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L 硒甲基硒代半胱氨酸论文第35卷2007年2月分析化学(FENXI HUAXUE)研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry第2期244-246液相色谱串联质谱法定量检测青花菜中一硒甲基硒代半胱氨酸张明杜业刚林少彬杨文婕"(中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京100021)(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京100021)摘要建立了液相色谱串联质谱(LC.MS-MS)法测定青花菜中-硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)含量的方法。植物样品经沸水提取，以甲醇.1%七氟丁酸水溶液(30：70)为流动相，滤液经Waters Symmetry C。(50 mm x3.9 mm，5 m)分离，经在线电喷雾离子源(ESI)正离子化后，采用多反应离子监测方式(MRM)选择m/z 184、0一(167.0，94.9)测定SeMC。SeMC的线性范围为0-200 ms/L，准确度在96%114%之间，El内El间精密度(RSD)在4-10%内。检出限为0.1 ms/kg。结果表明：本方法高效、准确，特异性强，样品处理简单，可准确定量富硒青花菜中的SeMC。关键词三一硒甲基硒代半胱氨酸，液相色谱一串联质谱法1引言硒具有多种其它营养素不可替代的生物学功能。研究发现，人体和动物体内硒的吸收、作用效果和毒生等与摄人硒的化学形态密切相关¨J。.硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)是比硒蛋氨酸(SeMet)和亚硒酸钠具有更高生物活性的一种小分子有机含硒化合物J，可通过诱导细胞凋亡等机制发挥抑癌作用J。近年来，多种现代分析技术被尝试用于富硒生物样品中含硒化合物的鉴定和定量分析，最值得推荐的是液相色谱质谱联用技术，具有灵敏度高，专属性好，分析速度快等特点51。Finley等已运用ICP-MS技术证实富硒青花菜含有SeMC。本研究拟建立测定富硒青花菜中SeMC的液相色谱串联质谱法(LC-MS.MS)，并通过方法学考察，以获得高效、准确、特异性和实用强性的定量检测富硒青花菜中SeMC的分析技术。2实验部分2.1仪器与试剂1100高效液相色谱系统(美国安捷伦公司)；API4000三级四极串联质谱仪(美国应用生物系统公司)；Mettler AE163万分之一分析天平(美国Mettler Toledo)；VORTEX-T GENIE涡流混匀器(scientific industry)；Bamstead纯水机；acrodisc 25mm syringe 0.21xm过滤器(美国Pall公司)；电子恒温浴锅。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；99%七氟丁酸(Lancaster公司)。CH，一Se-CH一CH(NH)一COOH SeMC(美国PharmacySe公司)。实验用水由Barnstead纯水系统制备。2.2样品处理市购普通青花菜，富硒青花菜采自我国高硒地区，经洗净、阴干、切碎、60烘干后，研磨，过0.16 mm筛，采用2，3一二氨基萘荧光分光光度法测定这两种青花菜总硒含量分别为13和320 ms/kg。准确称取0.1 g样品于50 mL具塞离心管中，加入5 mL 18.2 MII cm的纯水，沸水浴加热提取1 h，期间，每隔20 min涡流混匀一次。提取液室温放置自然冷却，用0.2 Ixm滤器过滤。2.3液相色谱、质谱条件Waters Symmetry C。8色谱柱(150 mm×3.9 mm i.d.，5 Ixm)，柱温20(2。流动相：甲醇-0.1%七氟丁2006-05-06收稿；2006-10-20接受本文系国家自然科学基金(No.30471454)资助项目E-mail：.COrn第2期张明等：液相色谱串联质谱法定量检测青花菜中三一硒甲基硒代半胱氨酸245酸水溶液(30：70，V/V)。流速：500 IxL/min；进样量为10 L。ESI离子源，正离子电离方式，电离电压5500V；雾化气：高纯氮气；碰撞活化(CAD)参数为6；气帘气(CUR)20 psig；雾化气(Gs。)35 psig，辅助气(Gs)40 psig；离子源温度(TEM)：450%；扫描方式：多反应离子监测(MRM)。3结果与讨论3.1提取方法的比较及流动相的选择比较水、甲醇、丙酮和二氯甲烷等溶剂对青花菜中SeMC的提取效率。由于纯水提取效率较高，实验选择纯水作为提取溶剂。实验发现，沸水浴加热提取优于常温超声方法。考察不同比例的甲醇水溶液(70%、50%、30%和20%)作流动相的情况，比较发现，在30%甲醇条件下，SeMC在样品中与杂蜂分离较好，但峰形存在拖尾现象。流100 67'。动相中添加了少量七氟丁酸，峰形有较好改善。综合考虑分离效80J I果、分离时间，选择甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30：70，V/V)为流，J l动相。耋t-4o u9 4l。3.2色谱质谱行为，I lI l首先经Q。全扫描选择母离子，然后进行二级质谱扫描，得到t 1l ll化合物的二级质谱图(图1)。根据质谱图分析结果，选定进行50 l00一l50 200 MRM扫描的离子通道SeMC m/z 184.0一(167.0；94.9)。在选定的仪器条件下，标准溶液液相色谱图见图2a。从图2a可以看图seM的二级质谱图出，SeMC的保留时间为3.86 min,色谱行为良好。Fi。g.，。：pec mm myk an0 y3.3方法专属性普通青花菜在保留时间位置并没有检测到SeMC m/z 184.0-,(167.0；94.9)的离子对色谱峰，表明普通青花菜基质不会干扰采用LC-MS-MS技术检测富硒样品中SeMC的含量(见图2b)。富硒青花菜样品中SeMC保留时间和标准品一致，加标后，保留时间不变，信号增高，见图2c和2d。3.86 l2 34 t/min bl 23 4t/min l2 34 t/min l2 34 t/min图2标准溶液(a)、普通青花菜(b)、样品(c)和加标后样品(d)SeMC的MRM质量色谱图Fig。2 Liquid chromatograms of SeMC for standard solution(a)common cauliflower(b)unknown sample(c)the spiked sample(d)by multiple reactions monitoring(MRM)scan mode 3.4线性关系和检出限在普通青花菜中添加不同量的标准溶液，按照2.3和2.4所述样品前处理方法及仪器条件进行测定，以样品的浓度(，g/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标(外标法)，根据离子对响应强度，选择SeMC m/z 184.0/94.9作为定量分析的离子对，获得标准曲线回归方程(=6)为：SeMC(184.0/94.9)：Y=1940x 4-395(r=0.9993)。结果表明，SeMC在0200 g/L的浓度范围内线性关系良好。采用信噪比S/N=3来计算，得到本方法的最低检出限为SeMC 0.1 mg/kg。采用信噪比S/N=10来计算，得到本方法的最低定量浓度为SeMC 0.5 mg/kg。_=分析化学第35卷3.5实际样品分析取普通青花菜样品0.1 g，按照前面所述方法配制3个浓度的样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定6 d，并与标准曲线同时进行。求算回收率和精密度，结果见表1。表1 SeMC的回收率和精密度Table 1Recovery and precision of SeMC我国高硒地区采集的青菜花，经处理后用液相色谱一串联质谱联用仪进行分析测定，计算SeMC的含量为7.91 mg/kg。研究结果表明：LC.MS.MS通过阳离子对的选择，能有效排除含有大量杂质的植物提取液基质的干扰，在有效分离含硒化合物的同时，能在线完成富硒青花菜样品中SeMC中的选择性检测。此外，Finley等发现SeMC为青花菜的主要含硒化合物，本实验中富硒青花菜样品总硒含量为320 mg/kg，而测得的SeMC含量仅为7.91 mg/kg，表明在高硒地区采集的青花菜中SeMC并非主要硒种类，有必要结合HPLC.ICP.MS等其它检测技术j，进一步研究采集的富硒青花菜中硒的主要形态。References 1Ip C.Agric.Food Chem.，2000，48(5)：20622070 2E1一Bayoumy K，Sinha R.Mutation Research，2004，551：181197 3Block JE.Agric.Fo od Chem.，2001，49：458470 4Ip Cand Dong Y.Anticancer Res，2001，21(2A)：863867 5Uden PC，Boakye HT，Kahakachchi C，Tyson JF.Chromatogr.A，2Oo4，1050(1)：8593 6Finley JW，Davis CD.BioFactors，2001，14：191196 Quantitaion of Methylselenocysteine in Broccoli Powder with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Zhang Ming，Du Ye-Gang，Lin Shao-Bin，Yang Wen.Jie(National Institutefor Nutrition and Food Safety，Environmental Health and Related Product Safety，Beijing 100021)Abstract AHPLC-MS/MS method was established for the determination of methylselenocysteine(SeMC)content in broccoli powder.Broccoli powder samples were extracted with deionized water at IO0C for 1hour，filtered through 0.2 lxm filter，and then separated on Waters Symmetry Cl8(150 mm x3.9 mm，5 p,m)column with methanol一0.1%heptafluorobutyric acid(30：70，)as mobile phase，at aflow rate of 500 L/min.E lectrospray ionization source(ESI)was applied and operated in positive ion mode，and multipie reactions monitoring(MRM)mode was adopted.SeMC was quantified by monitoring the ion transition of m/z 184.0_(167.0；94.9).The linear calibration curves were obtained over the concentration range of 0-200 m【g/L for SeMC.The lowest detection limit(S/N=3)was 0.1 mg/kg for SeMC.The spiking recovery of SeMC varied between 96%一1 14%with in 10%of inter-and intra-day precision(RSD).Keywords Methylselen0cysteine，high perform ance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(Received 6May 2006；accepted 20 October 2006)
