CB114400G海水养殖动物主要病毒性疫病爆发机理与免疫防治的基础研究【973计划拟立项项目】.doc

项目名称：海水养殖动物主要病毒性疫病爆发机理与免疫防治的基础研究首席科学家：宋林生 中国科学院海洋研究所起止年限：2012.1-2016.8依托部门：山东省科技厅 中国科学院一、关键科学问题及研究内容选择海水养殖业中经济和学术价值并重的对虾和鱼类，针对研究最为深入、致病性最高、危害最为严重的对虾白斑综合征和鱼类虹彩病毒病，开展以下研究：1. 疫病爆发流行的分子病原学基础l 病毒感染与疫病爆发的细胞和分子基础：确定病毒侵染、传播的靶标器官和致病的分子机制。研究病毒内吞与胞内移动的分子过程，确定病毒感染的受体及作用网络。开展与病毒感染及致病等相关功能基因研究，以期了解病毒感染与疫病爆发的分子基础。l 病毒对宿主细胞机能的操控机制：研究病毒、病毒编码的基因及非编码的病毒miRNA对宿主基因、细胞信号通路和调控网络的调节作用，揭示病毒对宿主细胞机能的操控机制和作用网络，进一步阐明病毒致病的分子机理。l 病毒遗传变异特征与分子流行病学：在野生和养殖对虾、鱼类及水体中查明病毒传播的分子途径。研究病毒不同种株之间的遗传变异和演化特征，阐明其遗传变异与感染宿主范围及疾病流行的关系。2. 宿主应对病原侵染的应答规律与疫病爆发机理l 研究宿主应对病毒感染的天然免疫反应的关键途径，包括对病原的异己识别的分子基础、信号转导途径和效应分子作用机制。l 探索鱼类适应性免疫的激活、维持与调控机制，比较低等脊椎动物抗感染免疫反应与哺乳动物的异同。l 分析病原侵染与环境变化对免疫细胞功能、免疫相关基因表达与神经内分泌-免疫网络的影响，揭示疫病发生与爆发机理。3. 疫病防治的免疫学原理和关键技术途径l 利用病原与宿主相互作用的粘附蛋白和受体，研制对虾WSSV感染阻断剂；阐明对虾免疫因子和免疫增强剂作用机制，研发有效的免疫活性物质及其导入途径。l 针对危害严重的鱼类虹彩病毒筛选、设计高效免疫原，构建高保护性疫苗，探索疫苗的效应机制；开展疫苗包埋剂和免疫佐剂研究，研发有效的疫苗导入途径；创建高效疫苗保护效果的实验室评价体系。l 研究对虾和鱼类免疫稳态的环境与生态操控原理，研发防控对虾白斑综合症和鱼类虹彩病爆发的环境调控技术途径。二、预期目标（一）总体目标1. 在海水养殖对虾和鱼类病毒性疫病爆发和免疫防治理论方面取得突破，丰富和拓展海洋动物病毒功能基因组学、分子流行病学、细胞免疫学、分子免疫学，开创我国鱼类系统疫苗学，引领我国海水养殖动物疫病发生和免疫防治学科的发展。2. 明确对虾和鱼类天然免疫系统应对病毒感染的免疫反应关键途径，揭示鱼类适应性免疫的激活、维持与调控机制，分析病原侵染与环境变化对免疫系统的影响，探索疫病发生与爆发的分子机理。3. 开辟海水养殖动物疫病的免疫学防治新途径，全面提升疫病发生与控制方面的研究水平，取得一批具有国际重要影响的原创性成果，提升我国在国际海洋动物免疫学及病害控制领域的前沿地位。4. 针对由虹彩病毒和WSSV病毒引起的疫病，建立和发展有效的免疫防治技术和途径，有效遏制疫病的爆发，促进海水养殖产业的健康持续发展。5. 组建一支在海洋水产疫病发生和免疫防治研究中具有创新能力的团队，造就一批在国内外有影响力的领军人物和中青年学科带头人。（二）五年预期目标1. 揭示WSSV和虹彩病毒感染致病与疫病爆发的细胞和分子基础：明确WSSV和虹彩病毒侵染的靶组织、侵染途径和增殖方式；阐明4个以上WSSV和虹彩病毒早期调控因子及毒力因子，确定6-8个WSSV和虹彩病毒参与侵染和致病的关键基因以及4-6个与其相互作用的受体蛋白，揭示其对宿主细胞的调控机制及其与疾病发生的关系；构建1-2种具有感染性的荧光标记重组虹彩病毒；揭示宿主受病毒基因和miRNA调控的信号分子6-8个，信号传导通路3-4条，初步阐明WSSV和虹彩病毒对宿主细胞机能的调控网络和操控机制，阐明不同致病株的遗传与演化特征。2. 诠释对虾和鱼类应对病毒感染的免疫反应关键途径与调控网络：鉴定对虾抗病毒的关键基因/蛋白8个以上；获得具有抗病毒活性的次生代谢产物2个以上，抗病毒保护率达到50%以上；阐明对虾抗病毒的信号转导通路，建立以对虾为代表的甲壳类动物天然免疫系统的基本框架结构；阐释鱼类应对病原感染的免疫反应关键途径、调控网络及其对环境胁迫的应答规律，揭示疫病爆发机制。3. 拓展病毒性疫病防治的免疫学途径和关键技术：获得3-4种可有效阻断WSSV入侵的特异性抗体或2-3株活性单链抗体；构建具有稳定阻断效果的RNAi载体；明确不同类型免疫增强剂的免疫增强机理，筛选到4-6种高效、健康的免疫增强剂和2-3种可增强对虾抗病力的养殖环境友好型外源生物；鉴定WSSV感染相关对虾主要免疫因子，实现3-5种抗病免疫因子基因在酵母或细菌中的高效表达；优化对虾抗病生物活性物质导入途径；建立鱼类病毒疫苗的设计策略和疫苗的高效表达与导入技术；构建5个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70；发现3个高效免疫佐剂，确定其能提高免疫保护效率达15以上；建立一种疫苗效应的实验室评价体系。4. 取得一批具国际影响的原创性成果：在SCI收录的与水产病害和免疫相关的TOP期刊上发表论文150篇以上，申请国家或国际发明专利30项以上。5. 培养一批中青年学术人才：培养硕士，博士和博士后150名以上；建立以中青年为主体，在海水养殖鱼虾类免疫防治研究中具高度自主创新能力的团队，造就在国内外颇有影响力的中青年学科带头人。三、研究方案（一）学术思路本项目面对我国海水养殖业病害肆虐，形势严峻的现状，凝练出海水养殖动物主要病毒性疫病爆发机理及其免疫防治的科学问题，聚焦目标、突出重点，采用现代生命科学前沿技术、深入探索主要疫病爆发机理和免疫防治的科学基础。一方面，从病原角度研究侵染、致病机理及疫病爆发流行机制。另一方面，从宿主角度探讨抗感染免疫的分子和细胞基础，最终落足于为疫病防治提供免疫学基础与技术途径的目标上。与“十五”和“十一五”973计划支持的相关项目相比，本项目聚焦于危害重大的病毒性疫病，在继续强调病原与宿主相互作用关系的同时，重点关注疫病的爆发机理和疫病防治的免疫学方法和途径，把理论和实际、基础研究和国家需求紧密结合，目标更加明确。依据我国海水养殖业发展现状，充分考虑到脊椎动物和无脊椎动物在免疫防御机制上的显著差异，选取经济价值和科学价值并重的对虾和鱼类为研究重点，锁定造成广泛危害且研究最为深入的对虾白斑综合征病毒和鱼类虹彩病毒，集中研究病原感染和宿主免疫应答以及疫病爆发与流行机制。在疫病控制策略上强调免疫学防治方法与途径，重点研究阻断、激活和增强机体免疫防御能力的机理和有效途径，开发研制高效疫苗和抗病物质，并针对鱼、虾与陆生动物显著不同的生物学特点和水体环境，探索疫苗和免疫活性物质导入鱼、虾的机理及途径，为系统研制高效免疫制剂和疫苗提供理论和技术支撑。本项目将从病毒性疫病爆发和流行的分子病原学基础、宿主应对病原侵染的应答规律与疫病爆发机理、以及疫病防治的免疫学原理和有效技术途径三个关键科学问题入手，开展海水养殖动物主要疫病爆发机制和免疫防治的基础研究。研究内容既各有侧重，又相互关联，彼此支撑，形成一个有机整体。疫病爆发和流行机制的研究不仅揭示了疫病发生的分子机理，同时也为免疫防治基础研究提供了精准的分子靶标；宿主抗感染免疫机理阐释了病害发生过程中宿主的免疫反应机制，为疫病免疫防治研究提供关键思路。（二）技术途径1. 技术路线本项目将充分利用基因组学、转录组学、蛋白组学、生物信息学、分子免疫学等多学科的先进研究方法和技术，借鉴人类医学和畜禽疫病防治的新概念、新观点和新思路，从病原、宿主以及病原和宿主间的相互作用入手，开展多学科交叉研究，从分子水平探讨海水养殖动物疫病爆发的机制，发展疫病控制的免疫学技术，全面提升我国该领域基础研究水平，实现质的飞跃。技术路线如图1所示。图1 项目拟采取的技术路线2. 主要研究方法（1）疫病爆发流行的分子病原学基础利用免疫荧光技术、免疫电镜技术、PCR技术、从个体、组织、细胞和分子水平研究病毒侵染宿主的途径和靶标，检测病毒感染引起宿主机体损伤和死亡机制；利用CO-IP技术、酵母双杂交技术、Pull-down技术、蛋白组学等技术，分析病毒早期调控因子与宿主分子间的相互作用、病毒蛋白和miRNA对宿主免疫系统的调控机制和作用网络；利用基因组学、生物信息学技术和分子流行病学手段，结合病毒感染实验和免疫组化、电镜技术等调查分析疫病爆发的传染源，病毒遗传变异特征及致病力、宿主范围的差异，阐明疫病爆发的机制。（2）宿主应对病原侵染的应答规律与疫病爆发机理综合运用基因克隆、表达等分子生物学技术、生物信息学、DNA芯片、蛋白质组学、免疫共沉淀、pull-down技术、RNA干扰、免疫组织化学、比较免疫学、分子生态学等方法研究宿主免疫体系及其对病毒性病原侵染和环境变化的应答机理、信号转导关键途径及其与疫病爆发的关系等。（3）疫病防治的免疫学原理和关键技术途径在对虾白斑综合征防控方面，利用受体封闭、抗体中和、RNAi等技术阻断病毒感染和复制的途径；借助免疫学和现代生物学技术研究免疫活性物质的免疫增强机理；采用不同材料和包被携带方法对免疫活性物质进行加工处理，建立饲料添加、生物携带等新的导入途径。在鱼类疫苗研究方面，利用蛋白质组学与生物信息学方法筛选免疫原，利用分子生物学和基因工程方法构建疫苗表达载体，利用免疫组化等方法检测疫苗的组织分布，利用转录组学、蛋白质组学等方法检测免疫基因表达。采用系统生物学的研究思路和技术方法，建立疫苗保护效应的评价体系。（三）创新点与特色1. 学科理念创新提出海洋动物病毒功能基因组学和蛋白组学、分子流行病学、系统疫苗学等新的学科理念。在这些新的理念指导下，从病原与宿主的相互作用入手，系统诠释疫病爆发的机理，发展基于免疫学基础的疫病控制策略，将海水养殖动物疫病爆发和防治的基础研究提升到新高度。 2. 研究手段创新本项目将组学手段引入到病原的结构、感染和致病的过程，宿主免疫系统的组成和免疫应答过程，疫病爆发和流行等不同研究环节，全面系统了解病原致病机制、宿主免疫应答的调控网络和疫病爆发规律，在基因结构、基因的转录翻译和表达调控等层面将系统生物学的最新方法有机地应用于本项目研究，使本项目总体研究水平向国际医学和兽医学前沿趋势迈进。3. 研究思路创新本项目重点抓住具有普遍意义的天然免疫防御系统并将其中的关键因子及调控网络与适应性免疫系统进行比较分析，研究对象则针对具有我国特色的重要海水养殖动物对虾和鱼类，跨越了从无脊椎动物到脊椎动物的两大门类，研究探索免疫系统结构与功能及关键免疫分子和调控网络的起源与进化，有望在分子比较免疫学领域取得重要创新。4. 研究成果创新预期完成几个国内新近发现的病毒及其变异株基因组全序列测定，发现一系列新的致病基因和致病机制，建立完善虹彩病毒新分类体系；从对虾和鱼类中发现新的免疫抗病基因及免疫应答调控新途径，这些成就将大幅提升我国在国际同类研究中的地位。5. 特色的组织管理方式在“十五”和“十一五”973项目的基础上，由山东省科技厅和中国科学院具体组织中国科学院、教育部、农业部和国家海洋局等下属的全国海洋科学研究单位，进一步吸收国内优势单位的创新人才，组成一支研究队伍，为项目整体协调和研究工作的全面推进创造了条件。 （四）可行性分析1. 扎实的工作基础本项目继续瞄准我国海水养殖动物病害防治的重大需求，在“十五”973计划“重要海水养殖生物病害发生和抗病力的研究”和“十一五”973计划“重要海水养殖动物病害发生和免疫防治的基础研究”的基础上，聚焦目标，进一步深入研究。研究工作基础好、起点高。2. 雄厚的技术力量主要优势单位拥有此研究领域较强的技术平台，包括“有害生物控制与资源利用”和“微生物技术”国家重点实验室及9个省部级重点实验室，如中科院实验海洋生物学和海洋生物资源可持续利用两个重点实验室，国家教育部遗传学与育种重点实验室和水产养殖重点实验室、教育部动物疫病病原学与免疫控制重点实验室、教育部濒危动植物保护生物学重点实验室、教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，农业部海水养殖病害与生态重点开放实验室、农业部动物病毒学重点实验室，国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室，以及国际对虾白斑综合征和传染性皮下及造血组织坏死OIE参考实验室。各研究平台的优势互补并共享公用，所具备的仪器设备和研究手段基本满足本项目的要求。3. 创新的研究队伍通过“十五”和“十一五”973计划项目的实施，已经培养起一支在海水养殖动物病害发生和防治领域得到国内外认可、有一定创新能力的研究队伍。在此基础上，本项目根据研究内容的需要，更广泛地吸收国内相关单位的优势力量，组建成一支创新力强的研究团队。这支研究队伍继承和发扬团结协作、联合攻关的优良传统，加上项目的组织部门有成熟先进的管理经验，能够确保项目目标的圆满完成。4. 广泛的国际合作本项目的主要学术骨干与美国、加拿大、法国、新加坡、德国、荷兰、挪威，日本等同行专家建立了很好的合作关系，签订了多项合作协议，广泛开展了合作研究。通过国际合作和学术交流，及时掌握国际发展动态，借鉴和吸收国际同行成功的经验和研究成果，加强提高创新能力，保证本项目的研究工作在国际相同领域的前沿性，对提高成果水平将起到良好的促进作用。5. 成功的项目管理项目的承担单位和参加单位项目管理部门具有成熟的管理经验，对课题实施提供保障和支持，能够确保本项目的顺利实施和圆满完成。（五）课题设置课题一 对虾白斑综合征爆发的分子机制研究内容：1. WSSV感染早期病原与宿主的相互作用分析确定WSSV最先侵入虾体靶组织的分子证据，追踪病毒组分与细胞膜结合到进入细胞核的分子过程，从组织、细胞和分子水平揭示WSSV入侵机制；研究病毒早期调控因子与宿主细胞分子相互作用网络，阐明病毒调理并利用宿主生理机能进行自我复制的机理，揭示WSSV引发宿主病变的细胞和分子基础。2. WSSV由潜伏感染转为急性感染的诱因与机理研究养殖条件下WSSV潜伏性感染维持机制，分析WSSV潜伏感染转化为急性感染过程的关键诱因，阐明关键诱因对病毒感染调控的分子过程；研究并揭示养殖环境诱导对虾白斑综合征疫病爆发的分子机制。3. WSSV基因组变异与疫病爆发流行趋势针对不同毒力的WSSV毒株，分析WSSV基因组变异的规律及其与毒力之间的关系，筛选鉴定可变异的毒力基因并分析其对致病性的贡献；研究致病力差异对病原感染和传播能力的影响，揭示WSSV变异在疫病爆发流行中的作用。研究目标：1. 明确WSSV最初侵染靶组织以及在组织间传播的分子过程，揭示WSSV进入易感细胞的方式和机制。2. 阐明2个以上病毒早期调控因子对宿主细胞的调控机制及其与疾病发生的关系。3. 阐明WSSV潜伏性感染的机理，解析环境因子在WSSV潜伏感染转化为急性感染过程中的作用。4. 明确不同致病力的WSSV毒株之间的基因组差异及其变化规律，鉴定2个以上WSSV毒力因子，阐明毒力因子与疫病爆发和流行的关系。5. 发表SCI收录期刊论文20篇以上，其中影响因子大于5的3篇；申请发明专利4项；培养硕士20名，博士5名。课题负责人： 杨 丰承担单位： 国家海洋局第三海洋研究所、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中国海洋大学、中山大学经费比例： 15.5% 课题二 鱼类虹彩病毒病爆发的细胞基础与分子机制 研究内容： 1. 虹彩病毒感染与疫病爆发的细胞和分子基础 在组织水平研究病毒侵染和传播途径，分析病毒作用的靶组织和细胞；在细胞水平研究病毒对宿主细胞的识别、细胞内吞与胞内迁移过程，阐明鱼类虹彩病毒感染与疫病爆发的分子基础。 2. 虹彩病毒对宿主细胞机能的操控机制 研究病毒、病毒编码的基因对宿主基因、细胞信号通路和调控网络的操控作用；分析病毒非编码的miRNA对病毒和宿主细胞的作用靶点及作用机制，揭示病毒对宿主细胞机能的操控机制。 3. 虹彩病毒遗传变异特征与疫病爆发流行机制 研究不同地域和不同水体环境条件下鱼类虹彩病毒的感染性和宿主范围，鉴定不同来源病毒的遗传特征，分析养殖鱼类虹彩病毒病传染源，研究不同病毒种株的遗传与演化特征，揭示感染和传播途径，阐明虹彩病毒致病株感染致病分子机理及疫病爆发流行的规律。研究目标： 1. 构建1-2种具有感染性的荧光标记重组虹彩病毒，阐明鱼类虹彩病毒侵染的靶组织、侵染途径和增殖方式；确定6-8个病毒参与侵染和致病的关键基因，以及4-6个与其相互作用的模式识别受体；揭示鱼类虹彩病毒感染与疾病暴发的分子基础。 2. 揭示病毒对鱼类宿主细胞机能具有操控作用的关键基因5-6个、miRNA3-4个，以及与其相互作用的信号分子和信号通路，初步阐明虹彩病毒对鱼类细胞机能的调控网络和操控机制。 3. 阐明3-4种鱼类虹彩病毒致病株的遗传与演化特征，揭示虹彩病毒感染致病的遗传变异与疫病爆发流行规律。 4. 在国际期刊发表SCI论文20-25篇，其中在TOP期刊发表论文8篇以上。 5. 建设一支具有国际竞争力的研究团队，培养研究生20名以上。课题负责人： 秦启伟承担单位： 中国科学院南海海洋研究所、国家海洋局第三海洋研究所、浙江大学、中山大学、中国科学院海洋研究所经费比例： 15.5%课题三 对虾免疫系统对WSSV感染的响应过程与特征研究内容：1. 对虾抗WSSV感染的关键基因及次生代谢产物利用组学技术研究对虾相关基因在不同组织、病毒感染的不同时间转录和翻译水平的变化，明确对虾抗病毒感染的关键基因；采用GC-MS、LC-MS技术，比较对虾在病毒感染前后产生的次生代谢产物，确定与病毒感染密切相关的次生代谢产物及其免疫调节作用。2. 对虾应对WSSV感染的信号转导及调控网络重点研究对虾对病毒的模式识别受体、信号传导分子和效应分子，确定NF-kB、JAK/STAT、MAPK途径和RNA干扰途径在对虾抗病毒免疫中的功能及其交互作用；研究并阐明次生代谢产物在细胞吞噬和细胞凋亡信号转导中的作用。3. 对虾免疫稳态的调节及白斑综合征爆发过程分析比较不同种类对虾在慢性感染期和急性感染期的免疫反应，揭示对虾白斑综合征疫病爆发的主要免疫学特征；研究关键环境因子（如温度、溶解氧等）骤变对对虾免疫稳态的影响，确定关键环境因子与对虾白斑综合征爆发的关系。研究目标：1. 鉴定对虾抗病毒的关键基因/蛋白8个以上。2. 获得具有抗病毒活性的次生代谢产物2个以上，抗病毒保护率达到50%以上。3. 阐明对虾抗病毒的信号转导通路，从而建立以对虾为代表的甲壳类动物天然免疫系统的基本框架结构。4. 申请国家发明专利8-10项；发表SCI收录论文30-40篇，其中在病毒学领域、水产领域和相关领域国际权威期刊发表论文不少于20篇。5. 培养研究生10-15人，博士后2-3人。课题负责人： 相建海承担单位： 中国科学院海洋研究所、浙江大学、国家海洋局第三海洋研究所、厦门大学经费比例： 17% 课题四 鱼类应对虹彩病毒感染的免疫反应与调控网络研究内容：1. 鱼类应对病原感染的天然免疫反应关键途径与调控研究鱼类模式识别受体的结构功能、表达调控，揭示受体识别病毒的分子机制；研究干扰素免疫系统的组成与信号通路调控以及新型抗微生物多肽基因的表达调控与作用，阐明宿主清除病原的分子机理。2. 鱼类应对病原感染的适应性免疫激活、维持与调控网络研究并揭示鱼类参与抗病原感染的T细胞和B细胞亚群的免疫遗传表型和分化发育规律；研究抗原递呈细胞活化初始T细胞的途径，分析细胞免疫和体液免疫以及Treg免疫抑制的形成机制，阐明其在抗病毒侵染中的作用；研究并查明抗病毒适应性免疫的形成和维持的细胞与分子基础及关键调控网络。3. 鱼类抗病毒感染的环境因素及其免疫调控分析鱼类病毒病发生的环境诱因，明确环境因素与鱼类抗病力的耦合关系；研究不同环境因素对鱼类抗病毒免疫力的影响，揭示鱼类应对环境胁迫的免疫信号通路及其调控网络；研究并阐明环境因素对免疫力亲子传递与维持的影响。研究目标：1. 确立鱼类识别病毒的关键基因和蛋白15个、防御病毒的关键基因和蛋白15个，阐明宿主识别与清除病原的分子机理。2. 明确鱼类应对病原感染的免疫反应关键途径2-3条、调控网络2-3个，确立环境胁迫影响鱼类抗病力的机制，为疫病防治奠定理论基础。3. 为鱼类疫苗、免疫佐剂和抗病毒制剂的开发和应用，提供符合鱼类免疫机理和特点的、有针对性的理论指导。4. 在国际相关刊物发表SCI论文25-30篇；申请国家发明专利3-5项。5. 培养博士生20名，硕士研究生20名，博士后2名。课题负责人： 张士璀承担单位： 中国海洋大学、浙江大学、中国科学院南海海洋研究所、中国科学院海洋研究所经费比例： 15.5%课题五 对虾白斑综合征防治的免疫学途径和关键技术原理研究内容：1. 阻断或抑制WSSV侵染与复制的原理和途径优选调控WSSV侵染与复制的关键靶标，研究针对病毒入侵、复制、组装和传播等关键过程的阻断、抑制和干扰技术原理；应用受体封闭、竞争抑制和RNAi等方法与途径，实现对WSSV侵染的有效阻断。2. 对虾免疫系统激活与调节的技术原理研究对虾抗感染的关键免疫因子的激活途径和利用原理；优选可调控关键免疫因子的免疫激活与调节制剂；发展维持对虾免疫稳态的环境与生态操控技术，找出提高对虾抗WSSV感染免疫力的有效方法与技术途径。3. 免疫活性物质导入途径与技术研究免疫活性物质的不同包被处理方法和导入方式，分析比较摄取、吸收和免疫增强效果，确定高效导入途径；研究使用共生菌载体直接导入免疫效应分子的技术原理。研究目标：1. 定位WSSV侵染过程中病毒与宿主关键蛋白或基因；获得3-4种可有效阻断WSSV入侵的特异性抗体；构建具有稳定阻断效果的RNAi载体，为对虾白斑病等病害的防治开辟新途径。2. 明确不同类型免疫增强剂的免疫增强机理，筛选到4-6种高效、健康的免疫增强剂；明确不同类型免疫增强剂的免疫机理；鉴定WSSV感染相关对虾主要免疫因子，阐明其功能。3. 获得2-3株能有效阻断WSSV入侵的特异性抗体的活性单链抗体；实现3-5种抗病免疫因子基因在酵母或细菌中的高效表达，获得具有相应生物学活性的重组蛋白；优化对虾抗病生物活性物质导入途径。4. 筛选到2-3种可增强对虾抗病力的养殖环境友好型外源生物。5. 发表学术论文20-25篇；申请发明专利 3-5项，培养研究生30-40名。课题负责人： 宋林生承担单位： 中国科学院海洋研究所、中国海洋大学、中国水产科学研究院黄海水产研究所、山东大学、天津师范大学经费比例： 21%课题六 鱼类疫病免疫防治的系统疫苗学原理与技术途径研究内容：1. 疫苗的设计与传递策略针对危害严重的鱼类虹彩病毒等主要疫病病原，基于免疫学、生物信息学和组学技术，筛选免疫原，确定保护原，开发新型疫苗、免疫佐剂和疫苗递呈载体，建立高效疫苗的设计与导入技术。2. 疫苗的效应机制研究不同接种途径疫苗被宿主细胞的摄取效率，分析疫苗在宿主组织中的分布及稳定性；研究抗原的激活与信号传递，分析疫苗诱发的免疫应答特征并确定其与疫苗保护效应的关系。3. 疫苗的免疫效应指示和评价体系基于疫苗效应机制研究，优选关键免疫分子，对比疫苗接种的实际免疫保护效果，针对不同类型疫苗和代表性重要经济鱼类，确定疫苗效应的分子指示，建立疫苗效应的评价体系。待添加的隐藏文字内容2研究目标：1. 建立鱼类病毒疫苗的设计策略和疫苗的高效表达与导入技术。2. 构建5个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70；筛选出3个高效免疫佐剂，其能够提高免疫保护效率15以上。3. 初步阐明一种疫苗的免疫效应机制和一种疫苗佐剂的作用机制。4. 建立一种疫苗效应的实验室评价体系。5. 发表SCI收录论文30篇，其中10篇发表于相关研究领域TOP学术刊物；申请国家发明专利10项。6. 培养硕士和博士研究生15-20名。课题负责人： 孙 黎承担单位： 中国科学院海洋研究所、中山大学、中国科学院南海海洋研究所、中国海洋大学经费比例： 15.5%（六）课题间关系从病原角度，设置2个课题，分别对对虾和海水鱼类的主要病原（WSSV和鱼类虹彩病毒）开展致病因子及其与宿主相互作用机制和分子流行病学研究，以查明病原的致病机理及疫病爆发流行的机制，为免疫防治提供关键分子靶位。在宿主免疫系统方面，设置2个课题，分别研究对虾、鱼类抗病毒侵染的关键分子过程、调控网络及其与环境关系，其研究结果将有助于揭示宿主抗感染机制，也为免疫防治提供重要理论依据。宿主和病原之间存在相互作用，这两个课题承上启下，贯穿整个项目。以前4个课题为基础，设置课题5和课题6，研究阻断病原感染或提高宿主免疫力的原理与应用途径。以上课题设置及其相互关系见图2所示。图2. 六个课题的设置及其相互关系四、年度计划（一）第一年度计划内容和目标1. 研究内容（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：制备高纯度的WSSV经口服或鳃涂布攻毒后，用定量PCR和电镜技术分析WSSV的入侵途径、最初感染的组织及在组织间传播的方式；WSSV潜伏感染对虾模型的建立，研究诱导WSSV潜伏感染转为急性感染的理化因子；对WSSV极早期基因启动子进行缺失突变，寻找最小功能元件；分析不同WSSV分离株的毒力，研究近年WSSV流行株基因型特征及演化规律；，测定3-5株致病力差异大的毒株全基因组，通过序列比对，找出差异基因作为候选毒力基因。构建、筛选纯化有感染性的荧光标记重组鱼类虹彩病毒；鉴定病毒基因功能，研究其与病毒感染力及侵染的关系；预测虹彩病毒miRNA潜在的病毒或宿主基因靶标；调查不同生境中的鱼类虹彩病毒。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制： 利用组学技术研究对虾和鱼类相关基因在不同组织、病毒感染的不同时期转录和翻译水平的变化，筛查抗病毒感染的关键基因；深入研究比较免疫识别蛋白、信号转导分子和效应分子的结构特征、组织分布和表达调控规律；研究鱼类干扰素免疫系统相关基因，研究其表达与组织分布；分离鉴定新型抗微生物多肽，克隆新型抗微生物多肽基因；分离鱼类参与抗病原感染的鱼类T、B细胞等关键免疫细胞，研究其免疫遗传表型。（3）免疫防治的原理和技术：筛选和鉴定WSSV侵染的黏附蛋白和对虾抵抗WSSV侵染的关键免疫因子；RNAi技术体系的构建；筛选免疫增强剂和养殖环境友好型外源微生物。运用免疫学、生物信息学和组学等技术，系统筛选虹彩病毒免疫原，检测其保护效应；确定免疫保护抗原，构建抗原表达载体，检测载体的稳定性。2. 预期目标（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：初步确定WSSV在个体水平的入侵途径、最初感染的组织及在组织间传播的方式；获得WSSV极早期基因启动子的最小功能元件；建立WSSV潜伏感染凡纳滨对虾模型；获得3-5株毒力差异株的全序列，获得候选毒力基因。成功获得1-2株有感染性的荧光标记重组鱼类虹彩病毒；确定2-3个病毒参与侵染和致病的关键基因；筛选得到虹彩病毒miRNA的病毒或宿主靶基因；初步确定虹彩病毒疫病爆发流行情况。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制：筛选获得对虾在WSSV感染后差异表达的重要基因或蛋白20个以上；克隆获得参与鱼虾抗病毒体液免疫的重要基因10-15个，分析其基因结构特征和表达特征；得到参与抗病毒细胞免疫的重要基因序列2-3个；分离鉴定鱼类T、B等免疫细胞亚群。（3）免疫防治的原理和技术：鉴定出WSSV侵染的关键蛋白和对虾抵抗WSSV侵染的主要免疫因子；初步建立起对虾RNAi的技术体系；克隆到1-2个免疫因子基因，并阐明其可能的抗病毒机理；筛选2-3种免疫增强剂，确定免疫增强效果；获得候选的养殖环境友好型外源生物；获得4种免疫保护原，建立保护原的表达技术。（4）论文发表、专利申请和研究生培养：发表SCI源刊物论文20-25篇，申请专利4-6项，培养研究生20名。（二）第二年度计划内容和目标1. 研究内容（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：用电镜技术或荧光标记技术研究WSSV进入细胞的过程，判断病毒是通过直接膜融合还是内吞的方式进入细胞；筛选能结合WSSV极早期基因启动子的宿主细胞转录因子；利用免疫共沉淀和凝胶阻滞实验筛选WSSV早期调控因子作用靶分子；确定诱发WSSV潜伏转为急性感染的关键理化因子及其浓度；对候选毒力基因进行初步的功能预测和克隆，在昆虫细胞或原代虾细胞中过量表达，分析对细胞是否产生直接影响或伤害，确定主要的毒力基因。观察重组虹彩病毒感染后不同阶段细胞内感染轨迹和病毒入侵途径；克隆、鉴定与病毒感染相关的模式识别受体基因，研究其在病毒黏附和入侵过程中的作用；开展鱼类虹彩病毒及病毒基因对宿主免疫信号分子的调节作用；研究虹彩病毒miRNA对病毒或宿主靶标基因的调节作用；继续调查和比较不同种类虹彩病毒的宿主范围。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制：研究鱼虾对病毒的识别分子、信号传导分子和效应分子的功能和表达调控，揭示受体识别病毒的分子机制；研究在对虾细胞吞噬免疫反应中起关键作用的基因及其表达调控；采用GC-MS、LC-MS技术，比较对虾在病毒感染前后产生的免疫效应产物；研究在养殖温度、溶解氧等环境因子骤变条件下白斑综合征病毒在对虾体内的复制变化特征；研究干扰素免疫系统信号通路的调控作用；研究抗微生物多肽基因的表达、调控与功能；研究鱼类参与抗病原感染的T、B等免疫细胞亚群的分化发育规律。（3）免疫防治的原理和技术：利用中和抗体和受体抗体阻断WSSV侵染技术的建立；筛选和鉴定WSSV大规模复制的关键蛋白；构建具有高效、稳定阻断作用的RNAi载体；继续免疫因子鉴定和基因克隆，进行主要免疫因子基因的重组表达；开展免疫增强剂作用机理研究；分析养殖环境友好型外源微生物的生态功能。在鱼类方面着重开展疫苗免疫佐剂筛选研究，利用免疫保护原及其表达载体，设计、构建高效病毒疫苗，检测疫苗的免疫保护效应；研究疫苗的口服/浸泡、注射等传递技术，比较其效应，确定有效的免疫途径。2. 预期目标（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：明确WSSV病毒是通过膜融合还是内吞的方式进入对虾细胞；获得2个以上可能与极早期基因启动子结合的宿主细胞转录因子；获得2个以上WSSV早期调控因子的潜在靶分子；确定2个以上诱发WSSV潜伏感染转为急性的关键环境因子；确定主要的毒力基因2个以上。阐明鱼类虹彩病毒侵染的运动轨迹及复制方式；确定2-3个与病毒黏附或入侵相关的模式识别受体；确定1-2个对宿主细胞机能具有调控作用的病毒基因；确定1-2个对病毒复制或宿主免疫系统具有调节作用的虹彩病毒miRNA；确定虹彩病毒的宿主范围，揭示其流行特征。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制：获得对虾抗WSSV感染的关键候选分子3个以上，明确其在组织、细胞中的定位；阐明细胞吞噬的信号转导通路及其抗WSSV作用；初步查明在不同环境因子条件下虾体内WSSV数量的消长变化规律。获取鱼类模式识别/效应分子关键基因10-15个，明确其表达和功能；阐明鱼类T、B等免疫细胞亚群分化规律。（3）免疫防治的原理和技术：初步建立单克隆抗体阻断WSSV侵染的技术；鉴定出负责WSSV复制的关键蛋白；构建出导入效果较佳的RNAi载体；获得有具有生物学活性的重组免疫因子3-5个；筛选免疫增强剂2-3种，明确其作用机理；明确微生物在对虾养殖生态系统中的营养及生态防病功能；构建出1个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70；获得1个高效免疫佐剂，其能够提高免疫保护效率15；建立1种疫苗的高效导入技术。（4）论文发表、专利申请和研究生培养：发表SCI论文30篇，申请专利6项，培养博士后和研究生共30名。（三）第三年度计划内容和目标1. 研究内容（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：应用针对性的阻断剂对WSSV穿透过程（Penetration）进行阻断，确认病毒借助了哪条途径进入细胞；应用亚细胞结构的标志物并结合通路阻断剂，分析WSSV如何在细胞内运输并将遗传物质传递入核；验证细胞转录因子与WSSV极早期基因启动子的相互作用，进一步确认极早期蛋白与靶分子的结合；研究关键环境因子对对虾免疫相关信号转导途径及其系列基因的影响，确定环境影响的关键信号转导途径和基因；通过RNA干扰的方法，对候选毒力基因进行沉默，比对分析宿主机体损伤的程度，并对感染虾的死亡率进行比较，评估毒力基因与致病力的关系。研究分析重组虹彩病毒感染后不同阶段组织内感染轨迹、病毒入侵途径；继续开展虹彩病毒关键致病基因的功能研究；继续克隆鉴定病毒感染相关的模式识别受体，深入研究其在病毒黏附和入侵过程中的作用；继续开展鱼类虹彩病毒基因对宿主信号通路的调节作用；开展鱼类虹彩病毒的遗传变异规律研究。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制：研究体液免疫信号通路（TOLL, MAPK等）在对虾抗病毒免疫中的作用；研究非编码小RNA在细胞凋亡中的表达调控机制及其在对虾抗病毒中的作用；筛选抗病毒感染的免疫效应产物；研究环境胁迫对虾类免疫稳态的影响。分离鉴定构成鱼类重要免疫信号转导途径（包括干扰素调节途径）的关键元件；研究不同环境因素对鱼类免疫信号通路及其调控网络的影响；研究新型抗微生物多肽基因的作用机制；研究抗原递呈细胞活化初始T细胞的机制，分析细胞免疫和体液免疫以及Treg免疫抑制的形成机制，阐明其在抗病毒侵染中的作用。（3）免疫防治的原理和技术：筛选能阻断WSSV侵染的单克隆抗体；分析RNAi对WSSV复制的抑制效果；鉴定重组免疫因子抗病毒的活性；优选免疫增强剂；确定不同免疫增强剂间相互促进/协同或颉抗关系；分析养殖环境友好型外源生物作用于对虾的机制。设计、构建不同类型疫苗，筛选疫苗免疫佐剂，分析佐剂的免疫效应；研究不同接种途径疫苗被宿主细胞的摄取效率，分析疫苗在宿主组织中的分布及稳定性。2. 预期目标（1）WSSV和虹彩病毒的侵染与致病：确认WSSV进入细胞并将遗传物质传递入核的途径；明确极早期基因及其产物与宿主分子的相互作用；揭示环境因子影响的主要对虾信号转导途径和基因；了解主要WSSV毒力基因与致病力的关系。阐明鱼类虹彩病毒侵染的靶组织和侵染途径；确定2-3个病毒参与侵染和致病的关键基因；鉴定2-3个与病毒黏附或入侵相关的模式识别受体；确定能够调节宿主免疫信号通路的2-3个病毒基因；初步揭示鱼类虹彩病毒的遗传变异特征。（2）对虾和鱼类的免疫防御机制：确定对虾体液免疫中的关键分子在抗WSSV感染过程中的作用；阐明细胞凋亡的miRNA调控信号转导通路及其抗病毒作用；揭示对虾在WSSV慢性感染和急性感染中免疫响应特征的异同。累计获取鱼类模式识别/效应分子关键基因不少于30个，明确其表达和部分基因功能；阐明抗原递呈细胞活化初始T细胞的机制。（3）免疫防治的原理和技术：筛选出具有阻断效果的单克隆抗体和能阻断WSSV复制的干扰基因片段；鉴定出具有抗病毒活性的重组免疫因子；优化出3-5种效果明显的免疫增强剂，确定它们间的协同机制；明确养殖环境友好型外源生物的作用机制。构建2个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70；获得2个高效免疫佐剂，其能够提高免疫保护效率15；初步阐明1种佐剂的作用机制。（4）论文发表、专利申请和研究生培养：发表SCI论文30-40篇，申请专利8项以上，培养博士后和研究生30名以上。（四）第四年度计划内容和目标1. 研究内容（