桃仁提取物体外抑制血管瘤内皮细胞增殖的研究项目申报书.doc

广东省大学生创新实验项目申 报 书学校名称 广州中医药大学 计划项目名称 桃仁提取物体外抑制血管瘤内皮细胞增殖的研究 计划项目编号 项目来源 （）自主立题 （）教师指导选题计划项目负责人 陈胜贤 通讯地址 广州市白云区机场路12号广州中医药大学学生宿舍1栋302 邮政编码 510405 填写日期 2013 年11月28日 广东省教育厅编制二一三年五月申请者的承诺与成果使用授权 本人自愿牵头申报广东省高等学校大学生创新实验项目建设项目。认可所填写的2010年度广东省高等学校大学生创新实验项目申报表（以下简称为申报书）为有约束力的协议，并承诺对所填写的申报书所涉及各项内容的真实性负责，保证没有知识产权争议。项目申请如获准立项,在专业建设过程中，接受广东省教育厅或其授权（委托）单位、以及本人所在单位的管理，并对以下约定信守承诺： 1.遵守相关法律法规。遵守我国著作权法和专利法等相关法律法规；遵守我国政府签署加入的相关国际知识产权规定。2.遵循学术研究的基本规范，恪守学术道德，维护学术尊严。研究过程真实，不以任何方式抄袭、剽窃或侵吞他人学术成果，杜绝伪注、伪造、篡改文献和数据等学术不端行为；成果真实，不重复发表研究成果；维护社会公共利益，维护广东省高等学校大学生创新实验项目项目的声誉和公信力，不以项目名义牟取不当利益。3.遵守广东省高等学校大学生创新实验项目有关管理规定以及广东省财务规章制度。4.凡因项目内容、成果或研究过程引起的法律、学术、产权或经费使用问题引起的纠纷，责任由相应的项目承担人员承担。5.项目立项未获得资助或获得批准的资助经费低于申请的资助经费时，同意承担项目并按申报预期完成研究建设任务。6.同意广东省教育厅或其授权（委托）单位有权基于公益需要公布、使用、宣传申报书内容及相关成果。项目主持人（签章）：_ 年 月 日填 写 须 知一、大学生创新性实验计划申报书请按顺序逐项填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。空缺项要填“无”。二、格式要求：表格中的字体小四号仿宋体，1.5倍行距；需签字部分由相关人员以黑色钢笔或水笔签名，均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。 三、申请参加大学生创新实验项目团队的人数含负责人在内不得超过5人。四、计划项目先由所在学校进行组织初审后，推荐上报的计划项目由学校分管领导在申报书上签署意见、签字并加盖公章后，一式两份（均为原件），报送省教育厅高等教育处。五、申报过程有不明事宜，请与教育厅高教处联系和咨询。学校名称广州中医药大学计划项目名称桃仁提取物体外抑制血管瘤内皮细胞增殖的研究理工科()文科( )计划项目负责人姓名陈胜贤性别男民族汉出生年月1992年4月学院及专业第一临床医学院中西医临床医学专业所在年级2011级手机号码18825160822联系电话18825160822E-mail121792031计划项目组成员姓名性别出生年月学院/系别专业年级签字黄锦菁男1991.8第一临床医学院中西医临床本科2011杨泽填男1994.12第一临床医学院中西医临床本科2011杨才志男1992.8第一临床医学院中西医临床本科2011潘思敏女1992.10第一临床医学院中西医临床本科2011指导教师情况姓名吴绍锋性别男民族汉出生年月1979.05专业/职称/职务实验师手机号码13760888019联系电话/传真39358291E-mailWushaofeng一、前期基础（1000字以内）（研究成员的知识条件，研究兴趣，相关经历及开展本项目的基础）1.知识条件：科研小组成员均为本科大三年级的学生，已修习完成中药学、医学免疫学与病原生物学、分子生物学、中医基础理论、中医诊断学、生物化学、生理学、组织学与胚胎学、人体解剖学、药理学、病理学、病理生理学等基础课程，具有构建探索性实验研究的知识基础，同时有一位实验经验丰富的指导老师指导实验计划，具有自主立题并完成实验的条件。2.研究兴趣：科研小组成员均是中西医临床专业的学生，热爱研习中医的同时注重临床观察以及中西方医学相结合，同时对中医药与现代科学的结合有浓厚的兴趣，有信心在中医药治疗现代医学疑难病症方面有所研究。3.开展本项目的基础：本大学实验室具有本项目实验所需的相关仪器设备，有一定的资源保障。而且重要的是，有探索精神以及坚持不懈的奋斗精神，相信自己可以很好的完成这个科研项目。4.本项目细胞的培养和相关检测将于广州中医药大学三元里校区基础实验室进行，有多间实验室可供细胞实验，同时有电泳仪、CO2培养箱、倒置显微镜、电子分析天平、超滤过滤器、酶标仪、流式细胞仪、台式低速离心机、24 孔和96孔细胞培养板、移液枪、超净工作台等实验结果检测仪器，可保证实验结果顺利检测。二、计划项目实施思路（3000字以内）1研究意义与目的，同类研究工作国内外研究现状与存在的问题等1 国内外同类研究现状与存在的问题（研究背景）： 1）血管瘤概述 血管瘤是指发生于血管组织的一种良性肿瘤，Mulliken等1根据内皮细胞增殖特点分为两种，一种系胚胎发育过程中血管发育失常，血管过度发育或分化异常导致的错构瘤，一种系因血管内皮细胞异常增殖产生的真性肿瘤。血管瘤的形成都是血管生成因子和抑制因子不平衡导致血管生成无节制造成的。血管瘤是小儿最常见的良性肿瘤, 新生儿患病率为1.1 %3.8 % , 1 岁时升至12 % ,体重低于1000g的早产儿发病率高达22.9%，血管瘤大多数（71%）位于头颈部，位置比较表浅，也有少数发生在黏膜、肌、骨组织和内脏，不仅影响美观，还影响生理功能，甚至危及生命2，虽然部分血管瘤可自行消退, 但仍有不能退化的血管瘤持续发展, 产生一系列并发症, 如遗疡、出血、感染、损坏面容、阻塞或压迫重要组织器官、凝血机制障碍及心力衰竭等, 严重威胁患者的身心健康3。 2）血管瘤的治疗现状血管瘤种类繁多，发病机制复杂，治疗方法也各有不同，包括冷冻治疗、手术切除、放射与放射性核素治疗、血管瘤铜针疗法、激光治疗、药物治疗等4。其中手术切除和药物治疗是最常用的治疗方式。外科切除也只能治疗小面积血管瘤，且术中出血量大，术后面部外形、功能难以恢复正常，给血管瘤患者的身心健康带来极大的影响。而传统治疗药物主要包括皮质类固醇激素(如泼尼松、地塞米松、倍他米松等)、干扰素-a(IFN_a)、抗癌药物(平阳霉素、博来霉素、环磷酰胺、长春新碱)等5。自首次报道应用激素治疗血管瘤以来，激素一直是治疗重症血管瘤的一线药物。但激素仅对增生期血管瘤有效。对消退期血管瘤无效，且不良反应多(如Cushing综合症、生长缓慢、胃肠道反应、行为异常等)，长期大量应用激素治疗血管瘤还可能产生感染、肥厚梗阻性心肌病等较严重并发症。IFNa也有较多且严重的不良反应，包括发热、白细胞减少、轻度转氨酶升高等。抗癌药物对血管瘤有一定疗效。但毒性大、疗程长。这些药物治疗方法各有优缺点，但均存在不同程度的不良反应。因此，寻找对血管瘤安全有效的治疗药物一直是临床医师多年来的愿望6。3）VEGF在血管瘤形成的意义血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管瘤形成中具有重要作用7。VEGF是一种糖基化分泌性多肽因子，亦称血管渗透因子，可使内皮细胞增殖、迁移，提高血管通透性，促进新生血管和基质细胞生长。增殖期血管瘤内皮细胞高表达VEGF8。3）桃仁提取物的药效研究现状桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica （L.） Batsch 或山桃 Prunus davidiana （Carr.）Franch.的干燥成熟种子。果实成熟后采收，除去果肉及核壳，取出种子，晒干。最早出自本草经集注。有活血祛瘀，润肠通便等功效，用于经闭，痛经，癜瘕痞块，跌扑损伤，肠燥便秘9名医别录记载：“泄滞血，又去血中之热。”现代研究表明桃仁具有抗凝血，改善血流动力学，抗炎、抗过敏、抗肿瘤等作用10最新药理研究表明桃仁的主要化学成分为苦杏仁甙(Amygdalin),其他化学成分包括各种油脂、挥发油、糖类、蛋白质、氨基酸、维生素B1、三油酸甘油酯、苦杏仁酶、尿囊素酶、精油及微量元素Fe、Mn、Mg等。1112目前有研究表明核桃仁醇提物对相关癌细胞生长有抑制作用13，但是现阶段桃仁提取物对血管瘤细胞生长相关作用研究较少。2 研究目的与意义本研究采用荧光显微镜检、生长曲线法、DNA 凝胶电泳和流式细胞学、免疫印迹法、MTT法等 13方法，观察桃仁提取物对体外血管瘤生长状况的影响，探讨桃仁提取物治疗血管瘤的机制。本课题将为揭示桃仁提取物治疗血管瘤提供一定的科学实验依据，对今后桃仁提取物治疗血管瘤的临床应用以及相关药品的开发工作具有重要的意义。参考文献1 Mulliken JB，Glowacki J. Hemangiomas and vascular malfaormations in infants and children: a classification based on endothelial characteristicsJ.Plast Reconstr Surg，1982，69（3）：412-4222 王延安. 血管瘤发病机制的研究进展J. 中国口腔颌面外科杂志, 2005, 3(1): 76-79 3 徐泉，李恭才.血管瘤的研究现状J.中级医刊,1996,31 (3):12-14.4 Liu WY Current Diagnosis and Treatment in Children withHemangiomaJJournal of Applied Clinical Pediatrics，2008，23(11)：8058085George ME, Sharma V, Jacobson J, et al. Adverse effects of systemic glucosteroid therapy in infants with hemangiomas. Arch Dermatol, 2004, 140(8):963-969. 6何世英，张杰，丁劲松.普萘洛尔治疗血管瘤的作用机制及其应用研究进展J.中南药学,2011,9(4):274-278.7Folkman J. Clinical application of research on angiogenesisJ N Engl J Med，1995，333(21)：1757-17638 常健, 周中华. 血管内皮生长因子及其受体与血管瘤增生关系的研究进展J. 实用医药杂志, 2002, 19(7).9江苏新医学院中药大辞典，下册M上海：上海人民出版社，1977：178710赵强, 李莹, 孔令升, 等. 桃仁化学成分及药理作用研究进展J. 天水师范学院学报, 2008, 28(2).11汪宁，刘青云，彭代银，等桃仁不同提取物抗血栓作用的实验研究J中药材，2002，25(6)：41412司高. 核桃仁醇提物抑制癌细胞生长相关蛋白表达的作用J. 中医研究, 2011, 24(2).13 谢家宝, 洪逊强, 刘利利, 等. 色象中药对人A375黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响J. 陕西中医, 2011, 32(3).2 研究内容及工作方案一、 研究内容桃仁提取物有效成分对血管瘤细胞的疗效及其作用机理：通过荧光显微镜检、生长曲线法、DNA 凝胶电泳和流式细胞学、免疫印迹法、MTT法等，以不同浓度的桃仁提取物作用于体外培养的血管瘤细胞，应用MTT的培养检测增殖抑制作用，流式细胞仪方法分析细胞的凋亡率并将其作对比分析。二、 工作方案1 药液配制1) 桃仁提取物用二甲基亚枫(DMSO)溶解成64mg/ml原液保存，使用时用培养液稀释成不同浓度。2) 5mg/ml溴化噻唑蓝四唑（MTT）溶液(新鲜配制):用无血清1640按5mg/ml配制MTT溶液。3) PI染液:用PBS按50g/ml PI、50g/ml RNaseA配制PI染液。2 细胞培养细胞在含体积分数为10%灭活小牛血清、1%双抗( 青霉素、链霉素) 的RPMI1640 培养基中，置37、5%CO2的培养箱内培养。在细胞八到九成满时进行0.25%的胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行试验。3 流式细胞仪方法分析细胞的凋亡率取对数生长期的细胞，用不含血清1640培养液以3 × 105/ml密度接种于12孔细胞培养板上，1.5ml/孔;培养过夜后，加入不同浓度水蛭素药液100l，使用水蛭素最终浓度为80g/ml、40g/ml、20g/ml、10g/ml，处理48 h; 收集处理后的细胞培养液至尖底离心管;加1 ml PBS缓冲液清洗1次，清洗液加入管中; 胰酶消化，加入1 ml PBS缓冲液吹打，吸入离心管; 1 ml PBS 缓冲液清洗剩余细胞1次，清洗液加入离心管;上述步骤收集于同一管中。1000r/min 离心6 min，吸去上清;用余下的液体重悬细胞加入200l预冷的70%乙醇，4避光固定30min以上;用400目筛网过滤至流式管，加入2ml PBS 清洗离心管及筛网，注入流式管中1000r/min 离心10 min，吸去上清; 用余下的液体重悬细胞。加300l含(50g/ml PI、50g/ml RNaseA)PBS缓冲液，室温避光孵育15 min。流式细胞仪分析细胞的凋亡率。4 MTT法检测增殖抑制作用用含10%的小牛血清、1%双抗( 青霉素、链霉素)的RMPI1640 培养液培养。取对数生长期的血管瘤细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为104个/孔，按4000个细胞/孔接种于96孔板的，在每孔加入100l。溶剂对照孔加入培养液，设5复孔。培养24h后，加入100l桃仁提取物稀释液使其终浓度分别为320g /ml、160g /ml、80g /ml、40g /ml、20g/ml、10g/ml和5g/ml，每个浓度设重复的5个复孔，溶剂及细胞对照孔加入100l含DMSO的1640培养液使DMSO的终浓度为0.1%，各设5复孔。培养48 h。吸出各孔内的培养液，每孔加入5mg/ml MTT 100l( 避光)，再培养4h，吸去上清液，加入150l DMSO完全显色后，振摇15 min。酶标仪上490nm波长，空白溶剂对照孔调零，测定OD值。以溶剂处理的细胞为对照组，按下述公式计算化合物对细胞的抑制率，并按中效方程计算半数抑制浓度IC50:增殖抑制率=(OD对照组OD药物组)/OD对照组×100%。5 技术路线图3拟解决主要问题 1）.体外人黑色素瘤细胞的培养 体外人黑色素瘤的培养的常用方法是A375人黑色素瘤细胞株培养，A375人黑色素瘤细胞的获取以及培养工作将是我们工作中的一个重点难点，本项目的指导老师长期从事细胞药物研究工作，实验经验丰富，操作技术娴熟，项目组成员曾做过EOMA小鼠血管内皮瘤细胞培养，有一定细胞培养经验，我们将在老师的指导下完成模型的建立。 2）.桃仁提取物的提取 选用蔷薇科植物桃的干燥成熟种子，符合2005版中华人民共和国药典一部“桃仁”项下有关规定。目前桃仁提取方法主要有3种，回流煎煮法、醇提取法、蒸馏水法。综合提取物纯度和提取难度，选用醇提取法，取桃仁150.0g，水上蒸馏30min，去皮，烘干，压榨去油，粉碎，加入索氏提取器，加入95%乙醇600Ml，提取5h，趁热抽滤提取液，两次重结晶，得苦杏仁苷粗品。经60Co照射灭菌,备用。使用前加入蒸馏水配成溶液，以正压式针芯滤器( U0.45Lm )过滤除菌。 3）.治疗作用机制的确定 通过药物对血管瘤内皮细胞本身表达VEGF、血管内皮细胞凋亡情况的影响情况确定药物具体作用机制。4研究支持条件（使用仪器或设备）本项目细胞的培养和相关检测将于广州中医药大学大学城校区基础实验室进行，有多间实验室可供细胞实验，同时有电泳仪、形态学图像分析系统、CO2培养箱、倒置显微镜、电子分析天平、超滤过滤器、酶标仪、流式细胞仪、台式低速离心机、24 孔和96孔细胞培养板、移液枪、超净工作台等实验结果检测仪器，可保证实验结果顺利检测。5预期研究成果（研究论文、设计、专利、产品、鉴定、推广应用等）通过本实验研究桃仁提取物对体外血管瘤内皮细胞凋亡的影响，弄清桃仁提取物治疗血管瘤的机制，并根据成果写成关于桃仁提取物对治疗血管瘤的作用机制的研究论文或研究报告。6项目创新之处（原始创新：重大科学发现、技术发明；集成创新：融合多种相关技术，形成新产品、新产业；引进消化吸收再创新：在引进国内外先进技术的基础上，学习、分析、借鉴，形成具有自主知识产权的新技术）引进消化吸收再创新：本实验在参考相关临床治疗案例经验总结的基础上，并查阅相关文献，希望通过开展此实验，弄清桃仁提取物治疗血管瘤的机制，为临床工作的开展或者相关药物的研发提供相关经验总结。三、计划项目管理（800 字以内）1、计划项目人员分工人员名字工作内容陈胜贤选题、撰写实验项目书、实验工作、论文撰写黄锦菁撰写实验项目书、实验工作、论文撰写杨才志实验工作、论文撰写杨泽填实验工作、论文撰写潘思敏实验工作、论文撰写2、计划项目研究时间安排（查阅资料 、选题、项目研究方案、开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、研制开发、结题、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩和成果推广等）查阅资料2013年10月选题2013年10月项目研究方案2013年10月开题报告2013年10月实验研究2014年2月至2014年5月数据统计2014年3月至2014年5月处理与分析2014年3月至2014年5月结题2014年5月至2014年12月撰写研究论文和总结报告2014年5月至2014年12月参加结题答辩和成果推广待定四、计划项目条件保障（800字以内）1、经费预算及使用计划（材料费、资料费、版面费、鉴定费、专利费等）序号经 费 开 支 科 目具 体 描 述金 额 （ 元 ）1实验经费人黑素瘤细胞9002实验经费桃仁提取物2503实验试剂经费0.25%trypsin胰酶、MTT、pen strep青链双抗等7004其他资料费、版面费等其他费用10005678以上科目预算经费合计 28502、资源保障（实验教学示范中心、科研实验室、研究所、科教实践基地、仪器设备、文献资料等）本项目细胞的培养和相关检测将于广州中医药大学大学城校区基础实验室进行，有多间实验室可供细胞实验，同时有电泳仪、形态学图像分析系统、CO2培养箱、倒置显微镜、电子分析天平、超滤过滤器、酶标仪、流式细胞仪、台式低速离心机、24 孔和96孔细胞培养板、移液枪、超净工作台等实验结果检测仪器，可保证实验结果顺利检测。3、学校经费配套及激励机制（对项目经费配套情况，对指导教师及学生的激励措施）广州中医药大学能够积极为参加广东省大学生创新实验项目提供相关实验室、技术方面工作支持，并委派相关经验丰富的实验指导老师从旁协助学生申报课题、开展实验、撰写论文等。五、指导教师意见（600字以内）1、项目研究的选题意义该课题选取了临床常用药松针，研究其降血压的机制，对临床中医用药具有重要意义。2、项目研究方案的科学性实验设计合理，具有全面的指标选择，能有效说明松针提取物调节2K1C 血管内皮舒缩因子平衡等高血压作用机制。3、项目研究方案的可行性此课题方法、指标检测技术都已经很成熟，且学校实验室具有相配套的实验设备、仪器，可行性很高，取得预期成果的可能性很大。 导师签字： 2013年 11月 28 日六、学校意见分管校长（签字） （公章）年 月 日