生物化学第十一章 DNA复制RNA转录DNA复制.ppt
第十章DNA的复制和修复,第一节半保留复制第二节参与DNA复制的酶与蛋白质第三节复制过程第四节DNA损伤及修复,一、概念,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,几个相关概念：1.复制起始点(origin,ori)原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体DNA有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位，两个起始点 之间的DNA片段称为复制子(replicon)。,复制子,2.复制叉(replication fork)复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。,二、实验依据,三、DNA复制的起点和方向,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验),四、复制特点半不连续复制 半保留复制,DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,复制特点,第二节参与DNA复制的酶与蛋白质,复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C dna X相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上结 合并打开双链。,一、DNA聚合酶（一）催化的反应特点以四种dNTP为原料需要模板需要引物催化反应方向为5-3 产物性质与模板链相同,（二）大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率,DNA聚合酶,109，000400+1,120，000100+-0.05,400，00010-20+-50,比较项目,DNA聚合酶,切除引物修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）,DNA聚合酶 I,（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）3 5外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；,5 3 聚合酶功能,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应机理：,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,3,5,DNA聚合酶3-5外切酶活力,切除引物、切除突变的片段,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,切除错配的核苷酸,DNA-pol I:曾被称为复制酶(replicase)含量最多可被水解成两个片段小片段(N端)：具有53外切酶活性；大片段(C端)：具有聚合活性和35 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。,DNA-pol III:由10种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,DNA聚合酶全酶的亚基组成,Arthur Kornberg 1918,Stanford University Stanford,CA,USA,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959,for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid,二、解旋酶（解超螺旋，也叫拓扑异构酶、DnaB蛋白）,拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。,DNA的超螺旋结构（原核）二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋,连环数（linking number,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（twisting number,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示超螺旋数（缠绕数,writhing number,W）,L=T+W,三、解链酶（DnaA蛋白）四、SSB五、引物酶六、DNA连接酶,解螺旋/链酶(helicase)（DnaA蛋白）:模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。,四、SSB,SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。,引物酶(primase):依赖DNA的RNA聚合酶。催化RNA引物的合成。在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3-OH末端。,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,第三节复制过程,一、复制起始二、链的延长（冈崎片段的合成）三、复制的终止,一、复制起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,起始复合物,前引发复合物,开链复合物,引发体(primosome):是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板DNA上。,二、链的延长（冈崎片段的合成）,真核生物的冈崎片段为：100-200bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:,引导链与随从链分别由哪些酶或蛋白参与？,三、复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,DNA忠实性的保障,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、复制中的即时校读功能。,真核细胞内有五种DNA聚合酶,真核和原核DNA细胞复制比较,真核细胞DNA复制的特点,多个起点复制,端粒酶（telomerase）,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,特点：1.由RNA和蛋白质构成的复合物2.为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA功能：合成端粒DNA，维持端粒的长度,爬行模型：,端粒合成的一种模型,整合和杂交,第四节DNA损伤及修复,四、诱导修复（SOS修复）,一、光修复,二、切除修复,三、重组修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,重组修复,SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,
