【动物医学专业优秀论文】猪组织中新霉素残留的微生物检测方法探究.doc

毕业设计(论文) 题 目 名 称： 猪组织中新霉素残留的微生物检测方法探究 题 目 类 别： 毕业论文 学 院 （系）： 专 业 班 级： 学 生 姓 名： 指 导 教 师： 日 期： 至 目录任务书开题报告指导老师审查意见评阅老师记录答辩会议记录中文摘要英文摘要1 前言11.1 抗生素残留的危害11.2 新霉素的应用2 1.3 新霉素在动物机体中的残留21.4 新霉素的化学结构与理化性质31.5 新霉素等首要残留的原因41.6 新霉素在动物性组织中的残留的检测方法51.7 研究的目的62 材料与方法62.1 材料72.2 方法83 结果114 讨论与分析164.1 标准曲线164.2 回收率试验164.3 菌悬液174.4 蛋白质变性方法的选择175 小结18参考文献19致谢21外文参考资料原文 VIII外文参考资料译文 IX猪组织中新霉素残留的微生物学检测方法的研究 摘要 目的 新霉素是由链霉菌属弗氏链霉菌经发酵培养产生的一种氨基糖苷类抗生素，目前，它作为一种常用兽药和具有发展前途的饲料添加剂在畜牧业中广为使用。为了控制新霉素在动物性食品中的残留，保障食品卫生和公共健康，本次试验对猪肌肉和肾脏组织中新霉素残留的微生物学检测方法做了研究。方法 本试验用测试菌为表皮葡萄球菌的微生物学琼脂扩散法，测定猪肌肉组织和肾脏组织提取液中的新霉素的含量。结论 本方法灵敏度和回收率高，本方法的灵敏度为0.150.2ug/mL,检测限为0.50.75ug/g组织，回收率为，回收率比FDA的传统方法有显著的提高，标准曲线在0152.4ug/mL范围具有良好的线性范围。且其操作简便，不需要特殊设备，样品用量少，易于推广，适用于新霉素的定量分析.关键词 新霉素 ; 残留检验 ; 微生物学 ;琼脂扩散法 Determination of Neomycin Residues in Pig Tissues By Microbiolmgical MethodStudent: Deng yan Animal Science Department Tutor:Zhao hongmei Animal Science DepartmentAbstract Neomycin is classified as a broad-spectrum antibiotic that is used for preventing diseases and increasing the efficiency of feed utilization in veterinary medicine.In order to control neomycin residues in food derived from animals and ensure public health,we have studied on determination of neomycin in pig tissues (muscle and kindey).We take Staphylococcus Epidermidis as the test microorganism.The sentitivety of the method was 0.15-0.2ug/mL,the limits of detecationfor neomycin in tissue were0.5-0.72ug/g, and the calibration curve was liner within the range of 0.152.4ug/mL.The method is accurate,precise,simple and useful for the deternation of neomycin residue in the pig tiusse .Key word Neomycin;Microbiological method;Residues;ager diffusion method1前 言1.1抗生素残留的危害伴随着新霉素等抗生素在兽医防治,特别是在饲料添加剂方面的广泛使用,动物性食品中药物残留及其耐药性问题倍受关注.动物性食品安全问题已经引起全世界范围的广泛关注.1.1.1 细菌耐药性的增加抗生素的滥用可能产生耐药性,从细菌产生耐药性方面来说, 耐药菌和饲料中添加抗菌药物，实际上等于持续低剂量用药。这样会导致动物性食品中的药物残留量虽然很低,但是如果人长期食用这种低残留抗生素的食品,就能抑制后杀灭各种体内敏感菌,由于药物对细菌的选择压力,导致体内耐药菌不断增加,耐药性不断增强.动物机体长期与药物接触，造成耐药菌不断增多，耐药性也不断增强。抗菌药物残留于动物性食品中，同样使人也长期与药物接触，导致人体内耐药菌的增加。如今，不管是在动物体内，还是在人体内，细菌的耐药性已经达到了较严重的程度。1.1.2 正常菌群的破坏正常机体内寄生着大量菌群，如果长期与动物性食品中低剂量的抗菌药物残留接触，就会抑制或杀灭敏感菌，耐药菌或条件性致病菌大量繁殖，微生物平衡遭到破坏。各种条件菌大量增殖,人体内正常菌群被破坏, 使机体易发感染性疾病,因细菌产生耐药性而很难治愈.1.1.3 毒性作用(1)急性中毒:若一次摄入残留物的量过大，会出现急性中毒反应. 当然急性中毒的事件发生相对来说是很少的，一般动物性食品中残留的抗生素对人并不表现为急性毒性作用,药物残留的危害绝大多数是通过长期接触或逐渐蓄积而造成的.(2)慢性作用:人们长期摄入低剂量的残留抗生素的食品后,一定时间后则可能由于残留抗生素在体内的逐渐蓄积而导致慢性作用,主要表现为毒性作用,细菌耐药性,致畸,致突变,和致癌作用等.某些过敏体质的人,接触残留的抗生素,也可能引起一系列的过敏反应(变态反应) .过敏反应症状多种多样，轻者表现为麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等。严重时可出现过敏性休克，甚至危及生命。当这些抗菌药物残留于肉食品中进入人体后，就使部分敏感人群致敏，产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生素或用这些抗生素治疗时，这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物，发生过敏反应。因此,为保障食品卫生和公共健康,建立一套经济,简单,灵敏度高,易推广的最广泛使用的抗生素-新霉素残留检测的方法已势在必行.1.2 新霉素的应用新霉素抗菌谱广,归革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用.新霉素因起其抗菌活力强,作用范围广泛,用量少,价格低,口服安全性能高等优点,而作为一种常用兽药及具有发展前景的饲料添加药物在畜牧也生产中广为使用.兽医临床上,新霉素主要用于治疗畜禽细菌性肠炎;另外,新霉素还被普遍用于治疗乳腺炎,角膜炎,结膜炎,耳言,皮言,外伤感染,足腐烂等疾病.在畜禽养殖上,可提高饲料利用律,促进生长,但是其吸收毒性大,在动物性食品中的残留可对消费者产生较大的潜在危害,对食品卫生和公共健康产生了威胁.1.3 新霉素在动物体中的残留1.3.1 新霉素在动物体中是药代动力学研究有关新霉素在动物机体,尤其是在牛机体中的动力学研究很多,但是结果不尽相同.有关新霉素药代动力学的早期研究主要是采用微生物分析的方法,Shaikh和Pedersoli使用HPLC法分析得到了较长的半衰期值,这说明动力学 参数明显受到分析法的影响.Black等(1982年)对给牛肌肉注射新霉素后,新霉素在体内的分布情况进行了分析研究.Black的实验提示新霉素在体内的主要排泄途径是通过肾脏而不是胆汁;另外,在脑组织中也未检测出新霉素,说明此类化合物是很那通过血脑屏障的.目前,大量文献已证实新霉素在体内的主要排泄途径是通过肾脏，肾是新霉素在动物体内的靶组织，并且新霉素与肾脏皮质以较强的离子键结合，在肾脏中蓄积时间很长，通常需要2830天的休药期，但很难通过血脑屏障。新霉素在体内的代谢主要是在消化道内发生磷酸化、腺苷酸化或乙酰化，被吸收的新霉素绝大部分以原形存在，故新霉素在体内的残留标志物为新霉素母体化合物.1.3.2 新霉素在动物体中消除规律的研究Ronning和Fagerberg在1994年向FDA提交了有关新霉素在牛,羊,山羊和猪体内消除规律的研究报告.用20头动物(雌雄各半)饮水给药(剂量约为22mg硫酸新霉素kg体重),连续给药14天;另外,2头(雌雄各半)作为对照,分别在休药期0,1,2,7小时和14天(牛和猪);1,3,7,14小时和14天(羊);12,24,48,72和96小时(山羊)屠宰后采样,每次采样4头动物(雌雄各半),未给药的对照组的动物在停药当天屠宰采样,采用微生物杯碟法进行残留分析.实验结果表明,对照组的每种动物组织中均未检测出新霉素的残留;在给药组动物各种动物中,除了肾组织以外,在肌肉组织以及脂肪组织中均为检测出新霉素残留.猪在休药期0,1,和3天时,肾组织中新霉素平均含量分别为2.174,1.920和0.958ug/g组织,休药期14天时3头猪的肾脏组织中未检出新霉素.从Ronning和Fagerberg等人的实验中可以看出,不同的动物中新霉素残留的消除快,慢不同,但是消除的规律是一致的,在休药期的各阶段,在上述各动物的肌肉,肝脏和脂肪中都未检出新霉素;肾脏是新霉素的靶组织,连续给药14天(22mg硫酸新霉素/kg体重)后,在休药期14天个组织均未检出新霉素的残留.1.4 新霉素的化学结构与理化性质1.4.1 新霉素的化学结构新霉素的化学结构是以碱性环己醇为糖苷元与氨基糖缩合而成的苷，其结构中含有6个阳离子位置，可与生物大分子以离子键结合，在测定可食用组织里新霉素残留的提取程序中就要求充分打破新霉素与生物大分子间的键，新霉素结构中没有发色团存在，故用紫外检测器和荧光检测器进行残留分析之前需要将新霉素结构中的6个伯胺基团是衍生化试剂与之反应的主要部位。、图1 新霉素的分子式Fig.1 Molccuar formula structure of Neomycin1.4.2 新霉素的理化性质新霉素（Neomycin）是有Waksman和Lechevalieil1949年从链霉菌属弗氏链霉菌(Streptomyces fradiac)竟发酵培养产生的一种氨基糖苷类抗生素，新霉素中含有新霉素A.B.C三种成分，主要为新霉素B.C两种，新霉素A为其水解产物。新霉素是以2-去氧链霉胺(2-deoxy streptamine)为母体得到的衍生物。新霉素为碱性水溶性抗生素，稳定性很强，对碱、酸，热等的耐受性比其它抗生素强。新霉素在水中极易溶解，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中几乎不溶。1.5 新霉素等兽药残留的原因 残留的原因归结起来既有质量的问题,又有违规使用的问题.1.5.1 兽药质量现状我国畜牧业的迅速发展,带动了兽药业的大力发展.近些年来兽药质量虽然有所提高,但仍不能使人满意,产品合格率一直在6570左右徘徊,合格率未曾有过突破.农业部2002年行文公布的不合格产品中,大多数是地方产品,而地方产品在兽药市场中占有很大的份额.1.5.2 兽药的违规使用美国在20世纪70年代对兽药残留进行调查,发现其原因有76是不遵守休药期所致,饲料加工或运输过程中污染占12,储藏不当占6,其余6是药品的使用不正确所致.从中可以看出不遵守休药期占主要方面.目前,我国动物产品中兽药残留超标的主要原因是:非法使用禁用兽药及其化合物;不遵守休药期的规定;超剂量,超范围用药;违反有关标签的规定等.1.6 新霉素在动物性组织中的残留的检测方法 有关新霉素含量测定的化学方法报告很多,主要有薄层层析,纸层析,高压液相色谱法,气相色谱法,分光光度法,电泳法以及离子交换法等.这些方法主要是用来测定发酵肉汤和药片中的新霉素的含量,很少被应用到生物材料中.据文献报道,用于测定生物材料中新霉素残留的方法有微生物方法,高压液相色谱法,薄层层析法和电泳法.其中以前二种为主要方法.目前,国外新霉素残留检测的方法也主要是这两种方法,即微生物方法和高压液相色谱法两种.其中,国外的微生物方法以FDA的传统方法为代表.下面就以上几种测定生物材料中新霉素的方法做一简单介绍.1.6.1 微生物学方法用微生物发测定新霉素含量所应用的菌群主要为金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)两种.Groves等人(1955年)描述了生物体液和组织中新霉素的微生物分析方法,其中主要的是应用于检测临床生物样品中微生物.Kavangh等人(1963年)描述了用表皮葡萄球菌为测试株,测定血清,尿液和组织中的新霉素含量.Groves和Kavangh发方法均没有针对动物性食品中新霉素残留的测定,但是为微生物学方法测定新霉素残留测定奠定了基础.Siddique等人（1965年）报道了一套灵敏度较高的微生物方法测定牛奶中的新霉素，测试菌为表皮葡萄球菌。Barbiers等人（1967年）报道了组织中新霉素的分析程序，其法在肝脏，肾脏，肌肉中的灵敏度低于0.5ppm，脂肪中可达到0.2ppm。Neff等人（1970年）报道了一套由18家实验室合作研究的测定饲料中新霉素含量的微生物学方法，方法测试菌为表皮葡萄球菌。平均回收率达到95.5。Neff等人的方法成为美国AOAC规定的测定饲料中新霉素的标准方法。1.6.2 液相色谱法液相色谱法（LC）技术在分析化学上具有很高的灵敏度和特异性。自1985年Shaikh等人首次报道用LC法检测动物组织中的新霉素残留量以来，LC法在新霉素残留上的应用被日益完善。1.6.3 薄层层析法 薄层层析法（Thin Layer Chromatography, TLC ）在实验室中被广泛用于提纯混合物中的新霉素或是测定新霉素片剂中的有效成分新霉素B、C的含量。在动物性组织中新霉素残留量的测定中，TLC主要用来进行HPLC分析法前和质谱法确定前新霉素的醇化，但是也有报道用TLC法直接测定新霉素残留。1.6.4 电泳法Smither等（1978年）报道了用电泳法鉴定动物组织和饲料中含新霉素在提内的五十种抗生素，由于方法中的提取液（乙晴甲醇蒸馏水）和菌种（蜡状芽孢杆菌与藤黄微球菌）不适合新霉素，新霉素没有得到理想的回收率，灵敏度也不高.在新霉素残留分析的几种方法中,薄层层析主要被作为一种提纯手段应用于新霉素残留测定,而电泳法也因为其过程的繁琐和灵敏度不高而在新霉素残留分析上受到限制，因此，高压液相色谱法和微生物法是两种主要的测定动物组织中新霉素残留的方法。高压液相色谱法具有其他方法不可比拟的高灵敏，高特异性以及检测速度，但其预处理过程复杂，不适合进行大批量样品的同时检测。而微生物法操作简便，样品用量少，预处理简单，易推广，具有一定的灵敏度，在大批量样品同时分析中占有很大的优势,但只能测定有生物活性的残留物,且只有当药物代谢标志残留物具备生物活性时才能测定总的残留量,而新霉素在动物体内残留标志物为具有生物活性的新霉素母体化合物.1.7 研究的目的 综上所述，本次试验的目的就是要为保障动物性食品卫生和公共健康而建立一套经济、方便、具有有一定灵敏度的检测猪组织中新霉素残留量的微生物学检测方法。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 仪器与试剂 匀浆机 AM-6 日本NIHOSEIKI KAISHA LTD离心机 LD4-2A 北京医用离心机厂 电子天平 BS210s(max=210g d=0.1mg)手提式压力蒸气灭菌锅 上海医用核子仪器厂电热恒温数显恒温水浴锅 国华HH-4牌电热鼓风干燥器 101A-2型 上海市实验仪器总厂电热恒温真空干燥箱 康乐牌DZK88-A型 上海医疗器械七厂电热恒温培养箱 HH.B11.600.S 上海跃进医疗器械厂涡旋混合器 WH-1微型(转速2000r/min) 上海沪西分析仪器厂培养皿 20×100mm游标卡尺 精确度0.02mm 北京分光光度计 722型组织剪，吸量管，电炉，锥形瓶，酒精灯，接种环2.1.2 药品与试剂 新霉素标准品 含量703IU/mg蛋白胨 生化试剂琼脂粉 生化试剂酵母粉 生化试剂牛肉浸膏 生化试剂葡萄糖 分析纯氯化钠 分析纯磷酸氢二钾 分析纯磷酸二氢钾 分析纯氢氧化钠 分析纯氯仿 化学试剂2.1.3 实验菌种 表皮葡萄球菌(指导老师提供)2.2 方法2.2.1 溶液配制:(1) 0.1mol/L灭菌磷酸盐溶液（pH 8.0） 准确称取16.73g无水磷酸氢二钾（K2HPO4）和0.523g无水磷酸二氢钾（KH2PO4），加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，用121灭菌20min，备用。(2) 新霉素标准品储备溶液将新霉素标准品置于37干燥箱48h后，精密称定0.01422g。用无菌磷酸盐缓冲溶液溶解稀释至100mL，得到浓度为100ug/mL的标准储备液，置4冰箱保存，有效期为4周。2.2.2 培养基的制备 培养基I及培养基II的组成见表1。 表1 培养基组成Table 1 The composing of the culture medium培养基I（累代保存用培养基）培养基II（检定培养基）蛋白胨/g10.010.0酵母粉/g 3.0 3.0牛肉浸膏/g 1.5 1.5无水葡萄糖/g 1.0 1.0琼脂粉/g 15.0 15.0蒸馏水/mL 1000 1000(1) 培养基I（斜面培养基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，无水葡萄糖1.0g和琼脂15g于蒸馏水中，并稀释至950mL用1.0mol/mL NaOH溶液调节培养基pH值为6.56.6，最后定容至1000mL。将培养基分装于试管中，121高压灭菌20min，制成斜面，用于菌种复活和传代培养。(2) 培养基II（分析培养基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，无水葡萄糖1.0g和琼脂粉15g于蒸馏水中，并稀释至950mL，用1.0mol./L NaOH溶液调节pH值为7.98.0。最后定容至1000mL，将培养基分装于500mL锥形瓶中，在121高压灭菌20min。2.2.3 菌液的制备 将表皮葡萄球菌在新鲜培养基I（斜面培养基）上连续传代3次，用56mL 0.85%无菌溶液冲洗斜面培养物并倒入300mL锥形瓶中，然后用0.85%无菌溶液稀释成菌悬液。在722型分光光度计560nm波长下，控制其透光率为80%左右，菌悬液由试验当天制备。2.2.4 平板的制备(1) 底层：加10mL融化分析培养基于培养皿中，均匀铺平，在水平面上待其凝固。(2) 菌层：加适量（0.20.5mL）新制备的菌悬液至100mL预先融化并冷却至48h分析培养基中，彻底混匀后，在每个含有底层的培养平板中加入4.0mL，使培养基均匀分散铺平，并待其冷却凝固，在使用的当天制备平板。2.2.5 标准曲线的制备(1) 标准曲线稀释液的制备分别取猪的空白肌肉、肾脏组织，经捣碎后，于-20冷冻保存，临用前解冻。分别称取10g肌肉组织，10g肾脏组织，装于50mL带盖塑料离心管中，加入20mL磷酸盐缓冲溶液（pH 8.0），置旋涡混合器混合1min，然后在04放置30min后防如100水浴加热5min，冷却，4000r/min的速度离心15min，收集上层液。用少量1mol/mL溶液调节上层液至pH 8.0，于33下平板培养20h，不出现抑菌圈即可作为标准曲线稀释液备用，04下保存，不超过一周。(2) 肌肉组织的标准曲线用0.1mol/mL磷酸盐缓冲液（pH 0.8）稀释新霉素标准品储备液（100ug/mL）10ug/mL，然后用空白肌肉组织提取液（制备见2.2.5（1）稀释为0.075，0.15，0.3，0.6，1.2和2.4ug/mL(稀释标准参考中华人民共和国农业部，动物源食品中新霉素残留的检测方法微生物检测法Z，农业发200138号)的一系列标准曲线浓度，0.6ug/mL为参照浓度，按一剂量法的原理制备各标准曲线，即取新霉素标准品储备液（1000mL），再把100ug/mL标准品溶液稀释成10ug/mL，最后，10ug/mL标准品储备液稀释成所需要的各个工作标准浓度（0.15，0.3，0.6，1.2，2.4ug/mL），中心浓度标准设为其中一个（如0.6ug/mg）。每个工作标准液浓度点制备3个培养皿中，每个培养皿中等距打六个孔,间隔的3个孔中分别滴入250mL中心浓度标准液，另间隔3个孔中分别滴入250uL工作标准液，于（36±1）恒温培养（16±1）h用游标卡尺测量抑菌直径，得到回归方程和标准曲线。在坐标纸上绘出，以各浓度的对数值为纵坐标，平均抑菌圈直径的校正值为横坐标绘制标准曲线。(3) 肾脏组织的标准曲线用0.1mol/mL磷酸缓冲液（pH 0.8）稀释新霉素标准品储备液（100ug/mL）至10 ug/mL，然后用空白肾脏组织提取液（制备见2.2.5（1）稀释为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 ug/mL的一系列标准曲线浓度，0.8 ug/mL为参照浓度，按一剂量法的原理制备标准曲线，在坐标纸上绘图，以各浓度的对数值为纵坐标，以平均抑菌圈直径的校正值为横坐标绘制标准曲线。2.2.7 回收率测定（1）样品准备称取5.0g捣碎的空白肌肉、肾脏组织于50mL塑料离心管中，称2份，分别加入0.5mL不同浓度的工作液和磷酸盐缓冲溶液，使加入溶液的总量为10mL，肌肉组织中新霉素浓度为分别0.25，0.5，1.0和2.0ug/g，肾脏组织中的新霉素浓度分别为0.375，0.75，1.5和3.0 ug/g。将空白组织和新霉素标准工作液的混合物放置在旋涡混合器上1min，使之充分混匀，然后至04放置30min，使新霉素充分渗透到组织中去。（2）提取在各样品中分别加入9.5mL 0.1mol/mL磷酸盐溶液，放置在旋涡混合器上混合1min，使之充分混匀，然后置04放置30min，使新霉素在混合物中充分分散。(3) 去蛋白将样品中加入10mL氯仿,置于漩涡混合器上振荡均匀，4000r/min速度离心15min，分离的上层液用少量1mol/mL（12滴）调至pH8.0。(4) 测定用上清液做抑菌试验，每皿间隔3个孔中滴加标准品参照浓度工作液，另3 个孔中滴加样品上清液，37培养1820h，量取抑菌圈直径，根据标准曲线计算出实测药物的浓度。2.2.8 计算(1) 新霉素残留量的计算公式 X=CV/M其中 X组织样品中新霉素残留量（ug/g） C-试样液中新霉素浓度(ug/mL) V-试样总体积(mL) M-猪组织样品重(g)(2) 回收率计算实际测出的药物浓度与猪组织中添加的药物浓度之比计算回收率,以百分数表示.3 结果 3.1 标准曲线的制备本研究方法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量平行线的原理设计，即计量法，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，结果见表2和表3，以测定供试品效价的一种方法。本研究制备标准曲线采用的方法是：用提取空白组织（肌肉、肾脏）的缓冲液为介质制备标准曲线。该方法须要进行回收率实验（明新霉素能够从组织中回收）。其结果见表4和表5。 表2 肌肉组织抑菌试验结果Table 2 the result of the test of bacterria hibition of the musclu tissue D1 D2D3d0.15（ug/mL12.02 10.8012.7912.2811.2912.9813.0111.8813.1012.230.3 ug/mL15.0213.8715.6014.6414.1515.1214.9014.2614.8614.710.6 ug/mL16.7317.2217.3416.8617.6917.9616.8616.9018.2017.311.2 ug/mL19.1119.7019.9419.2419.8420.1619.6020.0019.1419.632.4 ug/mL21.2221.9821.6821.4822.1022.0021.4622.2122.4021.84表3 肾脏组织抑菌试验结果Table 3 The result of the test of bacterria hibition of Kidney tissueD1D2D3d0.2 ug/mL9.9011.1610.8111.4810.7911.2411.2610.4311.4810.950.4 ug/mL12.8813.2613.2012.9613.5612.9613.0413.4613.1613.160.8 ug/mL18.817.0817.8817.4017.9818.6617.8017.4218.2017.911.6 ug/mL20.4320.8621.0820.5620.6720.1619.8819.5620.7620.443.2 ug/mL22.2021.8821.2322.1822.2622.8823.7622.8623.0022.25 D-抑菌圈直径;d-抑菌圈平均值.以下相同表4 肌肉组织的标准曲线Table 4 The standard response curve for muscle 标准曲线浓度新霉素添加浓度(ug/mL)0.0750.150.30.61.22.4平均抑菌圈直径(mm)11.7415.0118.0219.2421.80样本数：n=3;-表示未检出，以下表格都相同。图1 肌肉组织标准曲线图Fig.1 The standard response curve for muscle图2 肾脏组织标准曲线图(Fig.2 The standard response curve for kidney)3.2 回收率 对新霉素添加水平为0.25，0.5,1.0和2.0ug/g组织的肌肉组织以及添加水平为0.375、0.75、1.5和3.0ug/g组织的肾脏组织进行回收率测定，结果见表6.表6 肌肉和肾脏组织的回收率Table 6 Recovery of muscle and kidney样本新霉素添加水平(ug/g组织)新霉素平均回收水平 (ug/g组织)新霉素平均回收率(ug/g组织)肌肉0. 250. 51. 02. 00.390.821.9385.274.483.2肾脏0. 3750. 751. 53. 00. 71.322.7378.188.081.1样本数：n=3. 从表3可以看出，组织中的检测限为0.50.75ug/g组织，在0.53.0ug/g组织的添加水平下，平均回收率为81.7.4 讨论与分析4.1 标准曲线Shaikh等用提取空白组织的缓冲液为介质制备标准曲线的方法得到的标准曲线斜率十分一致。本试验中测得两种组织标准曲线斜率的变异系数很小，表明本研究支持了Shaikh的结论。本研究结果中两种组织标准曲线的斜率不同，不同组织中方法的灵敏度也不同，这说明组织材料的成分会影响新霉素的测定。Bielecka等报道分别用磷酸缓冲液、鸡空白肝脏组织提取液稀释青霉素、四环素以及链霉素，结果发现在任一给出的抗生素浓度，抑菌圈大小随着稀释物不同而变化。 4.2 回收率试验FDA的分析方法中将提取之后的样品离心，然后直接用上层液为待检溶液，本研究发现这种方法得到的上层液比较浑浊，不能在培养基中充分扩散，因此回收率的值不高，本研究中此方法对新霉素添加水平为1.0ug/g的肌肉组织的平均回收率只有74.4%用微生物学方法检测双氢链霉素和四环素残留时采用酸化样品使蛋白质变性，然后进行离心的方法，结果使回收率的比FAO方法有显著提高。本研究采用Injlis等方法后发现酸化样品，然后用碱调pH值的过程麻烦，并且难以计算样品的终体积，另外，培养平板上抑菌圈的边缘比较模糊，不容易进行准确测量。Vilim等 报道在微生物学方法检测动物组织中青霉素类抗生素时，对提取之后的样品加热后进行离心，平均回收率达94.6%99.1%；Shaikh等在用HPLC法检测新毒素残留时将样品在沸水中加热10min，使蛋白质充分变性沉淀。新霉素是耐热性很强的抗生素，在沸水中加热不会破坏其活性。因此，本研究将加入氯仿去蛋白这一步骤加入FDA方法中，结果得到的待检溶液澄清，新霉素添加水平为1.0ug/g的肌肉组织平均回收率为74.4%，比用FAO方法得到的回收率提高近12.8%.FAO方法中所用提取液体体积为组织样品的3倍。当提取液体积增大时，样品稀释的倍数随之增加，因此组织中药物含量低事难以检测出来。本研究结果发现2倍于组织样本重量的提取液可以使药物添加水平为0.53.0ug/g的组织的样品得到满意的回收率，本研究的结论同Katz和Bielecka的相一致。4.3 菌悬液细菌的浓度要控制在一定适当的数量，一般在722型分光光度计560nm波长下，控制菌旋液的光透率在80%.细菌浓度过高过低都会影响药敏试验的结果。4.4 蛋白质方法的选择本试验过程中遇到最大的问题是蛋白质变性的问题。由于未变性的组织均浆有一定的的粘稠度，在琼脂扩散法测定时，影响药物的均匀扩散，因此必须选择合适的方法使其变性沉淀。新霉素对热、酸、碱都很稳定，可以考虑用磷酸盐缓冲液处理后用以下方法使蛋白质变性。4.4.1 加热 将处理后的样液于04静置30min，放入100水浴加热5min，取出冷却，以4000r/min.本方法能使蛋白质完全变性，但加热后鸡蛋完全凝固，难以获取上清液。4.4.2 紫外线照射 将处理后的样液于紫外灯下放置处理过夜。此法不能使蛋白质完全沉淀。4.4.3 调节pH值 该方法是根据蛋白质在等电点时有最大沉淀的原理进行设计，先用磷酸调节处理液pH值为4.04.5之间，使一部分酸性蛋白沉淀，以4000r/min离心15min，再用30%氢氧化钠溶液将pH调至8.0，以4000r/min的速度离心15min，得上清液。该方法你能使蛋白质完全沉淀，而且无法去除脂肪，抑菌圈小。4.4.4 乙睛或乙醇 处理后的样液加入倍量（10ml）乙睛或乙醇，振摇，4000r/min离心15min,得上清液.该法能有效的