云大 发酵工程实验结果以及分析.ppt

生物技术专业系统实验,发酵工程实验,石秋晓（50%）田 爽（50%）,星期一 上午 第 三组,实验一 发酵工程实验总体介绍和安全知识,思考题 1.请设计从土壤中筛选谷氨酸产生菌的实验方案。要求：从培养基配方设计说明，初筛、复筛等操作步骤，产物检测确认方法，用到的实验器材等几方面设计实验。,答：在已报到的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，它们都有一些共同特点。革兰氏阳性，菌体为球形，短杆至棒状，不形成芽孢。没有鞭毛，不能运动。需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能产生谷氨酸。实验器材：铁铲，三角瓶，试管，吸管，培养皿，摇床，发酵罐，高压灭菌锅，牛皮纸袋，量筒，酒精灯，涂布器，接种针。选择培养基：琥珀酸钠2g，磷酸氢二钠1.6g，7水硫酸镁0.6g，脲5g，生物素30微克，硫酸铁和硫酸锰各2mg，水1.0L，pH7.07.2初筛培养基：葡萄糖 12%，玉米浆0.8%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.04%。pH7.0复筛培养基：葡萄糖18%，玉米浆0.5%，甘蔗糖蜜0.15%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.04%，pH7.0实验步骤：a.产谷氨酸菌为细菌，则采集田园土为好，做土壤浸出液，有限稀释并牛肉膏蛋白胨培养基平板涂布培养，依据菌落特征挑出产谷氨酸菌，斜面纯化培养（也可直接用选择培养基选择出产谷氨酸菌）b.初筛:上面纯化的菌株有多种，每株两瓶分三批进行初筛。放瓶后，测定谷氨酸含量。从中选出产量较高的6株左右，摇瓶培养。c.复筛：经初筛选出的6株，继续进行摇瓶复筛实验，发酵周期46h，以生产菌作为对照，共进行了3次对比试验，选出产谷氨酸最高的两株。d.发酵罐发酵，并检测产物。方法有：从发酵液中提取谷氨酸一般用等电点法，离子交换法，金属盐沉淀，盐酸盐法和电渗析法。菌体鉴别用革兰氏染色法（培养基同复筛）,实验二 柠檬酸产生菌的分离及筛选,1.察氏-加酸培养基上菌落生长情况,实验结果,2.察氏-多民培养基上菌落生长情况（产酸情况）,1.由实验结果1可知，黑曲霉在察氏-加酸培养基上生长快，且生长状况比青霉菌好太多，这两种菌均耐酸，但青霉菌耐酸能力明显比黑曲霉弱的多。2.由实验结果2可知：a.编号4是无污染中比值最大的，而所有培养基中比值最大的为编号1。但其未接种时培养基已被产酸菌污染，污染菌和接种菌来源不同，很可能不是同一菌种，因此应用编号4作为摇瓶初筛用菌株。其固体培养时产酸能力较强。b.青霉菌不产酸，但可以在察氏-多民培养基上缓慢生长，可能是对碳源的利用不好，或之前在很低PH下菌种受损。c.编号1的污染是倒培养基时，被空气中杂菌污染；编号5的污染可能是接种针较长，接种时弹落孢子。从而出现多个菌斑。d.在固体培养基中产酸能力与液态培养基中存在差异，在固体培养基上产酸能力强，在液体培养基中不一定强。,分析讨论,1.黑曲霉柠檬酸产生菌菌株富集应考虑利用哪些特征来进行富集？答：a.温度，培养温度应适宜其生长 b.培养条件适宜，C源的利用，对其他菌有筛选效果c.pH，因黑曲霉耐酸性很高，因此可以利用低pH的培养基，来排除杂菌污染，并纯化富集。d.利用固体点植在察氏-多民培养基上纯种筛选富集。2.观察记录在察氏-加酸培养基上菌落生长情况。答：见实验结果13.观察记录所挑选察氏-多民培养基平板上变色圈和菌落直径比值答：见实验结果2,思考题,实验三 柠檬酸产生菌的初筛及产物 定性、定量检测,实验结果1.摇瓶发酵实验现象,单位：cm,2.发酵产物定量测定结果（NaOH溶液滴定起始刻度均为0.00）3.柠檬酸的定性检测结果a.点样时 自 应点14下，2112应该点5下b.设溶质的最高浓度中心至原点中心距离为d，溶剂前沿至原点中心的距离为L图中编号“自”在本组实验中没有出现最高浓度斑，借鉴的其他组的,c.实际比例图,1.实验结果1中，有菌膜是因为药瓶培养时间过长造成的；菌粒为小球状则可能与摇瓶时流体作用有关，球状有较大的表体比，便于利用营养，其状态与固体培养基不同；编号“自”产生黑色孢子是因为摇瓶时一部分瓶壁处于时液时固状态，故能是黑曲霉产生孢子。2.实验结果2，滴定时应注意溶液颜色变色后深浅统一，本次实验中，同一样液消耗的氢氧化钠溶液差异稍大，可能是滴定时的误差，结果颜色深浅度不同。产酸量与开始时接种菌种有明显关系。3.实验结果3分析：点样次数是按与标准酸液算出的比例。此次求得 值比理论 值要大，尤其是苹果酸和柠檬酸，造成这一结果的原因可能是：展开剂配比不准确，使极性偏大，人为取样存在误差；环境温度也会对其造成影响，应控制温度在合适值，保持恒定；还有可能薄层厚度存在轻微差异，不均也会影响结果；样品的用量也会造成值得改变，样品太少，斑点不清楚，无法观察测量，量太多，出现斑点太大或拖尾，不易分开，并且两者均给测量带来一定困难，很容易出现误差。编号“自”未出现最高浓度中心及斑点，原因可能是样液太稀，点样次数不够，点样次数较多可能造成斑点直径过大，展开时，部分没入展开剂中，而溶于其中，造成样液流失，还有可能点样时刺破薄层，造成一定损失。,分析讨论,1、绘制层析图并计算各样品的Rf值，判断发酵液的产物。答：见实验结果3，发酵液产物Rf值和标准柠檬酸Rf值极接近，因此产物酸是柠檬酸，样液用量造成一定的偏差，且发酵液中物质也会影响结果。2、薄层板的制备应注意哪几点？答：CMC-Na配比合适，太稀硅胶易脱落，太稠难混匀；铺板的均匀，铺好后将玻璃板放在桌边小心颠动；薄板的活化，一定要铺好板干后，放到烘箱活化；薄层厚薄，决定应该点样的样液量。3、点样与展开的要求有哪些？答：点样要避免边缘效应；不要刺破薄层；点样时尽量点一次吹干之后再点，点样次数由样液浓度而定。展开：在密闭容器中尽量能控制温度。展开时间合适。4、用发酵液与标准样品点样、展开后的Rf值和理论Rf值有差异的原因？答：见实验分析3,思考题,1.因素水平设置表,实验四 第一次正交实验法优选最佳发酵条件,实验结果,2.第一次正交试验,3.因素个水平与指标的关系图,1.由实验结果2可知最佳组合A3B3C2D1，最优组合是A3B3C3D1，因素主次：硫酸铵麸皮淀粉接种量最佳组合与最优组合不完全相同。原因可能是实验只抽部分具有代表性的组合，而非所有组合进行；极差分析最优组合时，考虑某一因素时把其他因素对结果的影响看成均衡，忽略了互作效应，得到了某因素上产酸量最大的水平，而最佳组合是综合了各个因素后得到的所有因素上产酸量最大的各水平数。2.由因素各水平与指标的关系图可知，此次试验各因素的水平范围均不合适，因此改进方法是以最大产酸量对应的水平数为中值，确定水平范围。3.实验中培养基配方添加时一定要认真，因为因素和水平数较多，易混易错，从而造成结果的错误性，接种孢子液后一定要摇匀。,分析讨论,1、正交试验法的意义。答：利用正交表挑选出一部分具有代表性的试验，所以减少了实验的次数，另外用其进行整体设计，可以同时做一批实验以缩短实验周期，用该法通过极差分析，方差分析，还能告诉我们哪些因素是试验指标的主次因素，因素间交互作用有无及大小，分析出实验误差的大小。2、如何确定试验因素和水平数？答：根据实验的目的，确定实验要研究的因素，根据查阅资料或经验，这是首次正交实验，第二次及以后则可以在前面实验的基础上改善，改变因素和水平。3、影响柠檬酸产酸的因素有哪些？答：温度，pH，摇瓶条件，发酵时间，淀粉、硫酸铵、麸皮、接种量含量（碳源，氮源的类型和含量）等 4、根据实验结果，利用极差法来分析实验数据。答：见表2 5、最优组合与最佳组合为什么有时会不一致？答：见实验分析1,思考题,实验五 第二次正交试验法优选最佳发酵条件,实验结果：1.第二次正交实验表,因素水平设置表,2.图因素各水平与指标的关系图,实验分析,1.由表可知，最优组合A2B1C1D2，最佳组合A1B1C1D1，实验因素的主次因素麸皮淀粉硫酸铵=接种量，最优组合与最佳组合不完全相同，原因同实验四。实验主次因素与实验四不同，因为因素的水平范围变动会改变结果，结果改变，极差分析结果改变，因此主次因素改变。2.由试验四的正交表于此次实验正交表对照，此次试验产酸量明显提高。则四个因素水平范围越来越符合实验目的。产酸最大量提高了不多，应更换因素（2个次要因素）。3.由本次试验的正交表知，改进后有2个因素的水平与指标的关系图出现峰值，其范围差不多具体了，另两个随量增加而增加，范围还不确定。,思考题,1、第二次正交试验的最优组合与最佳组合。答：见实验分析1 2、比较2次正交试验的结果及收获。答：见实验分析1和2，分析两次因素水平与指标关系图知：由上表可知硫酸铵和接种量，第一，二次正交实验相符，而麸皮和淀粉则不相符，可能原因是发酵条件不完全相同，实验中认为误差造成至少又一次实验不准确3、如要进行第三次正交试验，你设置的因素和水平是什么？答：基于第一，二次正交实验，硫酸铵0.1%接种量0.8ml 温度33 摇瓶震荡120h（频率相同）,实验六 还原糖和淀粉含量测定,实验结果,数据记录,淀粉水解的测定,计算1.还原糖含量=C(V0-V)10-3(g)=0.143 2.淀粉含量(%)=C(V0V)5000.910-3 100WVS=45 C(V0V)/WVS=8.325,分析讨论,1.斐林试剂甲液和乙液应该分开储存，用的时候才混合，否则酒石酸钾铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低2.还原糖和斐林试剂反应一定要在沸腾条件下进行，沸腾时间需要严格控制，煮沸溶液应该保持蓝色，如果蓝色消失或者变黄变黑，说明还原糖含量过高应该重新做。3.加热时间过长，锥形瓶中水分蒸发，沸点增高，糖的氧化产物会发生裂解，产生新的具有还原性的羰基化合物，从而降低滴定液的消耗量，所以滴定必须在沸腾后的一分钟之内完成。,思考题,1.记录实验数据并计算待测糖液的还原糖浓度以及待测液的淀粉含量答：见实验结果2.斐林法定糖的测定原理答：斐林甲乙液混合后可以形成可溶性铜络合物，在碱性条件下，还原糖能很快把这种络合物中的铜还原成一价铜，生成氧化铜沉淀。当加入弱于铜离子的弱氧化剂次甲基蓝作为指示剂时，在滴定中铜离子完全氧化后，微过量的还原糖也能被次甲基蓝还原，使蓝色消失。3.在还原糖测定实验中，“4个1”指的是什么？答：以5秒一滴的速度滴定；滴定在一分钟之内完成；滴定消耗葡萄糖控制在1ml以内；每次滴定误差不超过0.1ml4.为什么要预先加入一定量的标准葡萄糖溶液？答：防止在沸腾后滴定过程中要再加入很多葡萄糖延缓了滴定时间。5.淀粉水解的几种方法答：酶解法：淀粉分子和水分子在酸性和一定温度、压力条件下反应，使淀,粉分子中的糖苷键加水分解成糖浆。酸酶结合法：淀粉分子在酸性和一定温度、压力条件下先水解使得淀粉初步转化，然后用淀粉酶转化，使淀粉和其他糖转化为葡萄糖。双酶法：运用酶液化和酶糖化的工艺,实验七 柠檬酸产生菌在 通风发酵罐中的发酵,实验结果,摇瓶发酵数据记录,柠檬酸发酵曲线图,分析讨论由实验结果可以看出产酸量是随着时间增加而增加的，柠檬酸不断地积累；但是由于测量过程中存在误差，故还原糖含量并不是一直递减，PH不停降低最后稳定在1.5,思考题1.记录实验数据并绘制柠檬酸的发酵曲线图答：见实验结果2.实验室如何完成发酵罐的接种操作？答：先灭菌，然后检查发酵罐的各项指数，移开接种附近的胶管，铁挡板围住接种口后用酒精喷壶朝接种口处喷酒精点着，将接种圈沾酒精点着后套住接种口处，将扳手或钳子上的火焰后迅速放入装95乙醇的搪瓷缸容器里；将接种瓶在火焰处拨开后迅速倒入发酵罐内，完毕后用钳子夹出螺帽拧上，整个过程确保无菌操作。,实验八 柠檬酸的提取,实验结果,1.两张干滤纸的重量=1.98g2.烧杯玻棒的重量=44.133.烧杯，玻棒，结晶以及母液的总重量=158.69g4.滤纸和结晶烘干之后的重量=53.76g5.结晶柠檬酸=51.78g母液中柠檬酸=37.176g提取率=79.42,分析讨论随着我国柠檬酸工业的发展，对落后的柠檬酸提取工艺进行改进，以高效、节能，低污染和便于自动化管理的新工艺取而代之，已成为当务之急，尽管本实验所提及的这些方法都有不足之处，并且许多处于实验室研究阶段，但是有些分离手段已显现出巨大的优越性和应用前景，有待进行深入研究，以便早日实现工业化生产。,思考题,1.计算提取率答：见实验结果2.分析实验室提取柠檬酸提取率低的原因答：操作步骤多，损耗也就多，总回收率低；碳酸钙量若控制不适宜，也会使柠檬酸提取率降低。,实验九 固定化酵母细胞发酵酒精实验,实验结果1.固定化酵母发酵液：100ml培养液+10ml固定酵母凝胶珠散落酵母发酵液：100ml培养液+10ml散落的酵母种子液2.两组发酵液合并在一起，蒸馏出100ml溶液测酒精度以及湿度,数据记录及结果计算,血球计数板进行显微镜计数,每克凝胶柱中的酵母数=2.04*1000000000 凝胶珠重量0.18g1ml菌液中的总菌数=3.68*100000000在40倍显微镜下观察凝胶珠，凝胶珠内细胞呈团状在10倍显微镜下，凝胶珠外侧比内侧细胞密度大,分析讨论固定化技术的意义：固定化计数就是将生物酶或细胞固定在一定的基质上。作为固定化生物催化剂而加以利用的一门技术。固定化增值细胞具有密度大，可增殖的特性，可以获得高密度而体积小的工程菌合体，不需要细胞的多次培养、扩大，使发酵周期缩短，生产能力提高，可以较长时间地反复使用，发酵稳定性好。固定化细胞的应用范围极广泛，目前已遍及工业，制药，化学分析，环境保护等多个领域。,思考题1.固定化的方法有哪几种？答：吸附法，共价结合法，交联法，包埋法2.固定化后的酵母为什么还要再培养？答：是为了使酵母细胞数量足够多，且由于酒精发酵是无氧条件下进行，而酵母的繁殖需要氧气，所以先让酵母细胞繁殖一定的数量后再进行无氧处理开始酒精发酵，否则酵母不足酒精发酵不理想3.凝胶珠在切片后，直接在显微镜下观察结果图，为什么凝胶珠表面和内部密度有较大差别?答：由于内外细胞与外界接触程度不同，外侧比内侧细胞密度大是由于外侧增值时接触氧气，养料多,实验十 酒类知识介绍及酒类品尝,实验结果,1.我国白酒香型分类1、酱香型白酒：以茅台酒、郎酒、武陵酒为代表。2、浓香型白酒：如以泸州特曲、五粮液、剑南春、全兴大曲、沱牌曲酒为代表的四川派，以洋河、双沟、古井、宋河粮液为代表的纯浓派。3、清香型白酒：以汾酒、黄鹤楼酒和宝丰酒为代表。4、米香型白酒：以桂林三花酒为代表。5、凤香型白酒：如西凤酒。6、董香型白酒：如贵州董酒。7、豉香型白酒：如广东玉冰烧酒。8、芝麻香型白酒：如山东景芝白干酒。9、特型白酒：以江西四特酒为代表。10、老白干香型白酒：河北衡水老白干酒为代表。11、小曲清香型白酒：云南玉林泉酒为代表。12、兼香型白酒：目前国内有两种类型（1）酱中带浓型，如湖北白云边酒。（2）浓中带酱型，如黑龙江的玉泉酒等。2.白酒品评的方法,思考题,评酒分明评和暗评。明评可以交换意见，互相讨论。但是重要的评酒，多采用暗评的方法，则要作到鸦雀无声，各自为政，各行其事，各施其分，不得询问所评酒的任何情况，也不能询问评酒结果。看评色泽：将酒杯举至与眼睛平行高度，对在适宜的光线下，用眼睛观察酒液的色泽、透明度、有无悬浮物或沉淀物。闻评香气：将酒杯置于鼻孔下方，尽量接近液面，每次均匀地吸入酒的香气，并反复进行34次，然后对酒的香气做出评定。先淡后浓，先优后劣。尝评口味：一般白酒和烈性酒一次摄入13毫升即可，其它的酒种412毫升。酒液要先接触味觉最灵敏的舌尖，进入舌头两侧，再至舌根，然后鼓动舌头打卷，使酒液铺展到舌的全部表面，全面对味进行体验和判断。反复品评34次后，对酒的口味做出全面评定。“甜在舌尖，酸在舌周边，苦在舌根，咸在舌尖侧面的边缘”。体（格）评酒体风格：感官对酒色、香、味的综合印象和综合感受，代表了酒在色、香、味的全面质量。,实验过程中，提高了实验技能。且对工程实验有了不少了解。感谢老师的辛苦指导。,收获和感想,