5.DNA复制.ppt.ppt

复习,1.人类基因组草图公布的时间、地点、参与成员。2.HGP的研究内容（纲要）。3.中国参与HGP的研究成果。4.如何正确看待基因的“好”与“坏”。,1958年，Crick 在“论蛋白质合成”一文中，以其远见卓识提出了中心法则。Furthermore,Watson and Crick issued the“Central Dogma”to faithful,Which decreed that genetic information flows linearly from DNA to RNA to protein,and never in reverse.,Watson 和Crick提出DNA分子的双螺旋模型，合理揭示了DNA复制和转录过程。,导入新课,1953年，,DNA,Replication,RNA,Protein,Translation,Transcription,This is the original central dogma,it forms the backbone of molecule biology and is presented by several stages:Replication,transcription,processed(in eukaryotic cells,essentially by splicing)and translation.,processed,Central Dogma,Reverse transcription,RNA editing,RNA replication,5.DNA Replication(DNA Duplication),DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子，并通过DNA的复制由亲代传递给子代，遗传信息从DNA转录给RNA，然后再翻译成特异的蛋白质，以执行各种生物功能。,新课讲授,5.1 The general Characteristics of DNA replication5.2 Enzymes and relative proteins in DNA replication5.3 the DNA replication course in E.coli5.4 DNA Replication in Eukaryotes5.5 Replication Control,学习目标要求,掌握：（1）参与DNA复制的酶和蛋白质的种类及功能（2）DNA复制的忠实性（保真性）（3）大肠杆菌DNA复制的分子机制（4）真核生物和原核生物DNA复制的异同点熟悉：（1）DNA复制的一般特点（生物化学讲过）（2）真核生物染色体端粒复制的生物学意义了解：（1）真核生物DNA复制的分子机制（2）真核生物染色体端粒复制的过程,5.1 The general Characteristics of DNA Replication,回顾生物化学课程中相关的DNA复制的一般特点,5-1,DNA复制的半保留性DNA复制的半不连续性RNA引物（引发、引物酶）DNA复制的高度忠实性（？思考）（遗传的稳定性）复制起点(ori)、复制终点(Ter)、复制方向、复制方式,复制子 基因组内能独立复制的单位称为复制子或复制单位；每个复制子都含有控制复制起始的起点和控制复制终止的终止点。原核生物：单复制子（一个复制起点）真核生物：多复制子（多个复制起点）复制起点：1.大肠杆菌的复制起点：oriC。2.起始区序列十分保守；复制在起始阶段进行调控，一旦复制开始，就继续进行下去；,一般了解：几个概念,复制方向1.原核生物、真核生物细胞器DNA：双向复制2.真核生物染色体DNA：多起点复制3.病毒DNA多样性：环形、线形、双链或单链。,复制终点 在复制起始点的相对位置（旋转180）的位置。,OriC,Ter,复制方式滚动环式复制D环复制形复制,5.2 Enzymes and relative proteins in DNA replication,双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。实际上，在复制叉进行复杂的DNA复制过程中，还需要其他许多相关的酶和蛋白因子的参与，如DNA解旋酶、DNA旋转酶、DNA单链结合蛋白、引发酶、连接酶、去除RNA引物的酶等。,掌握,5.2.1 DNA polymerase(pol)and its function,DNA聚合酶(DNA polymerase)是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成新DNA链的一类酶。原核和真核生物中都包含有多种DNA聚合酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制的；有的时候这些酶叫做DNA复制酶。其它的一些扮演了复制过程中的辅助角色并且或者参与了替换被破坏的序列的DNA合成的修复工作。,研究最清楚的是大肠杆菌中的DNA聚合酶，已鉴定了5种不同的DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶、和。,5.2.1.1 DNA pol and its function,1970-1971年，Korn.berg和Gefter先后分离出了DNA聚合酶和。DNA聚合酶是由多个亚基组成的蛋白质，亚基很容易解离。全酶由10个亚基构成，含有Zn原子。,夹子装置器,1.DNA聚合酶全酶的亚基组成,(dimer,滑动夹子),(,和),(2,和,夹子装置器),亚基二聚体构成一个滑动的夹子，夹住DNA分子相对滑动，使聚合酶在完成复制前不脱离模板DNA而持续聚合。,DNA pol 复杂的亚基结构使它具有更高的保真性(fidelity)、协同性(cooperativity)和持续性(processivity)。,2.The catalysis reaction,5-2,以dNTP为底物，释放PPi获得能量Mg 2+反应受模板指导在链的3-OH端延伸延伸方向是5 3新DNA与模版链互补,DNA pol,只有根据碱基互补原则配对的dNTP才会加到3-OH末端，只有根据碱基互补原则配对的dNTP才会加到3-OH末端。,1955年，Kornberg 在E.Coli中发现DNA pol。分子质量为10.3万道尔顿，单一肽链组成，多肽链中含一个Zn。DNA pol 可被水解为一大一小两个片段。,1.结构大片段：68000U，又称Klenow片段；具有5 3聚合酶活性和3 5外切酶 活性（有校正功能）。小片段：35000U，具有5 3外切酶活性，切 除小片段DNA/RNA，如切除RNA引物。,5.2.1.2 DNA Pol and its function,Klenow片段的结构（右手形状）,Palm 掌形结构区,Fingers指形结构区,Thumb 拇指结构区,2.Klenow片段的校正功能,a.DNA合成速度减慢,Exonuclease active site,Mispaired last base pair,b.错配碱基的清除,c.恢复DNA合成,小结：如何实现DNA复制的忠实性？,DNA复制过程中碱基配对受到双重核对：DNA聚合酶(DNA pol)对碱基的选择作用3 5外切核酸酶(Klenow片段)的校正作用复制的修复系统（DNA损伤的修复）,重点掌握,5.2.2 DNA ligase,DNA聚合酶只能催化多核苷酸的延长反应，不能使链的两个末端间共价连接。1976年不同实验室同时发现了DNA连接酶。功能：催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-OH生成磷酸二酯键，反应需要能量。,缺口：失去一段单链称为缺口(gap)。切口：失去一个磷酸二酯键称为切口(nick)。,DNA连接酶的催化反应DNA ligase+NAD+/ATP 酶-AMP复合物+DNA AMP-DNA 相邻3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击 AMP 3,5-磷酸二酯键,5.2.3 Primase 引物合成酶,Primase又称为引发酶，E.Coli中基因dnaG的产物，是一种特殊的 RNA 聚合酶，以单链DNA为模板合成互补于DNA链的RNA引物，合成方向是5 3。不需要特异的DNA序列。引物的长度通常为几个核苷酸至10个核苷酸。功能：为DNA聚合酶提供游离的3-OH。,5.2.4 RNase,在DNA复制完成时，必须去除RNA引物。功能：去除RNA引物。RNase 去除RNA引物DNA聚合酶填补缺口DNA连接酶缝合切口,5.2.5 Topisomerase,天然环状DNA分子一般以负超螺旋构象存在，易于解链。DNA复制、重组、转录等过程都需将两条链解开，并且生物学过程需要各不相同的负超螺旋程度，可以通过DNA的拓扑结构来调节其功能。DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶来实现的。,Topoisomerase,共有两种类型：,TOP：使双链超螺旋DNA转变为松弛型环状DNA。,TOP I在复制叉前一段DNA断开一个磷酸二酯键，使DNA链断开，使得断开的DNA链可绕着另一条完整的DNA链自由转动，最后再由TOP I重新连上磷酸二酯键。影响转录活性。,TOP：使松弛型环状DNA转变为负超螺旋DNA，又称促旋酶。,TOP II同时断开DNA的双链，形成暂时的断裂，然后再与一个双链DNA结合封上断口,在复制叉处消除由于DNA解螺旋而产生的超螺旋。与复制有关。,大肠杆菌中的DNA旋转酶(gyrase)又称拓扑异构酶(Topisomerase)，由四个亚基组成四聚体22，而真核生物的呈二聚体。,应用：TOP和TOP 拓扑异构酶是人类抗癌药物和抗菌药物的靶酶；gyrgyr是抗生素作用的位点。,5.2.6 Helicase&SSB,由拓扑异构酶引入的负超螺旋，削弱了复制叉前进产生的扭曲张力，协助DNA 解旋酶(DNA helicase)促进解链，单链结合蛋白(single-strand DNA binding proteins,SSB)结合产生的单链DNA(single strand DNA,ssDNA)上防止出现单链的链间或链内局部退火，保证产生的单链DNA处于稳定状态。,DNA 解旋酶(DNA helicase)的作用,SSB结合ssDNA,原核细胞中SSB同ssDNA的结合是一种协同结合，无序列专一性，是一种静电作用。大肠杆菌的SSB蛋白由4个相同的亚基组成。,5.2.7 DNA semidiscontinous replication,ligase,复习,1.如何实现DNA复制的忠实性？2.参与DNA复制的酶和蛋白质有哪些？,5.3 the DNA replication course in E.Coli,DNA合成的生长点即复制叉上分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，他们构成的复合物称为复制体(replisome)。DNA复制的过程表现在其复制体结构的变化上。大肠杆菌染色体DNA的复制过程分为三个阶段：起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。,5.3.1 Initiation of DNA replication,所有的DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制起点开始。DNA复制起点是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列，又称复制原点(origin)。E.coli的Origin的结构特点：三个富含A-T的13bp序列和四个9bp重复序列（DnaA蛋白结合位点）。,HUATP+DnaA,Hu makes DNA bend,DnaB(helicase),DnaC(helicase loader),13 bp 9bp,复制起始分子机制（六个步骤）,DnaA(ATP)Hu识别、结合9bp重复序列；Hu使DNA双链弯曲；DnaB/DnaC蛋白复合体结合解链区；SSB结合单链DNA；DnaB打开DNA双螺旋；,重点、难点,DNA primase/DnaG,DNA pol,复制起始复合体：OriC处的复制起始从一个需要起码6种蛋白质（DnaA，DnaB，DnaC，HU，DnaG，SSB等）的复合物的形成开始。,DnaG合成RNA引物；DNA pol结合DNA。,DnaB和DnaC蛋白形成一个复合物，其中6个DnaC单体与每一个DnaB六聚体结合。这形成了一个480KD 的蛋白复合体，相当于一个半径6nm的球。在oriC 处形成的复合物以一个可见的大蛋白颗粒形式被发现.,利用电镜可探测到复制原点C处的蛋白复合体。两个可见的复合体都是采用DnaB 蛋白抗体标记显示的。,大肠杆菌ori与复制起始有关的酶与辅助因子,5.3.2 Elongation of DNA replication,复制的延伸阶段同时进行着前导链和滞后链的合成。前者持续合成，后者分段合成。,(dimer,滑动夹子),(,和),(2,和,夹子装置器),全酶的两个不对称亚基的核心酶分别催化前导链和和滞后链的合成。,过程：1.前导链的合成比较简单，按照碱基互补配对的原则，在3-OH端加上新的dNTP，合成子链。,2.滞后链的合成分4个步骤滞后链形成回环，聚合酶异二聚体中的一个亚基单位和引物合成酶与滞后链结合。,5 3方向合成引物,在RNA引物3-OH端合成子链冈崎片段合成，聚合酶的行进受阻，聚合酶和引物合成酶寻找新的结合位点。,特点1：协调滞后链和前导链的合成,前导链和滞后链上的DNA聚合酶在同一位点起始,滞后链,前导链,DNA聚合酶以相反方向移动并在冈崎片段合成后分开,滞后链上的DNA聚合酶相对于DNA有一个位移,核心聚合酶和夹板在冈崎片段合成结束时脱落，并且在起始点重新结合。当一个Pol全酶遇到一个DNA切口时，核心复合物和夹板会从滑动夹板上脱落。核心可以在别的地方和一个新的子基重新结合。,特点2：夹板循环利用,5.3.3 Termination of DNA replication,细菌环状染色体的两个复制叉不断向前推移，最后在终止区相遇并停止，该区含有多个约22bp的终止子(terminus,terminator)位点。,两个复制叉在终止区相遇后停止复制，复制体解体，两个环状染色体互相缠绕，成为连锁体。此连锁体在细胞分裂前必须解开，否则将导致细胞不能分裂而死亡。,连锁体,终止解链,旋转合成,解连锁拓扑异构酶,变性,修复合成,连锁体,重点,TOP(型拓扑异构酶),5.4 DNA Replication in Eukaryotes,真核生物DNA复制研究较为详细的主要有猿猴病毒(SV40)、酵母细胞和非洲爪蟾的卵提取物。,5.4.1 the Characteristic,真核生物的DNA缠绕在组蛋白核心上，形成核小体真核生物染色体有多个复制点5-氟脱氧尿苷是真核细胞DNA复制的强抑制剂 复制速度较原核生物慢,真核生物复制起始点称为自主复制序列（ARS），或复制基因（replicator）有一个蛋白复合体可结合其上，称为起点识别复合物（ORC/initiator），激活复制的起始。,5.4.2 DNA pol,真核生物有多种DNA聚合酶。在哺乳动物中分离了5种：分别以、来命名。各个聚合酶的作用及性质见书92页表4-4。,5.4.3 Telomere replication,端粒(telomere)真核生物染色体两端具有的特殊结构。真核生物线性染色体在复制后，不能像原核生物那样填补5端的空缺，从而会使5端序列变短，而端粒酶(telomerase)可以外加重复单位到5端上，维持端粒一定长度。端粒酶是RNA与蛋白组成的一种核糖核蛋白(RNP)复合体，是一种反转录酶，以其所含有的RNA为模板合成DNA端粒的结构。它所含的RNA约长150bp，并约含1-5拷贝的CyAx重复序列，是合成端粒TyGx的模板。,5-3,难点,端粒复制的过程,5.5 Replication Control,DNA的复制是受调控的。复制的调控发生在起始阶段，从复制原点起始一轮DNA复制，特异蛋白质因子对原点的识别和结合是关键的一步。生物体中所有的细胞都是将基因组复制与细胞周期相互协调，一个细胞周期中DNA复制一次，以阻止DNA的丢失或过剩。,一般了解,5.5.1 Replication control in E.coli,Replicon（复制子）基因组中一个能被独立复制的DNA片段单位，其中含有复制起驶点。在细菌和质粒DNA中只含有一个复制子。复制子的复制方式取决于发生在起始阶段的内部作用的实质，普遍原则是复制在起始阶段被控制，一旦复制开始，它就会持续下去直到整个基因组被复制，起始率是由调节蛋白与结合位点的内部作用来控制的。,5.5.1.1 E.coli chromosome Replication control,染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但不直接相偶联；大肠杆菌的复制起点由oriC和oriH两种；DNA复制的调节主要发生在起始阶段，一旦开始副职，如无意外受阻，就一直复制到完成；完成复制后，新合成链则未甲基化，属半甲基化DNA。,自学5.5.1.2 ColE1 plasmid Replication control 5.5.1.3 ssDNA phage Replication control,5.5.2 Replication Control in Eukaryotes,5.5.2.1 Control the replication time 真核生物DNA复制的调节比原核生物更为复杂。真核生物细胞有多条染色体，每一条染色体上有多个复制起点，是多复制子的复制。复制由时间控制，并非所有起点都在同一时间被激活，而是有先后。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。真核生物没有复制终止子。,真核细胞DNA复制有三个水平的调控：细胞生活周期水平的调控决定细胞停留在G1期还是进入S期。染色体水平复制调控决定复制子按一定顺序在S期起始复制。复制子水平调控决定复制起始与否。,自学5.5.2.1 SV40 Replication Control5.5.2.2 Yeast chromosome Replication Control,Summary,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式贮存在DNA分子，并通过DNA的复制由亲代传递给子代，遗传信息从DNA转录给RNA，然后再翻译成特异的蛋白质，以执行各种生物功能。DNA复制的半保留性、DNA复制的半不连续性、复制起点、RNA引物、DNA复制的高度忠实性。双螺旋DNA的复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。实际上，在复制叉进行复杂的DNA复制过程中，还需要其他许多相关的酶和蛋白因子的参与，如DNA解旋酶、DNA旋转酶、DNA单链结合蛋白、引发酶、连接酶、去除RNA引物的酶等。DNA聚合酶(DNA polymerase)是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成新DNA链的一类酶。研究最清楚的是大肠杆菌中的DNA聚合酶，已鉴定了5种不同的DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶、和。所有的原核和真核生物的聚合酶都具有同样的合成行为的基本类型。每一个都可以通过在3-OH端一次加入一个核苷延伸DNA链，加入链中的核苷是通过和模版DNA的碱基配对来选择的。DNA合成的生长点即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，他们构成的复合物称为复合体(replisome)。DNA复制的过程表现在其复制体结构的变化上。大肠杆菌染色体DNA的复制过程分为三个阶段：起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。真核生物DNA复制研究较为详细的主要由猿猴病毒(SV40)、酵母细胞和非洲爪蟾的卵提取物。,homework,简述DNA复制的特点。DNA复制的忠实性是怎样实现的？原核生物的SSB蛋白与DNA的结合表现出怎样的协同效应？简述大肠杆菌中主要的三种DNA聚合酶的名称及功能。简述DNA pol 的结构特征。简述端粒酶的作用机制。简述大肠杆菌DNA的复制过程（从起始、延长和终止三个阶段说明，注释相关酶及蛋白因子）。简述真核生物DNA复制调控的三个水平。,