小动物活体成像操作说明手册.doc

第七部分 操作7.1准备程序图7.1麻醉准备程序在开始麻醉程序之前，做一些准备程序可以帮助实验顺利进行，请参看图7.11） 请把不用的出气口用特制的黑色橡胶塞塞住。（PN10168）2） 把锥形通气口的位置对准。3） 在麻醉程序开始前对照图片确保出气支管位置正确。4） 确认气体循环管没有打结阻塞和松动。5） 确认蒸发器内有足够的乙氟醚（Isoflurane），如果需要注入请参看下一节。7.2蒸发器注入程序警告：不能在正在进行氧气供应时向蒸发器内灌注液体乙氟醚（Isoflurane）。注入前，关闭供应打开前面板上两个阀门开关监视流量计。当流量球在指示管中的底部保持不动时说明已无气体流动，此时可以进行注入。警告：只有当蒸发器控制旋钮处于关的位置才可以进行注入，在注入过程中不能打开任何氧气供应。警告：只能使用乙氟醚（Isoflurane）不要使用其它麻醉气体，使用其它麻醉剂可能会导致危险。警告：在处理剩余的麻醉剂时实验室要具备良好的通风条件，建议遵照已公布的安全条例进行操作，当丢弃剩余的乙氟醚（Isoflurane）时使用蒸发器使用手册上推荐的合适的化学容器。警告：使用时XGI8麻醉系统要保持直立状态。蒸发器注入步骤1） 如图7.2所示，确保氧气供应被切断，可以在源头或减压阀处关掉它。2） 如图7.3所示，确保蒸发器开关处于关的位置。3） 打开两个前面板的阀门开关释放XGI8的氧气，如图7.4所示可以看到阀门处于打开位置，流量计指示氧气已放完后，关闭这两个阀门开关。4） 反时针旋转卸掉蒸发器的螺丝帽（如图7.5）。确认试剂是乙氟醚（Isoflurane），缓慢的倒进灌入口，透过玻璃指示窗随时观察乙氟醚（Isoflurane）的水平线，注意不要超过最大允许线。如图7.6所示。5） 注意：如果蒸发器在灌注前是干的，水平线在开始会轻微下落因为内部的棉芯会吸收一部分试剂。6） 当乙氟醚（Isoflurane）达到玻璃指示窗上的最大标线时，表明蒸发器已灌注满。此时应停止，不要过分灌注。顺时针旋紧螺丝帽。为防止泄漏，请仔细检查螺丝帽已旋紧。 图7.2 氧气阀 图7.3 蒸发器置于OFF 图7.4 氧气压力计，前面板开关ON 图7.5拧下蒸发器螺母图7.6监视最大刻度线7.3设备操作步骤一在开始程序前分别称量两个乙氟醚（Isoflurane）活性炭过滤器（如图7.7），在过滤罐上用不可擦除的标记记录这些信息和日期。 图7.7 图7.8步骤1称量过滤器 步骤2打开排气泵步骤二打开前面板上的排气泵的电子开关（如图7.8）确认流速超过每分钟6公升（LPM）。步骤三打开高压氧气罐或其它供应源确保氧气供应（如图7.9）注意：推荐的氧气压力是每平方英寸55磅（或每平方英寸3565磅之间的任意值，请根据需要选择）。 图7.9 图7.10步骤3打开氧气供应 打开成像暗箱的气体开关步骤四打开IVIS系统成像暗箱的气体开关（如图7.10，在暗箱右侧）步骤五打开XGI-8前面板上的绿色氧气开关。（如图7.11） 图7.11 图7.12步骤5打开XGI-8氧气开关 步骤6把蒸发器旋钮设置到0步骤六把蒸发器旋钮设置到0（如图7.12）步骤七打开前面板上标记着“IVIS Flow on/off”的开关（麻醉气体流向IVIS分支管，如图7.13）使用流量计设置流速。注意：使用能使动物处于麻醉状态的最低量麻醉即可，最初建议如需麻醉5只成年鼠使用0.25公升每分钟的流量。 图7.13 图7.14步骤7打开“IVIS Flow” 步骤8打开流向感应箱的开关步骤八打开标记着“CHAMBER On/off”的开关（麻醉气体流向感应箱），如图7.14所示。设置感应箱流量计的流速为1.5公升每分钟。步骤九确认“IVIS MANIFOLD”的流速，可以根据需要进行调整。步骤十关上“IVIS MANIFOLD”和“INDUCTION CHAMBER”的开关。不要再调整流速计了。步骤十一合理设置蒸发器的百分比，典型值是百分之2.5（如图7.15），可以根据需要进行调整。 图7.15 图7.16步骤11 设置蒸发器的百分比 步骤12把动物放入感应箱步骤十二把动物放置在感应箱内（如图7.16），关上并锁紧箱子。步骤十三打开“INDUCTION CHAMBER”开关，注意，第一次运行的时间是最长的因为要把感应箱和管子充满试剂。步骤十四打开“IVIS MANIFOLD”开关，等一段时间（通常是二分钟到五分钟之间），麻醉气体到达分支管的锥形鼻塞处，然后把动物从感应箱中拿出来。步骤十五在把动物从感应箱拿出之前要关掉“CHAMBER On/off”开关。步骤十六快速的把动物拿出来放在锥形鼻塞处（如图7.17）。如果先前没把多余不用的分支管堵住，此时用特制的黑色橡胶塞塞住（型号是PN10168）。 图7.17 图7.18步骤16将需要麻醉的动物放置好 蒸发器置于OFF步骤十七为了减少麻醉剂的泄漏，在不移动动物时要把感应箱关紧。步骤十八当上述动物过程完成后，把蒸发器设置到关的位置（如图7.18）。步骤十九打开“CHAMBER On/off”开关，让纯氧流进感应箱5分钟。步骤二十直到感应箱充满氧气后，关掉“CHAMBER On/off”开关。步骤二十一把氧气罐关上，切断氧气供应。步骤二十二打开所有的开关让设备减压。当IVIS MANIFOLD流量计和感应箱流量计的指示球下降到指示管的底部说明XGI8减压完毕。步骤二十三关上XGI8的氧气开关（如图7.19）。图7.19 步骤23 关闭氧气开关 步骤二十四当流量计停止不动时关掉所有的开关，关上排气泵。如果需要，准备好以备下次使用。第八章 故障处理8.1 气体泄漏1） 在任何时候检测到XGI8麻醉系统发生泄漏，使用者应当立刻关闭氧气供应。联系龙脉得的技术部获取帮助。2） 使用者可以自己维护系统的其它外部泄漏，如管子和连接处。但是需要使用一个合适的泄漏检测装置例如SNOOP来隔绝泄漏源。3） 如果遇到气体减少的情况，但没有检测到泄漏，请检测管子有没有打结和阻塞。4） 旋紧接口，替换裂的和损坏的管子。5） 如果气体减少怀疑有泄漏，隔绝系统的各部分以减少可能的泄漏，检查经常操作的部分如管子的连接处或连接到暗箱的管子有没有打结。8.2动物感应箱的定时更换假设所有的气体流动正常，没有泄漏。可能说明需要校准蒸发器或其它XGI-8服务。8.3 更换XGI-8的保险丝在正常情况下，XGI-8不需要更换保险丝。如果泵看上去作用效果不显著并且没有声音时，可能需要更换保险丝。如果需要经常更换保险丝说明XGI8工作不正常，请联系龙脉得的技术部获取帮助。1） 确认电力供应稳定，可以用以下方法检查，在同一插座上使用另一个差不多相同功率的设备。如果工作正常说明电力供应正常。很有可能是XGI-8保险丝坏了。2） 更换保险丝，如附录C图示。3） 翘出保险丝屉，更换保险丝。4） 装上保险丝屉和电源接口。5） 如果更换保险丝没有解决问题，请联系龙脉得的技术部获取帮助。Xenogen IVIS LuminaII系统中文简易操作手册中文简易操作手册IVIS LuminaII系统开机1. 启动计算机；2. 开启相机电源，开启主机电源（为在imaging chamber后方），如需荧光检测开启荧光光源电源；3. 仪器开启后，点选桌面上Living Image图标，启动程序；4. 启动程序后，系统会要求点选个人ID进入。若为新使用者，请键入三的英文字母作为ID名称；5. 画面出现control panel，按下“initialize IVIS system”，启动整套IVIS系统；6. 待机器完成启始动作后，control panel 中的温度状态灯号为红色，等候约5-10分钟后温度降低，灯号转绿就可进行影像获取工作，此外按下温度灯号也可以观测目前CCD的温度及设定载台温度。IVIS LuminaII 系统关机一般不建议作关机动作，因为软件会进行每天的背景值侦测作业，所以计算机及主机都不建议关闭。除非有长时间不会使用到机器，才建议作关机作业。1. 关闭软件：请点选主画面中“Living image”中的“Exit”；2. 依次关闭仪器电源（荧光光源电源，相机电源，主机电源）；3. 关闭计算机电源。 Living image 软件操作1. 将老鼠或样品放入观察箱中关上门后，调整control panel中的参数设定。2. 模式选择：依照样品种类选择“luminenscence”或者“fluorescence”。3. Exposure Time：单位有sec及min可选择。可利用鼠标或是数字键更改数字。4. Binning：依所需影像画质选择，Binning数值越高，灵敏度越高但分辨率越低。6. f/stop光圈：光圈大小，1>2>4>8，光圈越大，采集光信号越多。 7. Field of view:视野大小选择，共有ABCD四种高度选择。选择后，系统会自动调整载台高度。9调整好参数，按下“acquire”获取图片。10. 如果进行荧光成像，选择相应的激发波长和发射波长。11影像获取后，需进行影像分析。先选择ROI的形状：有四种ROI可供选择：Circle, square, contour, grid (Countour为计算机自动圈选，Grid格状适用于microtiter plate)。 12按下“Create”键，就会在影像上出现ROI圈选区，可利用鼠标调整ROI的大小及位置。13按下“measurement”键，就会获得ROI区域的定量数值。14. 当您完成影像获取后，需储存档案，点击“Save Living Image Data”。15选择“All Living Image Data Files”，此为raw data，会储存未经任何修改的档案模式，方便后续定量分析作业。16 若要读取之前的影像，点击“Browse LI Data”，之后选择欲读取的档案路径，利用鼠标双重敲击该档案，即可读取。序列的设置和采集：注：本指南通过手动输入的光谱分离的步骤。Living Image 4.0软件版本包括一个autoexposure自动曝光设置和Imaging Wizard成像向导。有关如何使用这两个功能，请参阅各自的快速参考指南。您还可以在the Spectral Unmixing Wizard Setup reference guide找到有关的信息。这些功能旨在尽可能方便用户，我们强烈建议您利用这些优势时，执行这些步骤。1。如果您没有使用autoexposure自动曝光，首先用特定的激发和发射波长确定最佳成像时间。2。调整曝光时间避免成像饱和 - 低于60,000但是高于600counts。3。单击Sequence Setup，在Sequence Editor中输入序列。建议的顺序应包括特异激发荧光和背景的序列。举例说明，AlexaFluor 680 Peak Ex. 679 nm/Em. 702 nm 特定的激发/发射：Excitation 675nm/Emission 720-780nm（请记住，激发波长和第一个发射波长要有40-50nm的距离。）背景：Excitation 605nm/Emission 660-780nm（我们选择在 AlexaFluor达到峰值之前605nm激发背景。这样光谱分离算法能更特异的识别到两个独立的来源，更有效分离。）注：在上面的例子中，我们用了一个发射扫描。这意味着我们要扫描发射光以辨别高峰。不过，我们也可以使用两个发射滤光片和多个激发光来做激发扫描。注：要确保激发和发射光之间的带隙足够大，以便激发光不能通过发射光滤片到达CCD。至少要有45 - 50nm的分隔。这就是为什么我们不用675nm/Emission 700nm的配对。4。在控制面板中，设置荧光成像的参数（exposure time, binning, F/stop, excitation filter, emission filter). 注：LI4.0有自动曝光功能，请参阅自动曝光快速参考指南Autoexposure Quick Reference Guide以供参考。建议您尽可能使用此功能。注：光谱分离可以用表面荧光和透射荧光两种模式。用透射荧光和光谱分离时，先选用于成像的透射点。参见Transillumination Sequence Setup Quick Reference Guide 设置透射光成像序列。5。点击获取序列Acquire Sequence. 光谱分离：1。打开图像序列并把Units转成Radiant Efficiency。2。在Analyze标签中，选取要分析的图像。记住要检查每个图像在600-60,000 Counts。如果有饱和的图片或低强度的图片，请取消选择不用于分析。3。按Start Unmixing。4。 “Select Data Mask”窗口将会打开。选择“Photograph”或“Draw Mask”后，紫色代表要分析的区域。在照片模式下，使用threshold滑块或向上/向下箭头来调整紫色区域大小使之与要分析的对象匹配，注意不要包括图像以外的任何区域。如果使用Draw Mask，只需在分析对象上画一个正方形或椭圆形（如下图所示）。 然后点击下一步Next。5。输入Imaging Subject，如果是老鼠或者电子小鼠，选中Autofluorescence。选择Food Signal 如果动物没有事先喂alfalfa free food（不含苜蓿食物）。6。选择要分离的探针数，可以通过选择框右上方的绿色加号（+）来添加探针。从下拉框选择的已知或是未知的探针。最多可以选择三个探针用于光谱分离。7。在 Match Probe Labels复选框将自动标上相应的光谱成分- 探针。8。Use Constraints标签会自动选择光谱成分有助于光谱分离。注：建议使用constraints以协助重建。不过我们将在本参考指南的初步重建中不使用constraints以演示如何手动输入。9。点击完成Finish。10。该光谱分离结果将出现。每幅图像自动标明，每个图像的顶部中心有标签。这里的例子，有自发荧光和AF680。复合图像是自发荧光图像叠加AF680图像用不同的颜色来表示的。重要提示：综合形象是纯粹的定性的和无法定量。注：光谱图有时很复杂。设置约束：有时，你可能无法有效地从荧光背景中分离开信号峰。这通常发生在特定的信号低，难以背景区分的情况下。通常是背景在特定的荧光点信号位置是缺失的。自发荧光应该是均匀分布的，在特定信号所在区也是存在的。可以通过查看Spectra tab来显示结果-注意如何在下端（high pass end）光谱的荧光曲线变平。由于光谱分离算法没有约束进行初步分析，有时可以应用某些限制来得到较好的分离效果。有两种方法可以做到这一点，首先是给曲线算法加个初始猜测Initial Guess，并使用这个猜测适应现有数据。1。到图像窗口的Spectra标签。2。点击绿色+并选择特定的曲线用来适应下拉菜单中的结果。下拉菜单中列有最常见的激发和发射荧光的曲线。注：这将会添加特定的光谱曲线图（注意左边的蓝色曲线）。3。选择Tool Palette上的Spectral Unmixing下的Options.4。请注意第一行对应第一个光谱成分。5。在这个的例子中，我们要根据添加光谱的形状来用Initial Guess (Init)来约束第二个光谱AF680。在第2步添加的曲线现在会出现在下拉菜单中。选择要使用的约束的曲线。6。选择右下方的Update。7。选定的曲线将被用来作为“模具”来限定数据，结果就是光谱图下方的信号和背景有了更大的分离。用这种办法，我们现在可以更有效的分开AF680信号和自发荧光。现在可通过产生的图像中看到TissueAF一致的信号。第二种方法是设置一个光谱的High Pass。信号低于High Pass将会是被归零。如果你要分离的特定荧光不在我们的软件重视使用这种方法。要使用特定荧光光谱的起点作为High Pass点。比如AlexaFluor680，我们会用其光谱的最低点660nm。1。选择Tool Palette上的Spectral Unmixing 的Options tab。2。在HP （代表High Pass）下，选择和曲线开始最接近的滤过。如上所述，在这里我们选择了660nm。3。然后选择Options窗口右下方的 Update，这时 你可以看到，用已知的信息已经将660nm处归零来重新塑造光谱曲线。4。和initial guess constraint一样，结果就是两个光谱成分的更好的分离，你可以看到在图像上有一个一致的背景荧光信号。