实验14 乳酸脱氢酶法测定血清乳酸、丙酮酸.ppt

1,河北北方学院医学检验学院侯丽娟,实验 14 乳酸脱氢酶法测定血清乳酸、丙酮酸,2,实验目的,掌握：乳酸脱氢酶法测定血清乳酸和丙酮酸的原理。熟悉：乳酸和丙酮酸测定的临床意义及其测定的注意事项。,3,一、乳酸脱氢酶法测定血清乳酸,二、乳酸脱氢酶法测定血清丙酮酸,4,一、乳酸脱氢酶法测定血清乳酸,实验原理,反应体系中加入肼可使丙酮酸不断被转换消除，促进反应完成。于340nm波长处测定反应中生成的NADH，定量乳酸浓度。,5,试剂与器材,1Tris-EDTA-肼缓冲液（pH9.8）2NAD溶液 3LD溶液（1 500U/ml）4底物应用液 Tris-EDTA-肼缓冲液27ml、NAD溶液3ml、LD溶液40l混匀。520mmol/L乳酸标准贮存液。62mmol/L乳酸标准应用液。70.1mol/L盐酸。8分光光度计或自动生化分析仪。,6,操作步骤,立即混匀，37水浴准确保温5min后立即加入0.1mol/L盐酸3ml终止反应。于340nm波长处，以空白管调零，读取各管吸光度。,7,计算,参考范围,血清乳酸：2.0mmol/L。,8,临床意义,高乳酸血症常见于：1组织严重缺氧。2慢性肝病、肝硬化、肝功能衰竭。3糖尿病和尿毒症患者。激烈运动时可出现生理性乳酸增高，恢复时迅速降低。,9,注意事项,1受试者应保持空腹及安静状态至少2h，避免手臂活动。抽血时如用止血带，应在穿刺后除去止血带至少2min后再抽血。标本放冰室保存待测。2如不做标准管，可根据NADH的摩尔吸光度值计算乳酸浓度，但反应条件必须标准化。3如使用自动生化分析仪，各实验室可根据分析仪的性能、型号设定参数。,10,评价,返回本实验目录,本法特异性高、操作简便，严格按取样程序采血，正偏差小，是乳酸测定的首选方法。,11,实验原理,二、乳酸脱氢酶法测定血清丙酮酸,通过测定340nm波长处NADH的下降速率，定量丙酮酸含量。,12,试剂与器材,10.1mol/L Na2HPO4溶液20.1mol/L KH2PO4溶液 30.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）4NADH溶液5LD溶液(550U/ml)6工作试剂 NADH溶液400l、LD溶液40l混匀，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释至10 ml。725mmol/L丙酮酸标准贮存液80.5mmol/L丙酮酸标准应用液9自动生化分析仪,13,操作步骤,根据实验室自动生化分析仪的型号、性能设定参数。下列参数可供参考：温度：37；波长：340nm；延迟时间：30s；监测时间：120s；样品体积：25l；工作试剂体积：275l。分别测定样品管和标准管吸光度的下降速率。,14,计算,参考范围,血清丙酮酸：0.1 mmol/L,15,临床意义,血液丙酮酸的测定与血乳酸测定的临床意义相近，糖尿病、充血性心力衰竭、严重肝病、严重感染等可使血丙酮酸的含量增加，并伴有高乳酸血症;可用于维生素B1缺乏症的诊断，维生素B1缺乏时，体内丙酮酸的氧化发生障碍，血丙酮酸的含量增加。,16,注意事项,1采血与处理同乳酸测定。2丙酮酸会发生聚合，其聚合体的酶促反应速率与非聚合体不同，故丙酮酸标准应用液必须每日新鲜配制。,17,评价,本法操作简便、快速，有较为精密和准确的分析性能、抗干扰能力强，能适应绝大多数自动生化分析仪，易于实现自动化，是目前临床测定丙酮酸的首选方法。,返回本实验目录,18,思考题,1血乳酸测定的标本在采集与处理过程中应注意哪些问题？2简述乳酸脱氢酶法测定血清乳酸的原理和测定的临床意义。3简述乳酸脱氢酶法测定血清丙酮酸的原理和注意事项。4试述血丙酮酸测定的临床意义。,19,返回总目录,谢谢！,