新型凝血因子Xa抑制剂的设计、合成与活性研究开题报告.doc

南华大学本科生毕业设计（论文）开题报告设计（论文）题目新型凝血因子Xa抑制剂的设计、合成与活性研究设计（论文）题目来源纵向课题设计（论文）题目类型研究类起止时间一、 设计（论文）依据及研究意义：心脑血管疾病（cardiovascular disease, CVDs）是由于心脏或血管病变导致的循环系统疾病的统称。心脑血管疾病是大多数国家的首要死亡病因，其中全球约半数的心脑血管疾病死亡病例发生在亚洲国家和地区1。根据世界卫生组织报告，2011年全世界约730万人死于缺血性心脏病，620万人死于脑中风，两者共构成了大约21.8%的死亡人口，在所有死亡因素中居于前两位（图1-1）。在中国每年有约300万人死于心脑血管疾病，占所有死亡总数的41%左右。心脑血管疾病严重地威胁着人类的生命健康，并给社会和家庭带来了沉重的经济负担，研究有效防治心脑血管疾病的药物已成为我国药物研发的当务之急。在缺血性心脏病和缺血性脑中风的发病机制中，血栓的形成起到非常关键的作用2，凝血系统则在血栓的形成过程中扮演了重要角色。当凝血系统被触发后，经过一段滞后时间后血液中产生大量凝血酶3，凝血酶使血液中可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，从而产生血块，血块脱落时造成血栓。目前为止，临床上用于防治血栓的药物主要包括两类抗凝血剂：（1）通过增强血浆抗凝血酶活性，而间接发挥抗凝作用的注射剂（如：未分级肝素，低分子量肝素LMWHs和磺达肝癸钠）；（2）维生素K拮抗剂（如：华法林）。这两类抗凝血剂均靶向于凝血系统中的多个受体，即作用于多种不同的凝血因子。这些药物广泛应用于临床，大大降低了血栓栓塞形成的概率，然而它们也有一定的局限性4：（1）肝素类药物，如低分子量肝素和磺达肝癸钠只能肠胃外给药5, 6，使得它们不便于长期使用；（2）低分子量肝素，其“抗凝血酶依赖”的作用模式使其不能灭活与纤维蛋白结合的凝血酶、或者与与血栓结合的FXa；（3）另外，低分子量肝素还会引起血小板减少，而长期治疗则会导致骨质疏松症；（4）而维生素K拮抗剂如华法林虽然一直是长期抗凝治疗的主打药物，然而这些药物具有起效慢、治疗窗窄以及与多种药物、食物相互作用的缺点7-9。凝血过程中参与的凝血因子有I，II，III，IV，V，X等，其中凝血因子Xa（factor Xa，FXa，活化的凝血因子X）和凝血酶（即活化的凝血因子II）是两个近年来研究较多的靶点。FXa是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，它位于外在凝血途径和内在凝血途径的交界处。在两条凝血途径的末尾交汇处，被激活的FXa与其辅助因子凝血因子Va（FVa）和磷脂表面的钙离子结合后，形成FXa-FVa复合物，该复合物可以将凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶则进一步激活血小板，并同时将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而最终导致血栓的形成。因此，FXa是一个非常重要的且明确的新型抗凝血剂的作用靶标10。文献表明，1分子FXa可以产生大于 1000个凝血酶分子11，因此抑制FXa可以有效阻断凝血酶的合成；对FXa的抑制不会影响血液中已经存在的凝血酶的正常凝血功能；此外，小分子的FXa抑制剂能够进入血栓，从而可以同时抑制循环中FXa的以及与血栓结合的FXa12。在一个封闭的胰蛋白酶样的-折叠桶中，FXa含有一段具有254个氨基酸的丝氨酸蛋白区域，这段区域包含着Ser195-His57-Asp102三联体催化位点和两个基本子位点，即S1特异性位点（口袋）和S4 芳基结合位点（口袋）。S1口袋是一个由疏水性的结构所包围的较小腔袋，其中底物与S1口袋的结合包括与口袋底部的Asp189形成一个盐桥13, 14。而S4口袋是由Tyr99，Phe174和Trp215残基形成的一个较大的疏水性腔袋15-17。寻找具有合适骨架且能够与S1口袋和S4口袋形成最有利相互作用的小分子配体，成为基于结构设计选择性FXa抑制剂的一大重点18。目前已经有三种凝血因子Xa抑制剂：利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班分别在美国、欧盟和日本上市，应用于抗血栓治疗。利伐沙班等药物具有显著的防治静脉血栓形成的药理作用，降低了急性冠状动脉综合征患者发生心脑血管事件的风险。然而，这些药物在应用中亦被发现有一些副作用，如可导致出血并发症等。因此，研究开发高效、低毒的凝血因子Xa抑制剂依然是当前抗凝血药物研发的热点。新型FXa抑制剂的研究与开发，对于缺血型心脑血管疾病的治疗有重大意义。FXa抑制剂能够显著降低心脑血管事件风险，保障人们的生命健康，减轻家庭和社会的经济负担，具有广阔的应用前景和良好的社会效益。目前对FXa抑制剂的开发与研究，主要以国外的大型药企为主，包括德国拜耳，日本第一制药，美国Squibb等公司，并已有三种FXa抑制剂上市。国内对此领域的研究起步较晚。二、 设计（论文）主要研究的内容、预期目标：（技术方案、路线）研究目标：本项目申请人在前期研究中，根据FXa的化学生物学信息和经典的生物电子等排（Bioisosterism）药物设计原理，替换先导化合物的P4区（与FXa的S4口袋结合的区域）和linker区，并采用多种多样的P1区（与FXa的S1口袋结合的区域），设计合成了双酰基哌嗪FXa抑制剂和氨基苄胺FXa抑制剂，并经抗凝血活性试验和FXa抑制活性试验发现了一些具有较高活性的先导化合物。其中化合物H17的抗凝血活性活性和FXa抑制活性活性分别为（PTCT2 = 1.0 M, IC50 = 1.9 M)，均优于阳性对照药利伐沙班（PTCT2 = 1.3 M, IC50 = 3.3 M）。本项目的研究目标是基于FXa抑制剂药物设计策略，以上市药物利伐沙班和已发现的H17为先导化合物，对先导化合物的P4区、linker进行结构改造，通过变换P4区的体积、疏水性等，以增强P4区与FXa的S4口袋的结合能力；以及增强linker区与FXa的氨基酸的氢键形成能力，设计了一系列新型氨基苄胺类FXa抑制剂。该研究经抗凝血活性试验筛选与FXa抑制活性试验，以及初步的成药性评价，旨在发现新一代高效、低毒的FXa抑制剂候选药物，为进一步开发奠定基础。研究内容：（1） 目标化合物的设计根据先导化合物与FXa的结合模式和生物电子等排原理，将先导化合物的P4区以体积更大、疏水性更强的吗啉联吡啶基团或戊内酰胺联苯基团替代，使得该区域能更好地契合入FXa的S4口袋，并与周围的疏水性氨基酸形成-堆积作用；linker区保留氨基苄胺，以砜基连接氨基苄胺和P1区，砜基作为比羰基更强的电子供体，可以与FXa的氨基酸形成更强的氢键，甚至是双重氢键。由此来构建FXa抑制剂。（2） 虚拟筛选与药代动力学和毒性（ADMET）预测运用Sybyl-X中Surflex模块进行目标化合物的活性预测；运用DS毒性预测软件TOPKAT建立模型，对设计的目标化合物进行毒理学性质预测；运用Sybyl-X中VOLSURF模块对化合物的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）性质进行预测。（3） 目标化合物的合成对通过虚拟筛选得出的目标化合物进行定向化学合成；经过核磁共振氢谱（1H）、核磁共振碳谱（13C）、元素分析和红外光谱（IR）、质谱（MS）等仪器分析确证其化学结构，并通过HPLC等测定化合物纯度。（4） 体外抗凝血活性和FXa抑制活性实验以利伐沙班作为阳性对照药物，对所设计合成的化合物进行体外抗凝血活性测试和FXa抑制活性试验。（5） 初步成药性评价根据体外活性试验结果，选择活性高的先导化合物进行动物体内药效学、药代动力学（体外稳定性、生物利用度、半衰期等）和安全性评价（急性毒性）等初步成药性研究。技术路线：（1）系列A合成路线:Scheme 1. Reagents and conditions: i) K2CO3, DMF, 100 °C, 6 h, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.Scheme 2. (iii) (Boc)2O, N2 protection, DCM, ice bath for 20 min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.（2）系列B合成路线Scheme 3. Reagents and conditions: i) a. K2CO3, CuI, DMSO, 1,10-Phenanthroline, 120-125 °C, 12-24 h, b. NaOH, H2O, MeOH, (ii) SOCl2, reflux, 2 h.Scheme 4. (iii) (Boc)2O, N2 protection, DCM, ice bath for 20 min, for overnight, (iv) K2CO3, DCM, r.t., 20 min, (v) TFA, DCM, r.t., 5 h, (vi) ArSO2Cl, Et3N, THF, r.t., 20 min.三、设计（论文）的研究重点及难点：（1） 化合物结构的合理设计 根据FXa的化学生物学信息，以及生物电子等排体原理，对先导化合物的P4区、linker区和P1区进行结构改造，以改善药理活性，构建对FXa选择性高、毒性低的新型FXa抑制剂。（2） 发现高效、低毒的新型FXa抑制剂类抗凝血候选药物通过体外抗凝血活性试验、FXa抑制活性试验，发现新型FXa抑制剂先导化合物；并进一步动物体内初步成药性评价，以发现新型抗凝血候选药物。四、 设计（论文）研究方法及步骤（进度安排）：研究方法：根据先导化合物与FXa的结合模式和生物电子等排原理，将先导化合物的P4区以体积更大、疏水性更强的吗啉联吡啶基团或戊内酰胺联苯基团替代，使得该区域能更好地契合入FXa的S4口袋，并与周围的疏水性氨基酸形成-堆积作用；linker区保留氨基苄胺，以砜基连接氨基苄胺和P1区，砜基作为比羰基更强的电子供体，可以与FXa的氨基酸形成更强的氢键，甚至是双重氢键；P1区采用多种不同的小体积芳香性基团。由此，我们构建了A、B两个系列FXa抑制剂。运用Sybyl-X中Surflex模块对构建的虚拟化合物库A、B进行虚拟活性评价；运用DS毒性预测软件TOPKAT模块建立模型，对设计的目标化合物的毒理学性质进行预测，同时运用Sybyl-X中VOLSURF模块对化合物的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）性质进行预测。最后根据化合物的药理活性、毒理学性质和ADME性质的预测结果，确定欲合成的目标化合物。实验方案：（1）目标化合物的抗凝血活性实验：目标化合物的抗凝血活性由化合物对血浆凝血酶原时间的影响来评价。根据不同化合物浓度对贫血小板血浆凝血时间的延长时间不同，得到化合物的抗凝血活性。检测原理：贫血小板血浆加入钙离子等凝血诱导剂后，开始凝血过程。由于一部分纤维蛋白凝聚，血浆的浊度便下降，在检测仪器上就表现为血浆的透光度上升。目标化合物如果能够很好地抑制血浆中的FXa的活性，则可延缓凝血过程，使凝血酶原时间延长，血浆的透光率上升速度变缓。方法：按常规方法制备PPP，在EP管中加入PPP 血浆和待测药物溶液，孵育一段时间后置于凝血酶原时间测定仪下记录凝血酶原时间。1）贫血小板血浆(platelet-poor-plasma, PPP)的制备家兔心脏取血，将配制好的枸椽酸钠抗凝剂以V血/V枸橼酸钠 = 9:1加入全血中，充分混匀后自然沉降30 min。之后将血液在离心机中以3000 r/min的转速离心10 min，得到PPP。（室温放置时不超过2 h，若28 保存应不超过4 h）。用塑料试管存放血浆，并用塑料吸管移取标本。实验前应检查血浆是否有溶血，黄疸，脂血或出现凝块。2）药品溶液的配制称取10 mol化合物，加入1 mL DMSO，震荡，使其溶解并混匀，得到104 mol/L的母液。加药组：取400 L贫血小板血浆（PPP），加入100 L不同浓度的化合物溶液（以PPP稀释化合物母液得到），使得到的血浆中化合物的终浓度为50 M，25 M，12.5 M， 6.25 M，3.125 M五个梯度。空白对照组：取500 L贫血小板血浆（PPP），不加化合物溶液。 3）凝血酶原时间的测定加药组和空白对照组于37 下温育1 min，测定凝血酶原时间。通过对浓度-响应曲线的回归分析可以估算出能使凝血时间延长一倍（CT2）的化合物的浓度（PTCT2）。4）统计学处理通过测定凝血酶原时间，对浓度-响应曲线进行统计学的处理，可以估算出能使凝血时间延长一倍的化合物的浓度。（2）目标化合物的FXa抑制活性试验：1）检测原理及方法：FXa可以使发色底物S-2222分解为多肽和对硝基苯胺，后者在405 nm处有吸收高峰。加入FXa抑制剂后，对硝基苯胺的产生受到抑制，吸光度降低。用酶标仪测定405 nm 处的OD值，由此可推算出FXa抑制剂对FXa的抑制活性。2）试验步骤配制BSA buffer（牛血清白蛋白缓冲液）：取0.01 mol（1.21 g）三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，0.02 mol（1.16 g）氯化钠，0.20 g 牛血清白蛋白，加100 mL三蒸水，摇匀，得到0.1 M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐- 0.2 M 氯化钠- 0.2% 牛血清白蛋白缓冲液 (pH = 7.4)，待用。药品溶液的配制：取10 mol化合物，加入100 L DMSO，震荡，使溶解并混匀，得到105 mol/L的化合物母液。按递倍稀释法定量稀释至规定浓度，最终浓度分别为1000 M，200 M，40 M，8 M，1.6 M，待用。FXa抑制活性的测定：于96孔板中，每孔加入10 L上述已配好的不同浓度的药液（空白组中加5% DMSO 10 L），和10 L的0.0625 U/mL的human FXa，以40 L的BSA缓冲液（pH 7.4）混合均匀。37下孵育15 min。之后加入0.75 M 发色底物S-2222（40 L），震荡10s后，于室温下孵育3 h。酶标仪下测定各孔在405 nm的吸光度。3）统计学处理：FXa抑制活性 = 1-(OD/min)sample/(OD/min)control。IC50值由FXa抑制活性和化合物的浓度曲线得出。（3）初步成药性评价：体内FXa抑制活性和抗凝血活性：雄性Wistar大鼠禁食过夜。将化合物溶于0.5% 甲基纤维素溶液，通过灌胃给药。控制组大鼠则只口服给予0.5% 甲基纤维素溶液。取血时，将大鼠以氟烷麻醉之后取血，取出的血加柠檬酸钠抗凝。将血样离心，取贫血小板血浆用来测定FXa抑制剂的FXa抑制活性和抗凝血活性。1）FXa抑制活性：血浆 (5 µL) 与0.1 M Tris-0.2 M NaCl-0.2% BSA buffer (pH 7.4; 40 µL)、H2O (5 µL), 和 0.1 U/ml human FXa (10 µL) 混合。加入0.75 M S-2222 (40 µL)之后，FXa对S-2222的酶解反应开始。混合液在室温下搅拌10 S之后，于405 nm下测定光密度的增加值(OD/min)。FXa抑制活性（inhibition %）由以下公式计算出：anti-Xa activity ) = 1 - (OD/min) of sample/(OD/min) of control。 2）抗凝血活性：在封尾管中，将血浆 (20 µL) 与溶于生理盐水的FXa抑制剂 (20 µL) 混合。将混合血浆中加入促凝血酶原 (40 µL)，开始凝血过程。抗凝血活性值由凝血酶原时间的延长来计算得到。（4）初步的药代动力学评价: 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888881）体外化学稳定性初步实验：方法的专属性：选定合适的色谱条件，使得待测化合物和阳性对照药有较好的分离度，在此条件下所测得的结果能代表各个待测成分浓度。精密称取待测化合物，置于容量瓶中，分别用稀释剂磷酸二氢钾（pH 3.0/pH 7.0）超纯水溶液：乙腈溶解并稀释至刻度，于37水浴温孵，每隔一段时间（1小时、2小时、4小时、8小时、24小时）用RP-HPLC采用归一法对峰面积进行积分，测定溶液中待测化合物的浓度，设3组平行试验，同时测定阳性对照药利伐沙班。在酸性和中性条件下，同一时间检测的含量越多说明该化合物稳定性越好。2）在人工模拟胃肠液中稳定性初步实验：人工模拟胃液：9 mL浓HCl，加水约50 mL及胃蛋白酶1 g充分溶解后，调pH = 1.2，定容100 mL；人工模拟肠液：称取0.68g KH2PO4溶于50 mL水中，用0.4NaOH溶液，调pH = 6.8，另取1 g胰蛋白酶加水溶解，定容至100 mL；实验过程：称取待测化合物分别溶于3份平行的模拟胃液或肠液中，置37水浴温孵，于设定时间点0、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min抽取溶液100 L，用流动相稀释至1 mL，经孔径为0.45 L的微孔滤膜过滤后上样，采用归一法对峰面积进行积分。测定溶液中化合物的浓度，同时测定阳性对照药拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、恩曲他滨、阿德福韦酯。得到所测样品浓度百分比随时间的变化曲线，并计算出其水解半衰期。在大鼠体内药物动力学评价：每个待测化合物取SD雄性大鼠6只, 体质量200-300 g, 实验前置于代谢笼饲养24 h，次日称质量, 经乙醚轻度麻醉后, 作动脉插管手术, 待动物清醒后, 按5 mg/kg的剂量静脉注射给药. 在注射后1 min、5 min、30 min、60 min、120 min、180 min、300 min、480 min、720 min、960 min以及1440 min从动脉导管取血0.2 mL, 立即离心取血浆0.1 mL, 放置于-20 冷冻保存至分析测定。使用WinNonlin Professional Edition Version 2. 1药代动力学计算软件计算相关药代动力学参数：消除半衰期t1/2，清除率CL，分布体积Vd，曲线下面积AUC(0-)等。根据所得数据，绘制血药浓度-时间曲线（5）初步的安全性评价（急性毒性试验）：小鼠急性毒性试验：试验选用体重18-20g的ICR品系小鼠70只，雌雄各半，随机分7组，每组10只。将待测化合物临用前用生理盐水配成5个浓度梯度的溶液。每只小鼠按0.2mL/10g体重静脉注射给药一次（5个浓度梯度组、1个生理盐水组和1个阳性药物组）。给药后立即观察动物的反应，外观、四肢活动、摄食、排泄等症状并详细记录死亡只数，连续观察7天。实验结果采用Bliss法计算待测化合物和阳性药物的半数致死量LD50。五、 进行设计（论文）所需条件：支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及 理 由1. 合 计5科研业务费1.8化合物结构测试分析费，学术会议费，论文版面费，为较大开销实验材料费1.7所需化学试剂、溶剂等，为较大开销仪器设备费1.0专用仪器设备购置、运输、安装费和修理费，为较大开销实验室改装费0.0无协作费0.0无项目组织实施费0.5研究生劳务费六、 指导教师意见：签名： 年 月 日