生物学实验室仪器的应用与实验技术(1).ppt

生物学实验室仪器的应用与实验技术 The applications and techniques of experimental equipments in biology,张学琴生命科学大楼4027室Tel:62732654,62734837Email:zhangxq711-,本课程主要介绍生物学实验所用的常用仪器及其在生物研究中的应用。主要包括：离心技术（超速和高速）；光谱技术（紫外、原子、荧光）；基因芯片技术 显微技术（Confocal，etc)；定量PCR技术 蛋白质组学 液质联仪,参考书：1、周先碗胡晓倩编生物化学仪器分析与实验技术化学工业出版社（第三版）2、王立汪正范牟世芬丁晓静编著色谱分析样品处理化学工业出版社3、师治贤王俊德编著生物大分子的液相色谱分离和制备科学出版社（第二版）4、5、,结课方式：考试（50%）课程论文（50%）,一、离心技术二、离心机的种类三、离心机和转头的维护四、离心机的事故五、离心技术在样品制备中的作用,第一章离心技术,1.离心机发展历史2.基本概念3.离心分离方法,一、离心技术,19世纪手摇离心机蜂蜜、牛奶20世纪超速离心机生物学、医 学、制药工业等广泛应用。,1.离心机发展历史,1923年 瑞典化学家Svedberg 第一台具有光学系统的分析超速离心机，最高转速达45,000rpm。1926年Svedberg测定马血红蛋白分子量，首次证明蛋白质为均一的生物大分子。1940年Svedberg和同事Pederson撰写世界上第一本有关离心技术的专著。,超速离心技术发展阶段,1951年Brakke M K 在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。1955年Anderson N G发明了区带转头，并用区带离心法首次证明DNA双螺旋结构半保留复制的假说。,离心机制造工艺；区带转头；高强度的钛合金的应用；半导体集成电路；计算机技术的发展；高频调速电机的使用。,1、基本概念,(1)、离心技术（Centrifuge Technique）:利用物质在离心力作用下，按其沉降系数不同而分离的一种技术。,=gt(g为重力加速度，980cm/s2)。,物体在沉降过程中，其下沉的力在某个时刻总会与摩擦力、浮力达到平衡，使物体的受力为零，此时物体在做匀速运动，此时的速度称为临界速度。,一个球型颗粒在具有重力场中的液体介质内，受到地球引力、溶液浮力和溶液黏滞力的作用，出现不同的运动（粘滞力和浮力向上，重力向下）。重力Fg1/6d3pg(d为颗粒直径，为颗粒密度，g为重力加速度)。,（3）颗粒在重力场的运动,粘滞力Ff=-3dV(V为颗粒沉降速度)浮力Fb=-1/6 d3m g(m为介质密度),当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运动，即达到临界速度，作用力的关系式为：Fg=Fb+Ff；Vd2(p-m)g/18,（a）、与颗粒直径d2的大小成正比，颗粒大沉降快。（b）、与颗粒和介质密度差(p-m)成正比，密度之差越大，沉降越快。（c）、当pm，颗粒沉降速度为正值，即颗粒在介质中往下沉；等于，做不定向运动；小于，颗粒在介质中上浮。,Vd2(p-m)g/18,（d）、与引力g成正比，速度随着引力的增加而增加。（e）、与介质粘度成反比，速度随粘度的增加而降低,（4）颗粒在离心场中的沉降,5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力,从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于分离生物材料的样品，如细胞、细胞器、细菌、病毒、蛋白质和核酸等生物大分子来说，由于颗粒非常细小，依靠自然沉降是不能达到完全分离的，只能通过离心力的作用才能使它们沉降下来。,离心力的产生,离心场的受力：G2r,物体在围绕转轴以角速度旋转时，就产生离心场，物体在离心场中受到离心力的作用。,电机的速度以每分钟的转数（r/min）表示。,G2r42N2r/3600,(N为每分钟的转数，单位为r/min；G的单位是cm/s2，正好与重力加速度g的单位一致。),在实践中，离心力可用重力加速度的倍数G/g来表示，称之为相对离心力，用RCF表示，可将公式写成：RCFG/g=(42N2r/3600)/980=1.1210-5N2rN=1000(RCF/11.2r)1/2,相对离心力（RCF）,因此，超速离心常用重力加速度的倍数（g）来代替转速（r/min），真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。,一般，低速离心，转速以r/min表示；高速离心，转速以重力加速度g表示。,计算颗粒相对离心力时，应注意离心管与中心轴间的距离，即离心半径r的长度。离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。,沉降系数（sedimentation coefficient,S）,沉降系数是生物大分子的特征常数，与颗粒密度、形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都有关系。,20，以水为介质的条件下，测得S值为标准状态下的S值。,1S=10-13秒,K因子(表示沉降系数为s的颗粒，在转头的最大速度下离心时，颗粒从小半径沉降到大半径所需要的时间。),t=K/s表示从离心管表面沉降到离心管底所需要的时间。K是转头的实际参数,沉降与相关因素,t=(1013/3600)(lnrb-lnrm)/2srb：轴与离心管间距离Rm：轴与管液面间距离,3.离心分离方法,沉淀离心差速离心速率区带离心等密度离心淘洗离心连续流离心,（1）、沉淀离心常用方法。指介质密度约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称沉淀离心。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。,颗粒沉降离心中的两个因素：相对离心力（g）和时间（min）沉降某颗粒需10,000g*min,凡是利用颗粒在离心场中的沉降系数差异进行逐级分离的离心方法，称差速离心。差速离心是建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降存在较大的差异的基础上进行分离的方法。一般用于粗级分离，而不用于精细分离。,（2）、差速分级离心,（3）、密度梯度离心凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯度离心或称区带离心。分辨率比差速离心高：差速离心沉降系数相差10倍以上；密度梯度离心沉降系数相差10%20%s的颗粒或颗粒或密度差小于0.01g/ml的组分。,两种类型：速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。,可分离与密度介质相当的细胞、细胞器、DNA和蛋白质，分离效果只与分离物质的的大小有关，与介质的密度无关。,等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。,在等密度介质中的密度范围正好包括所有分离颗粒的密度。样品可以加在制成的梯度介质的上面，也可以与密度介质混合在一起，离心后会形成自成型梯度。,颗粒在等密度梯度的介质中，经过离心，最终将停留在与其浮力密度相等的区域内，形成一个区带。颗粒密度和介质密度达到平衡时，所形成的颗粒区带就停止运动，延长离心时间对离心效果无明显影响，即此时与离心时间无关。,密度梯度离心的制备：,密度梯度溶液,不均一，密度随着旋转半径的增加而增加,e.g.5%（1.018g/ml）20%(1.077g/ml)蔗糖为梯度液,密度梯度材料,氯化锂，氯化铯，氯化铷，酒石酸钾，甘油，蔗糖和聚蔗糖等。,不能与样品发生化学反应pH、渗透压不能影响所用的测量技术，e.g.蛋白质280nm不能对转头有腐蚀,预成型梯度：线性梯度，不连续的阶梯梯度，指数梯度自成型梯度,不连续梯度通过手工制作梯度界面不能破坏连续梯度：梯度混合器,用注射器将样液加在梯度液上面样品体积和浓度适量注意：离心管内的梯度液可承受的样品的最大浓度为该密度梯度液中最低密度梯度浓度的1/10。,等密度加样：样液加在密度介质的上面或与密度介质混合在一起。,不要污染样品不要破坏梯度的稳定性在操作过程中不能使气泡进入梯度中,手工回收,二、离心机的种类,1.按离心机的速度：（1）、低速离心机最大转速（Vmax）一般在6000r/min。（2）、高速离心机Vmax 25000 r/min（3）、超速离心机Vmax 100000 r/min,(一)、分类,2.按离心机的用途：（1）、小型离心机小量快速离心（2）、制备型大容量低速离心机Vmax 6000 r/min，最大离心力6000g，最大容量达500ml6。（3）、高速冷冻离心机Vmax1800021000 r/min，最大离心力在50000g。适用于细胞和 亚细胞 的分离。,（4）、超速离心机最大离心力可达800000g，可进行小量制备，适用于蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的制备。（5）、分析型离心机用于生物大分子定性、定量分析。（6）、连续流离心机处理类似于发酵液等特大体积、浓度较稀的样品，最大离心速度与高速离心机相似。,3.按离心机的驱动系统：（1）、空气驱动离心机（2）、油涡轮驱动离心机（3）、电刷电机驱动离心机（4）、变频电机驱动离心机,（二）、基本结构,真空系统,（1）、分类角转头适用于差速离心、等密度离心，容量大，转头内容纳的离心管多。水平转头离心管组装在转头的吊桶内，离心机静止状态时离心管为垂直状态，离心时离心管与轴垂直。适合于区带离心和等密度离心。垂直转头适合于质粒DNA的纯化，不适合于差速离心。近垂直转头对质粒DNA和RNA的分离纯化特别有效。区带转头 连续流转头,1.转头,（2）、性能 铝合金转头 适合于pH6-8的中性溶液离心 用中性溶液洗涤 强度不高，易加工，易碰伤。高浓度盐长期接触会产生内结晶，影 响转头的强度。温度不得超过60,更不能用高温灭菌处理 价格便宜，使用寿命短。不锈钢转头耐腐蚀，对酸、碱、盐溶液均适宜。机械强度高，加工难。质量大，离心速度不高。使用寿命长，价格较便宜。,钛合金转头耐腐蚀，对酸、碱（pH3.5-11）溶液均适宜。机械强度高，加工难。质量较大，离心速度高。使用寿命长，价格较贵。碳素转头 质量轻，有利于提速。耐腐蚀，在偏酸性或偏碱性的溶液中均可使用。机械强度高，加工容易。使用寿命长，价格昂贵。,(3).转头的主要参数 最大转速转头的抗拉强度是有限的，与转头的类型、构造和材料有关 最大离心力 最大容量每个转头中容纳离心管数乘以离心管的最大体积就是该转头的最大容量。K因子在最大的转头速度下，由最小半径沉降到最大半径所需要的时间。K越小，离心能力越大。,(三)、离心机和转头,Beckman LE-80K(Optimal系列)转头：SW28SW55Ti90,超速离心机,植物生理学与生物化学国家重点实验室 仪器室离心机有的关配置,落地式超速离心机 2台台式超速离心机 1+1台 落地式高速冷冻离心机 2台台式高速冷冻离心机 1台,超速转头(rotors)配置,SW2828,000rpm14,1000g,SW5555,000rpm368,000g,Ti9090,000rpm695,000g,台式超速离心机,高速离心机,R22A222,000rpm51,200g50ml*6=300ml,R12A312,000rpm23,800g300ml*6=1,800ml,R10S10,000rpm16,470g50ml*4=200ml,三、离心机和转头的维护,1.离心机安全操作,不过速运转平衡运转准确组装转头不使用带伤转头不使用过期转头,2.离心机的维护 每次用毕，对于超速离心机，只需定期清洁离心机内腔。对于高速离心机，每次必须将内腔擦干，且不能长期将转头置于转轴上，以免传感器受潮失灵。,3.转头的维护 离心机转头，如果忽视其设置的精密程度和严格的使用方法，就会大大影响它的奉命。事实上，一个转头在承受一百万倍的大气压下，一克就相当于一吨的重量，若转头的表面有很细微的裂缝，对转头就会造成很大的影响，此影响可能会超过转头原本设置所能承受的范围。,（1）维护转头寿命的三个因素：专门的设计和制造使用中的注意事项和合理的操作当损坏或因疲劳连续使用而产生 不安全时，转头必须停用,转头的设计与制造一般的生产厂家，在制造转头时，会进行转头/马达系统的震动测试。它们会在一个特殊构造的房间里进行非破坏性和破坏性试验，来检验转头的寿命。,引起离心机转头损坏的原因金属疲劳化学腐蚀应力腐蚀,金属疲劳转子在加速过程中，材料内部多次重复受到拉伸或松驰的交变引力的作用，引起材料结构细微变化，经过一定次数的交变引力循环，这些细微变化导致极细微的裂纹。,化学腐蚀由于所用的离心管不能承受介质的性质，或者离心管存放太久，老化后受不了强离心力的缘故，会造成离心管的破裂，样品渗漏到转头内。若没按规定程序操作，造成转头不密封，当抽真空时，转头内腔产生负压，也会样品渗漏，对转头产生化学腐蚀而严重影响转头的寿命。,应力腐蚀应力腐蚀是金属疲劳和化学腐蚀两者同时作用产生的结果。当转头某部分因受化学腐蚀或破损后，该部分所承受的引力增大了，此种情况下，转头便会很容易毁坏。,（2）转头操作的注意事项避免CsCl结晶 CsCl温度过低产生结晶，沉降就会胀破离心管，从而损坏转头。转头需加盖由于疏忽大意，勿将转头盖盖紧，或忘记加盖，当转头运行时，离心腔内会产生空气旋涡使转头浮起，转头离开转轴而发生意外。因此在仪器启动时，应再检查转头盖是否已盖紧。,注意溶液密度对转头速度的限额 溶液密度大小对转头强度受力有很大关系，在进行密度梯度或等密度离心时，配置的介质密度必须低于说明书中标记的转头所能承受的最大密度。若高于该密度，可用下列公式计算最大速度：当采用塑料管戴硬铝帽、样品比重大于1.2，新的最大速度转子最大转速(1.2/新的密度)1/2 当采用不锈钢管戴硬铝帽，样品比重小于1.2，最大允许转速必须减少设定速度的15%，即最大允许速度最大设定转速（115%）当采用不锈钢管及管帽、样品比重小于1.2时，最大设定转速必须减少25%,（3）转头的保养转头的清洁所有的转头使用后必须用温水洗涤并干燥，如果必须使用去污剂，则不应使用碱性去污剂。转头干燥，涂油保养严禁将转头浸泡在去污剂中。冲净后的转头必须干燥，通常在室温下将转头倒置自然干燥。转头外表可稍涂些硅脂保护表面，转头内壁腔可涂上硅油保护。密封圈转头盖与吊桶内壁的密封圈可使转头和离心管在密封的情况下运行，如果密封圈老化，转头内便因离心腔抽真空而形负压，使离心管破裂或渗漏损坏转头。因此，密封圈如有损坏，应及时更换，更换前应涂上真空脂，加强保护。,超速盘的更换为了保证转子的正常运行，使用前必须检测超速盘有否磨损，转子使用后，将转子清洗倒放在实验桌上。当发现转子底部的超速盘损坏或磨损，必须立即更换。首先将损坏的超速盘取下，然后用四氯化碳有机溶剂清洗干净，再将备用的超速盘换上。转头寿命的折算一般是最大转速的次数。若转头动作已超过其寿命保证期，在没有任何损伤的情况下，转头应按90%折算后再继续使用。,四、离心机的事故,正在旋转,后果,五、离心技术在样品制备中的作用,分离活体生物：细胞、微生物、病毒细胞器：细胞核、细胞膜、线粒体生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多聚物,植物细胞膜的提取和纯化,新鲜材料或冻存材料,研磨,离心，10000g,40min,上清，100000g,40-60min,沉淀（微粒体）,悬浮，二相法,离心，100000g,40-60min,沉淀（纯化的细胞膜组分）,检测：标志酶或磷钨酸染色法,猪脑微管蛋白的提取,取4-6个猪脑，用冷重蒸水冲洗，置于预冷的大培养皿中，除去表层脑膜、脑血管和多余的脂肪。2.将处理的猪脑转移至烧杯中，加入适量预冷的提取缓冲液，（100mmol/L MES-NaOH,pH6.9，2mmol/L EGTA，1mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT），使其体积400ml 左右，倒入组织匀浆机中匀浆6次，每次10秒。3.将匀浆液于高速离心机上离心，22000rpm，4，30min.上清液用四层纱布过滤，量滤液体积，加入等体积的聚合缓冲液（100mmol）同时加入ATP母液，使其终浓度为1mmol/L,加入GTP母液，使其终浓度为0.015mmol/L。于37 水浴中1小时使微管蛋白聚合。,5.完全聚合后的溶液于100,000g,30 离心1小时。6.去除上清液，加入适量的预冷提取缓冲液，加入GTP使其终浓度为0.1mmol/L，并轻轻敲开沉淀，使其在冰上解聚4060min。7.解聚后的微管蛋白溶液在100,000g，4 下离心20min.8.用量筒量上清液体积，加入等体积的聚合缓冲液于上清，加入GTP使其终浓度为1mol/L，37 水浴中聚合4060min.9.完成聚合后的溶液于100,000g，37 下离心1小时。弃上清，储存沉淀于70。,白色杜鹃花,