湖北省动物疫病诊断培训201.1123.ppt
2013.11.23,湖北省动物疫病培训,1,猪用生物制品及其应用,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,2,2,兽用生物制品的概念,采用天然的或人工改造的微生物、寄生虫、生物毒素或生物组织及代谢产物为原料，通过加入赋形剂、保护剂或佐剂，经过乳化或冻干过程，制成的生物活性物品，用于预防、诊断和治疗畜禽等动物疾病。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,3,3,猪用生物制品的种类,一、猪用疫苗二、诊断试剂三、卵黄抗体四、微生态制剂五、干 扰 素六、抗 菌 肽,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,4,4,一、猪用疫苗,（一）疫苗种类和生产（二）疫苗检验和评价（三）疫苗使用注意事项,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,5,5,（一）疫苗种类,根据抗原性质来分类：1、灭活疫苗2、弱毒活疫苗3、基因工程疫苗4、亚单位疫苗5、核酸疫苗6、转基因可饲疫苗,根据功效来分类：预防性疫苗 治疗性疫苗,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,6,疫苗不同功效,预防作用：免疫程序的制定：依靠免疫抗体检测 病毒病：依靠疫苗，因为抗生素无预防作用；肉品动物中，不能使用抗病毒化药 细菌病：在耐药性严重的情况下，唯一的选择治疗作用：激发先天性免疫，发挥非特异性预防作用。只有少数疫苗，如伪狂犬病基因工程疫苗（HB98株）。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,7,7,1、灭活疫苗,将分离培养的病原微生物（多数为强毒株）用适当的化学试剂将其灭活，分别与矿物油、氢氧化铝等佐剂乳化或混合后，制成的疫苗。灭活疫苗的应用 1.1 研制灭活疫苗的背景 1.2 疫苗毒株和灭活剂的选择 1.3 常用佐剂 1.4 工厂化制备方法,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,8,8,1.1 灭活疫苗的研制背景,新分离的病原，短期内难以致弱。如早期的高致病性蓝耳病灭活疫苗。血清型较多的病原，疫苗的保护力呈现血清型特异性，如猪胸膜肺炎放线杆菌（15个血清型）等；变异频率高的病原，如新分离的口蹄疫缅甸98毒株和人（禽）流感病毒。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,9,甲醛：是我国目前大多数疫苗生产中使用的灭活剂。使蛋白质发生变性。缺点是引起局部炎症。烷化剂：常用的有2种，即BEI（二乙烯亚胺）和AEI（N-乙酰乙基亚胺），这两种灭活剂在破坏病毒核酸时病毒免疫性抗原仍保留。-丙内脂（BPL）：破坏核酸，不影响抗原；灭活时间短暂。,1.2 灭活剂,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,10,1.3 常用佐剂,油乳剂灭活疫苗：均匀一致的乳白色，不分层。多用于病毒疫苗。氢氧化铝佐剂：静置后，出现分层。用于细菌疫苗。蜂胶佐剂：细菌苗和亚单位疫苗分子佐剂：白介素，霍乱毒素（CTB）。在核酸疫苗研制中，使用较多。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,11,1.4 工厂化制备抗原的方法,细菌性疫苗 除实验室制备少量疫苗外，均选择合适的细菌液体培养基发酵，如胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌灭活疫苗等病毒性疫苗(1)细胞培养：静止培养和转瓶培养、悬浮培养新技术。(2)动物接种：猪瘟脾淋苗。由于动物个体差异，容易导致疫苗质量不稳定。应该淘汰的生产技术工艺。,病毒的静止和转瓶培养,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,12,悬浮培养与转瓶培养的产品质量与经济效益对比（猪圆环病毒疫苗）,（鸣谢：武汉科前动物生物制品公司提供）,2013.11.23,13,湖北省动物疫病培训,悬浮培养圆环病毒生产线,提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量获得提高；生产疫苗所用劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。,2013.11.23,14,湖北省动物疫病培训,（鸣谢：武汉科前动物生物制品公司提供）,悬浮培养猪细小病毒的经济效益对比,（鸣谢：武汉科前动物生物制品公司提供）,2013.11.23,15,湖北省动物疫病培训,悬浮培养细小病毒生产线,单位体积内有效工作细胞数量加；全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了细胞污染的机会，而且降低劳动力强度，减少人为操作因素影响；,2013.11.23,16,湖北省动物疫病培训,（鸣谢：武汉科前动物生物制品公司提供）,细胞苗线：全套进口3条细胞大规模悬浮培养生产线,目前全国最大、设计最新、最先进的悬浮培养生产线，并被推荐为GMP标准生产线,鸣谢：成都天邦公司,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,18,18,2、弱毒活疫苗,概念：将毒力下降或完全丧失的微生物与牛奶、明胶等佐剂混合后经过低温冻干后形成的疏松状制剂。疫苗研制与应用：2.1 疫苗毒株的获得 2.2 活疫苗的保护剂 2.3 活疫苗的制备 2.4 活疫苗的优缺点,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,19,19,2.1 疫苗毒株的获得,自然界中分离 猪细小病毒弱毒疫苗-自然弱毒 猪蓝耳病疫苗R98毒株化学诱变-仔猪副伤寒疫苗：强度在含有醋酸铊的普通肉汤中传代培养,人工传代方法致弱,伪狂犬病毒Bartha弱毒株：将分离的强毒株在鸡胚中连续传代800次而获得；猪瘟疫苗弱毒株：将分离的猪瘟强毒石门株经过家兔连续传代而获得。猪肺炎支原体兔化弱毒株：强毒在家兔中连续传代而得。高致病性蓝耳病活疫苗：基因缺失疫苗？,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,20,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,21,21,2.2 活疫苗的制备,疫苗抗原的制备 同灭活疫苗，无需灭活，但要求无杂菌冻干工艺 确保冻干前后细菌或病毒数量变化不大 冻干保护剂的使用 优化冻干曲线,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,22,22,2.3 活疫苗的保护剂,传统的保护剂（赋形剂）：牛奶、明胶、蔗糖。单独或混合使用。耐热保护剂：使疫苗能在普通环境（冷藏）中保存和运输。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,23,23,2.4 活疫苗的优点,免疫途径多样 肌肉注射、滴鼻、口服等途径。使用方便，利于群体免疫。刺激产生局部免疫 除肌肉注射外，后几种途径免疫可刺激机体产生局部分泌性IgA，形成黏膜免疫。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,24,24,2.4 活疫苗的缺点,受母源抗体的影响：如猪瘟活疫苗，猪伪狂犬病活疫苗受抗菌药物的影响：仔猪副伤寒疫苗保存条件严格：冷冻条件,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,25,25,3、基因工程疫苗,概念：利用分子生物学手段改造病原微生物的基因组，获得毒力下降或表达外源基因的突变株，并利用该突变株制成的疫苗。基因工程苗研制与应用 3.1 基因缺失疫苗 3.2 基因工程活载体疫苗,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,26,26,3.1 基因缺失疫苗,概念：利用分子生物学方法缺失或失活病原的毒力相关基因，获得毒力下降但保持免疫原性的突变株，用此突变株制备的疫苗。（包含灭活疫苗和活疫苗）实例：伪狂犬病基因缺失疫苗 猪传染性胸膜肺炎基因缺失疫苗,伪狂犬病病毒基因组结构 II PRV Genome Structure IITh.C.Mettenleiter,伪狂犬病病毒的主要毒力相关基因RR：核苷酸还原酶；TK：胸苷激酶；gE基因 PK：蛋白激酶；AN：碱性核酸酶；Ura：尿嘧啶糖苷化酶,2013.11.23,27,湖北省动物疫病培训,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,28,3.1 基因缺失疫苗-伪狂犬病疫苗,PRV-Ea 株TK-/gE-/gp63-的构建,技术路线,猪胸膜肺炎放线杆菌的毒素基因结构,2013.11.23,29,湖北省动物疫病培训,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,30,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单基因缺失株的构建,3.1 基因缺失疫苗-猪传染性胸膜肺炎疫苗,技术路线,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,31,31,3.2 基因工程活载体疫苗,利用自然弱毒或人工致弱的病毒或细菌作为载体，表达其它病原的免疫原性蛋白，以此突变株制备的疫苗。载体的主要特性是：致病力下降或缺失，基因组庞大，可容纳外源基因并大量表达。常用的活载体有：伪狂犬病毒弱毒株，腺病毒，致弱的沙门氏菌，乳酸杆菌、胸膜肺炎放线杆菌弱毒株。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,32,猪霍乱沙门氏菌crpasd C500平衡致死系统构建原理图,技术路线,3.2 基因工程活载体疫苗,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,33,crp-缺失株生长变慢,3.2 基因工程活载体疫苗,菌株asdC500、亲本菌株C500和crpasdC500的生长曲线,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,34,3.2 基因工程活载体疫苗,asdC500对猪的安全性试验结果,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,35,p46 蛋白是猪肺炎支原体的种特异性表面抗原；P65 蛋白是猪肺炎支原体的重要免疫原,P46、P65 western blot 验证,重组菌的生长曲线,3.2 基因工程活载体疫苗-表达肺炎支原体免疫蛋白重组沙门氏菌,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,36,3.2 基因工程活载体疫苗,动物试验设计,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,37,3.2 基因工程活载体疫苗,各组猪肺炎支原体抗体动态变化,各组干扰素动态变化,各组白细胞介素-4 动态变化,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,38,3.2 基因工程活载体疫苗,肺 MP Ab、IFN-和 IL-4 的检测结果,脾淋巴细胞 IFN-和 IL-4 检测结果,基因工程疫苗活疫苗载体种类,2013.11.23,39,湖北省动物疫病培训,基因工程疫苗的管理,按照农业转基因生物安全管理办法实施，申报不同的安全性评价阶段 实验室研究 中间试验 环境释放 安全生产临床试验申报新兽药注册证书,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,40,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,41,基因工程疫苗使用现状,目前，我国已经批准上市的基因工程疫苗：猪伪狂犬病基因缺失疫苗口蹄疫基因工程疫苗猪大肠杆菌K88-K99基因工程疫苗猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗（申报中）重组载体疫苗（乳酸菌作为载体？）尚未正式上市。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,42,4、亚单位疫苗与合成肽疫苗,利用物理化学方法提纯病原微生物中具免疫原性的组份，或者利用基因工程表达该组分，纯化后加入佐剂而制成。猪传染性胸膜肺炎的亚单位疫苗中含有毒素I，毒素II，毒素III和外膜蛋白等，能提供对所有15个血清型的交叉保护力。口蹄疫合成肽疫苗：人工合成口蹄疫病毒VP1蛋白中具有较强免疫原性的抗原片段，加入佐剂制成。,42,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,43,多肽合成仪,Pall 超滤,鸣谢：上海申联生物科技公司，口蹄疫多肽疫苗设备,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,44,5、核酸疫苗,将病原微生物或寄生虫基因组中编码免疫原性蛋白的基因克隆到真核表达载体中获得重组质粒，这种质粒即为核酸疫苗。制备核酸疫苗的常用真核表达载体有pcDNA3.1(+)、pSV2、pRSV和pCI等。核酸疫苗可以用大肠杆菌大量制备，成本较低。但基于安全性考虑，核酸疫苗多处于实验研究阶段，尚未大量应用。,44,5、核酸疫苗构建策略,2013.11.23,45,湖北省动物疫病培训,核酸疫苗的免疫应答机制,2013.11.23,46,湖北省动物疫病培训,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,47,6、转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine）,将免疫原性基因插入植物基因组中，获得表达免疫原性的植物，再从植物中提纯蛋白用于注射动物或直接将植物饲喂动物产生免疫力。如转入微生物抗原的马铃薯、玉米或蔬菜等，称为转基因可食疫苗（ediable vaccine）。,47,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,48,制备转基因植物疫苗的两种方法：构建稳定表达的整合表达系统，将病原免疫原性基因整合到植物基因组中而获得表达，并可遗传到下一代植物中；构建含有外源基因的植物病原如农杆菌等，利用这种植物病原感染植物，使抗原在植株中获得瞬时表达。,转基因植物疫苗制备方法,6、转基因植物疫苗（技术路线）,2013.11.23,49,湖北省动物疫病培训,6、转基因植物疫苗（免疫机制）,2013.11.23,50,湖北省动物疫病培训,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,51,（1）将PEDV的COE、S基因转化到烟草中,检测到转化植株叶片中含抗原，提取转基因植物蛋白注射小鼠,证明其具有免疫原性，可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫。（2）抗蓝耳病的转基因烟草：第6届亚洲猪病会论文,转基因植物疫苗的应用,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,52,外源基因插入到植物基因组中后,可能干扰内源基因的表达,引起植物生长出现异常烟草组织中含有大量的生物碱,对人和动物有毒,不能直接食用。马铃薯不宜生食，不宜作为首选受体等 抗原蛋白表达量低,如何确定饲喂量和有效剂量。大规模的提取与纯化等都需要进一步研究,转基因植物疫苗应用需解决的问题,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,53,（二）、疫苗的评价,1、实验室评价 主要是评估安全性、免疫效力、免疫持续期和疫苗稳定性等四个方面，是在可控的环境中测试疫苗的性能。2、临床评价 除了观察安全性、测定免疫学指标和降低临床症状的出现外，应该评估其经济效益即投入产出性价比。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,54,安全性测定 按照推荐的免疫途径，给本动物免疫2倍免疫剂量（灭活疫苗）和10倍免疫剂量（活疫苗）。安全性测定有时需要测定疫苗对与本动物密切接触的非靶动物的安全性 免疫效力评估 免疫后不同时间，使用流行强毒株攻击，测定体温反应、成活率、生长指标和观察症状。,1、实验室评价,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,55,免疫持续期 在不同时间,连续测定其保护性免疫学指标，结合免疫学指标与保护力之间的线性关系，判定疫苗免疫后的免疫效力的时间。疫苗稳定性 主要是不同批次疫苗在不同温度（室温、冷藏和冷冻条件）保存不同时间后，其免疫原性和物理化学性状是否发生改变。通过测定免疫后的抗体水平来确定。,1、实验室评价,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,56,猪圆环病毒灭活疫苗：提高保育猪或全程的成活率；提高猪群的整齐度；提高饲料报酬；降低与其他疾病（尤其是副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病）混合发生的概率；经济效益是否提高。猪瘟疫苗：是否控制猪瘟临床案例的发生，如降低发病率和死亡率；是否提高母猪繁殖性能。,2、临床评价（实例）,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,57,猪繁殖与呼吸综合征疫苗：观察接种动物的临床指标（一定比例的呼吸道症状和母猪流产率？）降低猪群发病率、死亡率和淘汰率提高母猪繁殖性能，如受胎率、窝产活仔数，降低繁殖障碍；提高哺乳仔猪和断奶仔猪的成活率；其它疫苗免疫后的抗体水平，是否干扰？,2、临床评价（实例）,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,58,（三）疫苗使用注意事项,经过流行病学调查，有针对性选择疫苗，不可盲从。确保疫苗运输和使用过程中的冷链保障。不可扩大使用对象。制定合理的免疫程序，避免母源抗体干扰。细菌活疫苗使用前后不可同时使用抗生素或有抗菌活性的中草药。建议使用于健康猪群疫苗使用后，要做好生产记录，正确评估效果。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,59,二、诊断试剂,概念：借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测，达到诊断疾病的目的。在动物疾病的免疫学检测，可以通过检测病原或产生的抗体，达到诊断的目的。病原检测包含检测蛋白质（抗原）和病原核酸。,59,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,60,（1）沉淀试验；该技术已经用于副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定。（2）凝集试验；已经用于猪细小病毒病和乙型脑炎等传染病的诊断，猪伪狂犬病毒的乳胶凝集试验（3）标记抗体技术；如猪伪狂犬病抗体检测ELISA、猪繁殖与呼吸综合征N蛋白ELISA试剂盒，猪圆环病毒病抗体检测。,抗体检测方法的分类,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,61,注意事项,在免疫猪群，尽可能使用区分野毒感染和疫苗免疫动物的鉴别诊断试剂盒：伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断试剂盒 猪传染性胸膜肺炎Apx-ELISA鉴别诊断试剂盒 口蹄疫3ABC-ELISA鉴别诊断试剂盒。在PCR检测中，建议测序分析，确认感染的病原,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,62,三、卵黄抗体（高免血清）,将动物疫苗免疫产蛋鸡，收获鸡蛋，分离卵黄，搅拌均匀，即为卵黄抗体，其中含有特异性抗体。进一步提纯其中的IgY，即为精制卵黄抗体。卵黄抗体已经应用于鸡新城疫、传染性法氏囊病和鸭病毒性肝炎的被动治疗中。猪腹泻病如仔猪大肠杆菌、传染性胃肠炎、流行性腹泻和轮状病毒病的治疗中也有应用。,2012.10.2,2012年兽医硕士课程,62,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,63,四、微生态制剂,凡能抑制有害微生物生长或促进正常微生物生长的微生物制剂，均可作为微生态制剂。将正常菌群如双歧杆菌、枯草杆菌、蜡样芽胞杆菌、乳酸杆菌等在体外大量培养，再与赋形剂如玉米、滑石粉等混合，即为微生态制剂。从食品安全的角度看，微生态制剂可逐步取代抗生素的预防功能。我国已经批准了很多微生态制剂，如调痢生。,63,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,64,五、干扰素,概念：干扰素是动物体内在干扰素诱生剂作用下，由单核细胞和淋巴细胞合成的一种抑制病毒增殖的活性分子，也具有抗病毒和免疫调节的活性。目前在我国批准的干扰素制品是从猪白细胞中提取的天然猪白细胞干扰素。重组干扰素在临床中也有应用的报道,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,65,干扰素的应用,在兽医临床应用方面,主要是使用 IFN 预防和治疗病毒的感染。在国内,基因工程干扰素已经由单一成分发展为多成分、多功能制剂。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,66,六、抗菌肽,概念：抗菌肽是指在动物或昆虫体内分泌的具有抑菌或杀菌作用的小分子多肽，是动物机体抗感染过程中分泌的重要物质。生物学功能：抗细菌、抗囊膜病毒和抗肿瘤作用,66,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,67,抗菌肽杀菌（机理）,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,68,抗菌肽对细菌的杀伤作用（实例）,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,69,抗菌肽对副猪嗜血杆菌的杀伤作用,对照,抗菌肽Moricin处理,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,70,对照,抗菌肽 cecropin B处理,抗菌肽对副猪嗜血杆菌的杀伤作用,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,71,抗菌肽的制备与应用,目前生产抗菌肽主要是依靠基因工程表达实现的，如大肠杆菌和酵母系统，但由于其分子量小难以纯化，在表达的过程中容易对宿主菌本身产生毒性作用，反过来限制其大量表达，因而如何优化表达条件是抗菌肽生产的关键之一。天蚕素（cecropins）和防御素（defensins）还可通过人工合成实现商业化制备。主要用于预防肠道腹泻性疾病,71,华中农大与国内企业合作，研制和获得了21项新兽药注册证书（猪用：16个）,2013.11.23,72,湖北省动物疫病培训,鸣谢：武汉科前、中牧股份、武汉中博、南京天邦,猪圆环病毒2型WH株分离与灭活疫苗研制,GenBank：FJ598044 PCV2-WH株基因组为PCV2b病毒滴度10-7.0TCID50/mL病毒拷贝数为：5.84108/0.1g新灭活工艺：破坏核酸，保持抗原结构优质佐剂只需免疫一次,2013.11.23,73,湖北省动物疫病培训,总 结,在目前我国养殖环境条件下，猪用疫苗仍然是预防重大传染病的工具；多联/多价疫苗是发展方向。诊断试剂将向现场化、定量化和高通量化方向发展；区分疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断方法的研制与应用是根除疾病的关键手段。微生态制剂与抗菌肽将逐渐取代抗生素的预防保健功能。,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,74,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,75,75,谢谢各位！欢迎案例与技术讨论QQ:104 9314 409（实名制）,2013.11.23,湖北省动物疫病培训,76,致 谢！,国家生猪产业技术体系建设项目（nyzctx-2009，CARS-36）国家自然科学基金课题公益性行业科技专项国家“十一.五”科技支撑计划科技部成果转化资金项目科技部科技人员服务企业课题,
