原位杂交技术.ppt
,原位杂交技术 in situ hybridization,天马行空官方博客：http:/；QQ:1318241189；QQ群：175569632,原位杂交技术是将分子生物学与细胞 化学技术结合起来，以标记的核酸分子为 探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子 的技术,原位杂交技术,杂交组织化学技术原位杂交免疫细胞化学技术,对特定生理或病理条件下从DNA到mRNA 到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是研究基因表达强有力的手段 如细胞遗传学，产前诊断，肿瘤，病毒学等 特别是将肿瘤的病因学、发病学、诊断学和治疗学等方面的研究提高到基因水平,原位杂交技术的应用,光镜或电镜 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下在原位检测特异的核酸分子，这种定位能够反应特异核酸分子与组织、细胞或细胞器的关系,原位杂交技术的特点,天马行空官方博客：http:/；QQ:1318241189；QQ群：175569632,1969年，Gall等人首次应用原位杂交方法检测 病毒DNA，核糖体DNA 1971年，Jacob 创立电镜原位杂交技术检测爪 蟾卵母细胞DNA 80年代，原位杂交技术飞速发展 现已能检测只有数百碱基对的较小分子 DNA和含量很低的mRNA,原位杂交技术的发展,探针标记的发展,同位素 酶、荧光素、生物素、地高辛 地高辛（digoxin）敏感性高，现广泛应用（标记试剂盒）,第一节 原位杂交技术的原理,使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子 101页,一、核酸分子杂交（一）探针（二）标记（三）靶核酸分子（四）原位分子杂交 二、杂交体的探测（一）放射自显影（二）免疫细胞化学,原位杂交技术的原理,一、核酸分子杂交,DNA双链分子在一定条件下可发生变性和复性的过程,在高温、强酸或强碱等作用下，双链DNA分子空 间结构破坏，双螺旋解旋，双链之间的氢键和 疏水键也被破坏，最后两条链解离,变性,DNA,变性,双链DNA分子在一些因素作用 下两条链解离的过程称为变性,复性,复性可以发生在导致变性的高温下降的时 候，因此又将复性称为退火(活细胞内的DNA在进行复制和转录时也存 在着变性和复性的过程),退火,变性的两条互补DNA单链在适当条件 下重新缔合成双链的过程称为复性,原位杂交,以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 再对其探测,利用已知的标记的核酸序列（探针）去识别组织中待测的DNA 和 RNA,(一）探针,原位杂交的探针是：已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子）,1 cDNA 2 RNA 3 寡核苷酸,1.cDNA 探针,双链cDNA探针是最常用的核酸探针 特别适用于基因表达的研究 双链cDNA探针是克隆于质粒载体中的 特异cDNA分子（针对某个蛋白质分子目的蛋白的编码序列）,（complementary DNA）,互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）,制备克隆于质粒中的特异cDNA分子,简要过程：从mRNA逆转录生成cDNA 构建cDNA文库（特异重组体的克隆）筛选和克隆特异cDNA分子 最后克隆入质粒载体保存,克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 较稳定，不易被降解 标记方法可靠易行,cDNA双链探针的优点：,2.RNA探针,优点：杂交效率比DNA探针高 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链 缺点：,RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）,容易受RNA酶的污染而被降解,3.寡核苷酸探针,这类探针是根据靶分子而设计序列 在DNA合成仪上用化学方法合成 优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）缺点：特异性较低（短链和简单）,短链探针(长度10-50个核苷酸),（二）探针标记,1、标记物 放射性标记物 非放射性标记物 2、标记方法 DNA探针标记 RNA探针标记 寡核苷酸探针标记,1.标记物,放射性标记物：同位素 非放射性标记物：荧光素 生物素 地高辛等 标记分子：某种单核苷酸 在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响,放射性标记物 非放射性标记物,常用的同位素有：35S、33P、32P 和 3H标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP 等等,放射性标记物,非放射性标记物,被导入某个单核苷酸而形成标记分子 如：四甲基罗达明-UTP 生物素-UTP(Bio-UTP)地高辛-dUTP(Dig-dUTP)溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子,（荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等）,2.标记方法,将放射性或非放射性的标记分子 在各种酶促反应中参入探针分子,酶 法,（1）DNA 探针标记,（2）RNA探针标记,（3）寡核苷酸探针标记,切口移位法 随机引物法,在体外转录技术中与探针制备同时完成,末端转移法,（三）靶核酸分子,靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA 或RNA）DNA 可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体DNA或 病毒DNA RNA 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子 的mRNA，也可以是核糖体rRNA 线粒体或病毒RNA,1.杂交体 2.杂交条件 3.严格度的概念,（四）原位分子杂交,1.杂交体,hybrids,稳定性依次是：DNA-DNA DNA-RNARNA-RNA 稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度 温度等,DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA,2.杂交条件,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,（1）杂交液,钠盐（杂交效率 非特异反应）甲酰胺（使杂交所需温度降低）硫酸葡聚糖（提高探针浓度）牛血清白蛋白和载体DNA等（阻断探针与组织非特异结合，背景）,杂交条件,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,（2）探针浓度,探针浓度影响杂交反应的速度 放射性标记探针0.5g/ml 非放射性为2g/ml 最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定,杂交条件,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,（3）温度,杂交时温度一般低于相应杂交体的Tm值25（Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时 杂交温度：对DNA探针是42 对RNA探针是50-55 对寡核苷酸探针是37,pH在5-9范围内，杂交体形成不受影响常用缓冲液pH为6.5-7.5,杂交条件,（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间,（4）pH,（5）时间,一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成 孵育6小时后-杂交信号不再增强 反应超过24小时后-已形成的杂交体可能发生解 链，杂交信号反而减弱,在某些条件下，探针可以与含不相配碱基的核 酸序列结合而形成不稳定的杂交体 高严格度条件下 碱基完全互补的双链可形成杂交体 低严格度条件下 碱基对不完全互补的双链也能形成杂交体,3.严格度的概念,严格度（stringency）决定探针是否与含不相配碱基的 核酸序列结合的条件称为严格度,使标记的杂交体在光镜或电镜下可见（一）放射自显影方法（二）免疫细胞化学方,二、杂交体的探测,用同位素标记探针来显示杂交反应的方法,（一）放射自显影方法,方法：切片上涂覆核子乳胶膜 置于暗盒中于4干燥处自显影 经显影和定影后在显微镜下观察银粒 在细胞和细胞器的分布情况,依据免疫细胞化学原理用直接法或间接法来显示探针标记物,（二）免疫细胞化学方法,报告分子（reportermolecules）在杂交后探测技术中，为显示探针标记物而 使用的免疫细胞化学标记物常被叫做报告分子 即与抗体（或亲和素、A蛋白、）联结，最终在 显微镜下可见的分子：荧光素 胶体金 酶-过氧化物酶-H2O2和DAB 碱性磷酸酶-NBT/BCIP 用地高辛标记的探针用荧光素、胶体金、酶标记抗地高辛抗体来显示,靶核酸分子,地高辛标记探针,碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体,光镜非放射性原位杂交：地高辛标记探针碱性磷酸酶联结抗体检测,靶核酸分子,地高辛标记探针,小鼠抗地高辛抗体,胶体金联结的抗小鼠抗体,电镜非放射性原位杂交：地高辛标记探针间接胶体金检测,第二节 原位杂交方法,一、探针 二、组织样品制备 三、原位杂交 四、杂交体的探测 五、基本实验过程 六、一些关键问题,（一）探针的选择,（一）探针的选择 cDNA和RNA：适宜于检测mRNA分子 对一些研究热门的靶核酸分子最方便而可 靠的办法是选购商品化探针乃至标记探针 寡核苷酸探针和单链cDNA探针可从网上查获目 的基因的序列，设计出探针的序列由专业公司 合成,一、探针,（二）探针标记物的选择,（二）探针标记物的选择,原位杂交标记物的检测灵敏度排序是：生物素在动物细胞内是羧化酶的辅酶在肝、肾、心、肺等组织含量特别丰富，并集中在 线粒体内 地高辛-从洋地黄植物的花和叶中提取（动物细 胞中不存在）,32P35S3H地高辛/生物素,同位素灵敏度高,探针,二、组织样品制备,(一)去除或抑制RNA酶,原位杂交的靶分子是细胞中的 DNA 和 RNA DNA-是稳定的核酸，可以经受各种环境因素 作用而长久稳定不变 RNA-非常容易降解 细胞内源性的RNA酶很丰富 广泛存在于环境中 耐热、耐酸碱，活力很强,去除或抑制RNA酶的方法有两类 物理方法：对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器 具作高温烘烤（180-200干烤4-6小时）对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 化学方法：焦碳酸二乙酯(DEPC)作用机制是通过与组氨酸结合而使蛋白 质变性,去除或抑制RNA酶方法：,（二）取材 组织要求新鲜，迅速投入固定液 取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制处理的器具接触标本 标本置于低温环境可抑制RNA酶作用（三）固定 4%多聚甲醛 2-6小时（培养细胞30分钟）,(二)取材,(三)固定,组织样品制备,(六)冷冻切片,（四）包埋和切片,（四）包埋和切片 常规（五）电镜原位杂交 包埋前技术 包埋后技术（六）冷冻切片 冷冻切片保存靶核酸较多 较易获得杂交信号,(五)电镜原位杂交,组织样品制备,1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时（过氧化物酶 碱性磷酸酶）2.RNA酶处理3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶核 酸周围的蛋白质，增加探针等反应分 子对靶核酸分子的接触机会,三、原位杂交,（一）杂交前处理,表面活性剂：Triton X-100 SDS(十二烷基硫酸钠)Tween（配成各种较低浓度与切片孵育1-5分钟）蛋白酶：蛋白酶K 胰蛋白酶(pepsin)胶原酶（富含结缔组织或肝脏切片）,通透物质有两类蛋白酶和表面活性剂,（二）预杂交,（三）探针和靶核酸的变性,（二）预杂交 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育（作用是减低非特异反应，改善杂交信号/噪音比）（三）探针和靶核酸的变性 当靶核酸或探针为DNA时，杂交前需要 使它们变性成为单链,组织切片的杂交方法:滴加含有探针的杂交液后，盖上高温烘烤过并硅化过的盖玻片或无菌的石蜡膜置于一湿盒内，在合适温度的烤箱内杂交 超薄切片:将镍网的切片面朝下浮于杂交液液滴上，置于湿盒内杂交,（四）杂交,（五）杂交后漂洗,用浓度递减的SSC溶液 在一定温度和振荡下漂洗切片（这一步骤是调整严格度的重要机会）(如果杂交信号太弱或没有，可以降低漂洗的严格度)(如果背景太强、信号不特异，可提高漂洗的严格度),四、杂交体的探测,如用同位素标记探针 用放射自显影方法即可显示杂交体的定位 如用生物素标记探针 用过氧化物酶联接的抗生物素抗体探测（即在杂交后经漂洗，先与酶联接抗生物素抗体孵育，再加入过氧化物酶的底物H2O2和DAB显色，最后在光镜下观察到杂交信号为棕黄色沉淀）,五、基本实验过程,探针标记纯化变性 原位杂交杂交体探测：样品制备切片通透处理,放射自显影,免疫细胞化学,六、一些关键问题,(一)防止靶mRNA分子降解,在mRNA为靶分子的原位杂交中应严格注意对RNA酶的提防尽可能减少靶分子的降解,根据组织、靶核酸种类以及探针、标记物和报告分子的种类，对固定剂及其浓度、固定时间作出摸索，使之最佳化,(二)样品固定,一些关键问题,(三)通透处理,(四)杂交湿盒,有无通透处理以及处理是否适当直接影响杂交信号的有无及强弱,杂交所需较高温度和较长时间，要保证如此微小液滴既不蒸发干涸又不吸水稀释，才能保证杂交体系的稳定（可用相同浓度的SSC制成湿盒或覆盖）,假阳性结果和非特异反应可出现各个层次 探针、探针标记物、抗体、报告分子 检测mRNA时：如果细胞核内出现杂交信号，说明有探与DNA的非特异结合，可降低探针浓度或杂交前用DNA酶降解DNA 如果无关细胞胞浆出现信号，说明有探与mRNA的非特异结合，可提高杂交和漂洗时的严格度,1.探针与非靶核酸分子杂交,(五)非特异反应,一些关键问题,细胞的自发荧光和内源性生物素可以干扰用于探针标记的荧光素和生物素的作用，在未经杂交的阴性对照片上造成假阳性结果 在电镜水平的原位杂交中，由于技术灵敏度本来较低，杂交信号往往较弱，而内源性生物素在线粒体含量丰富，在细胞浆内也有一定量，可以造成比信号更强的背景干扰 地高辛因来自植物，不存在于动物细胞中，所以没有内源性等同物的干扰,2.探针标记物有内源性物质干扰,非特异反应,3.抗体的非特异结合,杂交后免疫组化检测所用的一抗或二抗，都可与细胞成分有非特异的结合，因此在抗体孵育前往往需要用白蛋白、血清等对非特异结合位点进行“封闭”，另外，应注意抗体稀释度合适,常用的报告分子过氧化物酶,4.报告分子有内源性物质干扰,非特异反应,（六）调整严格度,信号太弱时可降低严格度背景太其强时可提高严格度,一些关键问题,A,B,C,D,使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交,再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子,第七章 重 点,一、原位杂交技术的原理,双链DNA分子在一些因素作用下 两条链解离的过程称为变性 变性的两条互补DNA单链在适当条件 下重新缔合成双链的过程称为复性,1、变性,2、复性,二、名词解释,原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子）指所要探测的核酸分子或核苷酸序列 5、严格度 决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件称为严格度,3、探针,4、靶分子,原位杂交技术中，先将标记的核酸探针与组织细胞中靶核酸分子结合形成杂交体，然后用同位素或免疫细胞化学技术探测杂交体 如 用地高辛标记核酸探针，杂交后用碱性磷酸酶联结的小鼠抗地高辛抗体与探针结合，这里应用的是免疫细胞化学技术 为了使酶可见，再加入其底物四唑氮蓝和吲哚酚，最终形成蓝紫色物质，这就是酶细胞化学技术 这样，通过酶细胞化学最终产生蓝紫色物质，间接探测了酶的定位，又通过酶联抗体与探针的免疫组化反应，间接探测了探针，进而间接探测了靶核酸的定位,第一部分 一、名词解释 1、二次电子 2、透射电子 3、分辨率 4、电子染色 5、负染色 6、电子显微镜 二、简答题 1、简述透射电镜的取材要领 2、简述半薄切片的意义 3、简述透射电镜工作和成像原理 4、请从成像、样品制备、图象特点及应用 几方面对TEM和SEM做以比较,第二部分 一、名词解释 1、免疫细胞化学 2、标记物（免疫细胞化学）3、探针(原位杂交)4、复性 5、变性 6、靶分子,二、简答题 1、何谓APAAP法 2、何谓PAP法 3、简述酶细胞化学技术中捕捉反应的设计思路 4、简述免疫细胞化学反应的原理 5、简述免疫细胞化学的直接法和间接法 6、试说明在原位杂交技术中,杂交体的探测怎 样结合了各种细胞化学技术达到使靶核酸分 子可见的目的,
