PMG226TEM-6pI5.9PIf100TEM-7pI5.4PMG223TEM-10pI5.57PMG224TEM-12pI5.25PMG225TEM-26pI5.58R1010SHV-1pI7.6PMG229SHV-2pI7.6PUD18SHV-3pI7.0PUD21SHV-4pI7.8PAFF2SHV-5pI8.2K.pneumoniae 26336TEM-9pI5.591.4抗生素头孢他啶(30mg/L)、头孢噻肟(30mg/L)、头孢曲松(30mg/L)、阿莫西林+克拉维酸(20/10mg/L)抗生素纸片为北京天坛药物生物技术开发公司产品，氨曲南(30mg/L)纸片为英国Oxoid公司产品。HZ-定量细菌药敏测试板GNB-2型为宁波托普生物技术公司产品。2方法2.1双纸片试验筛选产ESBL菌1将临床标本中分离出的肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌接种MH平板，35培养过夜。挑取单个菌落制成浓度为1×108CFU/ml的细菌悬液，无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于MH平板，放置15min后贴抗生素纸片。阿莫西林+克拉维酸纸片置于平板中心，头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶及氨曲南纸片均匀放置在阿莫西林+克拉维酸纸片四周，4种抗生素纸片与阿莫西林+克拉维酸纸片中心间距为20mm。35培养过夜后观察结果。如外周纸片中有1个纸片与阿莫西林+克拉维酸之间的抑菌圈扩大或2纸片间出现抑菌带则该菌产ESBL。2.2-内酰胺酶的提取将收集到的临床产ESBL菌株及14株参考菌株接种MH平板，35培养1620h，刮取2030个菌落置于1ml 20mmol/L PBS(pH7.0)中振荡混匀，-70冰箱中反复冻融45次，4 13500r/min离心1h，取上清液即为-内酰胺酶粗提液，置-20冰箱保存备用。2.3等电聚焦法测-内酰胺酶的等电点2参照Matthew等建立的方法，对提取出的-内酰胺酶行等电聚焦电泳。以参考菌株中提取的已知等电点的-内酰胺酶为标准等电点蛋白制作标准曲线，根据待测酶与已知酶在聚丙烯酰胺凝胶上的相对位置，确定待测酶的等电点。2.4药敏测试检测出的产ESBL菌重新分离培养后以终浓度1×105CFU/ml，每孔100l接种于HZ-细菌药敏测试板，于35培养1824h后观察结果。用大肠埃希氏菌ATCC25922、金葡球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控。3结果3.1双纸片试验筛选产ESBL菌结果1998年3月至1998年10月中山医院临床微生物检验中心共分离出肺炎克雷伯氏菌216株、大肠埃希氏菌318株，用双纸片试验(抗生素纸片中心间距20mm)共筛选出产ESBL菌77株，其中肺炎克雷伯氏菌59株(检出率27.3%)，大肠埃希氏菌18株(检出率5.7%)。细菌标本构成见表2。3.2临床菌株中ESBL的初步鉴定(表3)用等电聚焦法对分离出的77株细菌所产-内酰胺酶进行等电点测定，结果表明77株产ESBL菌所产-内酰胺酶以pI7.6的酶为主，共29株，其次是pI8.2的酶16株、2种酶同时存在的有7株。pI8.0的酶12株，目前发现的SHV类ESBL中尚无与此相同等电点的酶。此外尚有pI5.4、pI5.6、pI7.1、pI8.4、pI8.5、及pI8.8的酶，数量相对较少。肺炎克雷伯氏菌中最多见的酶是pI7.6的酶(26/59)，其次是pI8.2的酶(14/59)。有7株肺炎克雷伯氏菌同时产pI7.6和pI8.2两种酶，另有7株产pI8.0的酶。大肠埃希氏菌中最常见的是pI8.0的酶(5/18)，其次是pI7.6(3/18)的酶。表2产ESBL菌标本来源构成标本来源标本数细菌(株)肺炎克雷伯氏菌大肠埃希氏菌下呼吸道标本39390尿1239胆汁1183伤口分泌物422血101其它1073表377株产ESBL菌中-内酰胺酶的等电点等电点产酶细菌(株)合计肺炎克雷伯氏菌大肠埃希氏菌pI5.9123pI7.1011pI7.626329pI8.07512pI8.214216pI8.4022pI8.5202pI8.8011pI5.4+5.9011pI5.6+8.8011pI7.6+8.2707pI7.6+8.8101pI8.0+8.21013.3产ESBL菌在医院内的分布本院共有27个病区，其中23个病区均有产ESBL菌检出，尤以呼吸科及RICU检出的产ESBL菌最多(17株)，且均为肺炎克雷伯氏菌，普外科所在的4个病区15株、血液科5株、SICU 4株，其他病区检出的产ESBL菌相对较少，仅12株。门诊标本中共检出8株产ESBL菌，其中肺炎克雷伯氏菌5株、大肠埃希氏菌3株。3.4产ESBL菌药敏结果(见表4)4讨论自1983年在欧洲首次发现ESBL以来，目前发现的TEM类ESBL已有50多种，SHV类ESBL12种。肺炎克雷伯氏菌是ESBL的主要携带菌，其次是大肠埃希氏菌3。近年来随着广谱以及超广谱-内酰胺类抗生素在上海地区广泛使用，临床分离出的革兰氏阴性杆菌对此类抗生素的耐药率逐年增加，因此考虑在本地区存在产ESBL菌的流行。本次研究结果表明肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌中产ESBL菌的检出率分别为27.3%、5.7%，产ESBL菌在院内分布广泛。由此进一步证实了以上推论。与文献中报道的10%30%的检出率相比，产ESBL菌在本地区的流行情况可能已相当严重。对77株产ESBL菌所产-内酰胺酶分型表明，pI7.6和pI8.2的酶出现频率最多，因与SHV-2、SHV-7、SHV-8及SHV5的的等电点一致，认为是SHV型ESBL4。值得注意的是pI8.0的酶出现频率较高，而目前已知的SHV型ESBL中尚无相同等电点的酶，此酶是否为新的酶尚需进行酶的生化性质及基因定位等详细研究后方可定论。表477株产ESBL菌对12种抗菌药物的药敏情况抗生素MIC50MIC90耐药菌 株数耐药率* (%)环丙沙星1163140.26庆大霉素16165368.83阿米卡星16642735.06氨苄西林舒巴坦32/1632/166787.01替卡西林克拉维酸1281287192.21哌拉西林12812877100.00头孢唑林32326989.61头孢呋肟32326888.31头孢哌酮64646077.92头孢他啶32324963.64头孢曲松64646381.82亚胺培南0.5400* 折点按NCCLS 1998年药敏破折点标准判断。产ESBL菌多数为医院内获得，尤其是ICU中分离率更高。本院27个病区中有23个病区分离到产ESBL菌，其中又以呼吸科病房及RICU、普外科的4个病区以及SICU、血液科中检出的产ESBL菌最多，可能与这些科室抗生素消耗量大，在抗生素选择压力下容易诱导产生产ESBL菌有关。NCCLS认为产ESBL菌对青霉素类、头孢菌素类及单环类抗生素均耐药，尽管此类药物体外试验可能有效，而在治疗过程中出现耐药。ESBL编码质粒往往同时携带氨基糖苷类、磺胺类抗菌药物的耐药基因5，6。因而产ESBL菌多表现多重耐药。本研究同样发现除亚胺培南外，77株产ESBL菌对-内酰胺类抗生素均有较高的MIC，对环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星的耐药率也达40.3%、68.8%、35.1%，仅亚胺培南的MIC较低，敏感率达100%。亚胺培南具有超广谱、高效抗菌活性，除金属-内酰胺酶外对几乎所有的ESBL高度稳定。一项多中心研究显示产ESBL肺炎克雷伯氏菌菌血症患者接受亚胺培南治疗的死亡率23%，而使用其他抗生素治疗的患者死亡率是42%7。目前认为亚胺培南是治疗产ESBL菌感染的最佳选择，产ESBL菌重症感染的患者应首选亚胺培南治疗。穆新林,男,生于1969年,硕士,主治医师.穆新林(蚌埠医学院附属医院呼吸科)参考文献1，Thomson K S,Sanders C.Detection of extended-spectrum -lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double-disk and three-dimensional test.Antimicrob Agents Chemother，1992；36：18772，Matthew M,Harris A M,Marshall M J,et al.The use of analytical isoelectric focusing for detection and identification of -lactamases.J Gen Microbiol，1975；88：1693，Sirot D.Extended-spectrum plasmid-mediated -lactamases.J 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