自身免疫病与自身抗体的检测.ppt

自身免疫病与自身抗体的检测,与自身免疫性疾病相关的基本概念,免疫 机体识别和排除抗原性异物的功能，也就是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以排除抗原为目的的生理过程。体液免疫-产生抗体细胞免疫-致敏淋巴细胞,与自身免疫性疾病相关的基本概念,隐蔽抗原：机体有些组织成分由于解剖位置的特殊性，正常情况下终生不与免疫系统接触，称为隐蔽抗原。眼晶状体、葡萄膜-交感性眼炎；精子男性不育。,与自身免疫性疾病相关的基本概念,自身免疫：是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）致敏淋巴细胞的现象。,与自身免疫性疾病相关的基本概念,自身免疫病：是指在各种内外因素的作用下，自身免疫反应过强，超过了生理性自身免疫反应的强度且持续相当长时间，造成对正常细胞、器官的功能与结构的破坏，呈现与此损伤相关的临床表现及免疫学异常。,自身免疫性疾病发生的原因,机体抗原特异性淋巴细胞发生异常，对正常组织发生免疫应答状态；机体自身组织成分发生改变从而引起的免疫应答状态。,自身免疫病的基本特征,多数自身免疫病的病因不清，有些自身免疫病的发生和复发似乎与某些外因有关，但大多数自身免疫病是“自发”地发生的，目前未找到肯定的外因。,自身免疫病的基本特征,血液中可检出高滴度的自身抗体和（或）与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞。,自身免疫病的基本特征,组织器官损伤和功能障碍的范围取决于自身抗原分布:器官特异性自身免疫病：桥本氏甲状腺炎，非器官特异性自身免疫病：如系统性红斑狼疮（SLE）。,自身免疫病的基本特征,自身免疫病的发生与多因素相关，包括遗传因素、性别差异、年龄大小、气候环境及地理位置等。,自身免疫病的基本特征,遗传因素：强直性脊柱炎（AS）患者90%为HLA-B27阳性，然而在HLA-B27阳性的人群中发生强直性脊柱炎的可能仅为2%，而第一级HLA-B27阳性的亲属中，发生强直性脊柱炎的危险性达20%。,自身免疫病的基本特征,系统性红斑狼疮（SLE）的家族发病率也较高，在SLE第一代亲属中发病率达3%-5%，同胞姐妹发病率更高，特别是单卵双胎更为常见。在1980年的调查中35组单卵双胎的患者中，有22组患SLE，共患病率达62.9%，而双卵双胎8组中仅1组患病，为12.5%。,自身免疫病的基本特征,性别差异和年龄大小：强直性脊柱炎（AS）多见于年轻男性，其发病年龄从4-90岁不等，但以15-20岁多见，男女比列为9-10:1，但最近有人调查发现男女比列约为1.5-3:1，只不过女性 强直性脊柱炎患者起病缓慢，病情较轻，易被误诊。,自身免疫病的基本特征,系统性红斑狼疮（SLE）是最常见的自身免疫性疾病之一，发病的男女比列为1:9，在生肓年龄甚至可高达1:30，而且多发生于20-40岁的孕龄妇女。,自身免疫病的基本特征,大多数自身免疫病呈现出发作缓解复发缓解迁延的临床特征，以致成为终身痼疾。,自身免疫病的基本特征,免疫抑制剂（肾上腺皮质激素、环磷酰胺）治疗有一定疗效，但副作用与不良反应严重，停药后常易复发。,自身免疫性疾病临床“病谱”,器官特异性 非器官特异性桥本甲状腺炎 类天疱疮 自身免疫性肾小球肾炎 系统性红斑狼疮原发性粘液水肿 恶性贫血 肺肾出血综合征 干燥综合征甲状腺机能亢进 自身免疫性萎缩性胃炎 绝经过早（少数病例）类风湿关节炎Addisino病 自身免疫性肝炎 男性不育（少数病例）硬皮病1型糖尿病 原发性胆汁性肝硬化 溃疡性结肠炎 多发性肌炎/皮肌炎重症肌无力 原发性硬化性胆管炎 克隆氏病 混合性结缔组织病多发性硬化症 自身免疫性溶血性贫血 交感性眼炎 系统性血管炎脱髓鞘疾病 特发性血小板减少性紫癜 晶状体源性葡萄膜炎 抗磷脂综合征寻常天疱疮 特发性粒细胞减少症 药物性狼疮自身免疫性疾病有一百多种，发病率占世界人口的10%自身免疫性疾病几乎遍布临床各科（非手术科）疑难病症？,常见的自身免疫性疾病图片资料,系统性红斑狼疮（SLE）,常见的自身免疫性疾病图片资料,类风湿性关节炎（RA）,常见的自身免疫性疾病图片资料,系统性硬化症（PSS）,常见的自身免疫性疾病图片资料,干燥综合症（SS）,常见的自身免疫性疾病图片资料,皮肌炎/多发性肌炎（DM/PM）,自身抗体的检测,自身抗体：是指抗自身细胞内，细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。,自身抗体的检测,自身抗体是自身免疫病的重要标记，每种自身免疫病都伴有特征性的自身抗体，某些自身抗体因对疾病的诊断具有高度的特异性，已成为诊断某些疾病的血清标记性抗体或特异性抗体，某些自身抗体与疾病的活动性有相关性，个别的自身抗体被证实参与了组织的免疫病理损伤。,自身抗体的检测,自身抗体检测的临床意义有助于自身免疫病的早期诊断；有助于判断疾病的活动性和预后，观察治疗反应，指导临床用药；有助于进一步研究和阐明自身免疫性疾病的发病机制。,自身抗体的检测方法,间接荧光染色技术（IIF）实验原理细胞、组织切片或纯化的、生化性质明确的物质均可作为检测自身抗体或病原体抗体的抗原基质。如标本为阳性，已稀释血清中的特异性抗体将与包被在固相上的抗原结合。第二步，已结合的抗体与荧光素标记的抗人抗体结合，然后在荧光显微镜下观察结果。,自身抗体的检测方法,间接荧光染色技术（IIF）,自身抗体的检测方法,间接荧光染色技术（IIF）特异性高：阴阳性结果的信号强度对比明显。每种已结合的抗体在相应抗原的位置产生典型的荧光模型。基质中抗原谱完整，可检测多种抗体，并且检出率高。当制备酶免试剂所需要的抗原太困难或复杂时，可选择间接免疫荧光法。,自身抗体的检测方法,核均质型：ds-DNA或抗组蛋白？,自身抗体的检测方法,斑点型（S）：抗SSA、抗SSB？,自身抗体的检测方法,着丝点型（ACA）：抗着丝点抗体。,自身抗体的检测方法,抗纺锤体抗体,自身抗体的检测方法,ELISA法检测ANA原理：利用ELISA法，搜集细胞核和细胞浆抗原，如ds-DNA、Histones、Sm、RNP、SSA、SSB、Scl-70、centromere、Jo-1等混合液包被微孔板，检测抗核抗体。,自身抗体的检测方法,ELISA法与IIF法比较，有操作简便，结果判断较客观，无需荧光显微镜等优点，现在一些医院用ELISA法来作检测ANA的筛选方法。,自身抗体的检测方法,颗粒凝集法(PA）原理：以检测抗脱氧核糖核蛋白体（抗DNP抗体）为例。从小牛胸腺中提取脱氧核糖核蛋白(DNP）抗原，致敏聚苯乙烯乳胶，制成抗DNP抗体乳胶凝集试剂，当血清中存在抗DNP抗体时，便与乳胶颗粒上的DNP抗原结合，使乳胶颗粒相互凝集出现肉眼可见的凝集颗粒。,自身抗体的检测方法,金标免疫斑点法原理：斑点反应板上固相纯化抗原与血清中抗体形成复合物，胶体金标记抗人IgG单抗与复合物结合，形成肉眼可见的红色圆斑点。本法用于快速检测血清中抗体。,自身抗体的检测方法,免疫印迹法(IB）：原理：用SOS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将抗原按分子量大小予以分离，再将其转移至硝酸纤维薄膜，如果受检血清含有相应抗原的自身抗体，则在相应位置会发生免疫反应，再加酶标抗体，底物，显色液和终止液，在抗原抗体反应的位置出现显色带，与标准带相比较。,自身抗体的检测方法,免疫印迹法(IB）：,自身免疫病常规实验室检查,血常规：RA：80%贫血，活动期PLT升高。SLE：WBC，PLT，Hb均可能降底。免疫血管炎：WBC增高。对药物引起的骨髓抑制的监测。,自身免疫病常规实验室检查,尿常规：SLE：尿蛋白及RBC的出现表明肾脏损伤。,自身免疫病常规实验室检查,肝功能：如有异常，应鉴别是何种性质（自身免疫肝病？）病原感染常规检查肝炎病毒：HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGVEBV,TB,自身免疫病常规实验室检查,肾功能：免疫肾病（SLE？血管炎？）肌酶：多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）尿酸：痛风？,自身免疫病常规实验室检查,免疫血清学检查免疫球蛋白、血清蛋白电泳（高球蛋的血症）。ESR、CRP（急性期蛋白）：对病情活动性的判断。CH50、C3、C4：SLE活动期均降底。ASO：链球菌感染，风湿热。,自身免疫病常规实验室检查,抗核抗体谱（ANAs）抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAs）类风湿关节炎相关抗体自身免疫性肝病相关抗体抗磷脂抗体其它,抗核抗体谱(ANAS）的检测,抗核抗体(ANA）是自身抗体中的一组抗体。ANA的研究，从发现狼疮(LE）细胞算起，迄今40多年来，人们对ANA的认识不断加深，已衍生出具有不同临床意义的二十余种ANA，形成了抗核抗体谱(ANAS）。,抗核抗体谱(ANAS）的检测,抗核抗体：传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。,抗核抗体谱(ANAS）的检测,ANA检测IIF法(金标准)1、90%以上实验室使用Hep-2细胞为底物;2、为人来源培养细胞（人喉癌细胞），据有核大、细胞结构清晰特点；3、便于结构观察及荧光染色核型分析；4、核抗原丰富、特异性强、有完整的ANA抗原谱(细胞核、浆、骨架、周期）；5、可预测分析ANA靶抗原范围；6、经验性强。,IIF法检测ANA阳性常见荧光染色模型细胞核 细胞浆 细胞骨架 细胞周期均质型 核糖体型 肌动蛋白型 中心体型核膜型 线粒体型 波形蛋白型 纺锤体型斑点型 高尔基体 中间体型核仁型 溶酶体型着丝点 颗粒型（粗、细）PCNA型核（多、少）点型,抗核抗体谱(ANAS）的检测,在实际工作中，不管用何种方法来检测ANA，实际上都是指总抗核抗体检测。若检测结果为阳性，则需进行分型。,抗核抗体谱(ANAS）的检测,抗核抗体(ANA)的阳性率SLE 95%PSS 70-80%MCTD 95%SS 60-70%PM/DM 50-60%RA 20-30%自身免疫性肝炎 80-90%正常人 5-20%,IIF法检测ANA阳性常见荧光染色模型细胞核 细胞浆 细胞骨架 细胞周期均质型 核糖体型 肌动蛋白型 中心体型核膜型 线粒体型 波形蛋白型 纺锤体型斑点型 高尔基体 中间体型核仁型 溶酶体型着丝点 颗粒型（粗、细）PCNA型核（多、少）点型,抗心磷脂抗体（ACL）,抗心磷脂抗体（Anti-Cardiolipin Antibodies ACL）是抗磷脂抗体中的一个重要组成部分，可在多种结缔组织病中出现，抗心磷脂抗体可分为IgA、IgM、IgG。,抗心磷脂抗体（ACL）,研究表明ACL在SLE中阳性率为30%，其次在RA中阳性率为23%，都以IgG型为主。在SLE病人当中ACL阳性者狼疮脑病的发病率明显高于ACL阴性患者，另外，血小板减少，血管栓塞和习惯性流产也与ACL抗体密切相关。,抗心磷脂抗体（ACL）,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,类风湿因子（Rheumatoid Factor RF）是IgGFc端的自身抗体，因为它是抗体（即IgG）的对应抗体，故也称为抗抗体。RF可以是IgG、IgA、IgM型，现在一般说的RF是指IgM类风湿因子。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,RF出现于的RA病人血清中，约30%的SLE、约50%的SS，部分MCTD和少数PSS病人也可呈阳性，在某些病毒、原虫、细菌感染和肿瘤等非自身免疫病患者也可以出现。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,RA是一种最常见的自身免疫性疾病，在全世界大约有1%的人患有此病。是以关节滑膜炎症的慢性自身免疫性疾病，其预后变异大，轻者发生轻度关节畸形，重者则发生严重致死性病变。RA诊断和治疗晚，则疗效不满意。早期诊断和治疗，炎症有可能发生可逆性改变，这就显得RA的早期诊断极为重要。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,类风湿因子（RF）：阳性率为79%，特异性为63%。抗核周因子抗体（APF)：阳性率达为81%，特异性为73-90%。抗角质蛋白抗体（AKA）：阳性率为36-69%，特异性为95-99%。抗RA33抗体：阳性率为35%，病情相对较重。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,抗Sa抗体：IB法检测的敏感性为40%，特异性为99%，阳性预报率为98%。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体：一种远比类风湿因子特异的RA的指标。抗CCP阳性患者比阴性的患者更容易发展成可通过放射性方法检测到的关节损伤。ELISA法敏感性为80%，特异性为96%。在79%的早期患者中可检出抗CCP抗体。,类风湿性关节炎（RA）的早期诊断,这几种抗体都可以在RA起病一年内出现，除RF外的几种抗体对RA的诊断具有很高的特异性，故对RA的早期诊断有很大的帮助。,抗中性粒细胞胞浆抗体谱（ANCA）,ANCA是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。80年代中期发现ANCA，是临床诊断原发小血管炎的重要血清学标志。近10年来国际上对ANCA的研究进入了高潮，重要的ANCA抗原相继发现。,抗中性粒细胞胞浆抗体谱（ANCA）,ANCA靶抗原包括：蛋白酶3（PR3）髓过氧化物酶（MPO）人白细胞弹性a蛋白酶（HEL）乳铁蛋白（LF）组织蛋白酶G（CG）人溶酶体相关膜蛋白2（H-LAMP2）,抗中性粒细胞胞浆抗体谱（ANCA）,溶菌酶（LYS）杀菌/膜通透性增高蛋白（BPI）天青杀素防御素-浠醇酶-葡萄糖醛酸酶,抗线粒体抗体（antimitochondrial antibodiesAMA）AMA是一种无种属特异性和器官特异性的自身抗体。1965年WalRer等首先应用间接免疫荧光法（IIF）发现原发性胆汁肝硬化（PBC）患者血清中存在AMA。其后研究发现，PBC患者的AMA阳性率可高达90%，此项已成为PBC诊断的主要检查项目。,AMA迄今发现的亚型共有9种（M1-M9），其中与PBC相关的有4种，即抗M2、M4、M8、M9。抗M2被认为是PBC敏感特异的诊断标志性抗体。M2靶抗原的主要成分为丙酮酸脱氢酶复合物E2组分。高滴度的AMA-M2在PBC中阳性率大于96%，对PBC的诊断及鉴别有很高的特异性。,间接免疫荧光（IIF）是检测ANCA最早采用的方法，应用洒精固定的白细胞制备的抗原底物片，主要表现为两种阳性荧光染色型。,胞浆型ANCA（c-ANCA）：中性粒细胞胞浆弥漫性颗粒样染色，并在核叶之间有重染者称之。其靶抗原主要是蛋白酶3（PR3），存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中，约占c-ANCA的80-90%。,PR3-ANCA在临床上与韦格纳氏肉芽肿（WG）密切相关，c-ANCA诊断WG的特异性大于90%。PR3-ANCA在其它原发性血管炎中也可被检测到，如显微镜下多血管炎（MPA）、坏死性新月体型肾小肾炎（NCGN）、结节性多动脉炎（PAN）。,核周型ANCA（p-ANCA）：中性粒细胞核周围发荧光者称之。其靶抗原主要是髓过氧化物酶（MPO），存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中，资料显示MPO-ANCA参与血管炎相关疾病的致病机理。,Bye-bye!,