植物细胞工程.ppt

第一章 植物细胞全能性与形态发生,第二篇 植物细胞工程,第三章 植物组织和器官培养,第五章 原生质体培养,第四章 植物细胞培养与次生产物生产,第二章 离体培养下的遗传与变异,第六章 人工种子,第一章 植物细胞全能性与形态发生,1.1 细胞全能性及其表达,1.2 器官发生,1.3 体细胞胚胎发生,1.1 细胞全能性及其表达,1.1.1细胞全能性概述,简单地讲，一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。,植物细胞可分为三类：第一类是茎尖、根尖及形成层细胞，这类细胞始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期，为周期细胞。第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞，他们为永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。,第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞，这类细胞在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂，称为Go细胞 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。,1.1.2 培养条件下的细胞脱分化,培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation）。,细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化 脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。,根据脱分化过程的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为三个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。,细胞脱分化的调控机理 细胞周期调控 激素的作用 PSK的调控作用（促分裂肽）染色体变化（解凝聚）,细胞分裂与愈伤组织形成 脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。,1.1.3 细胞分化,所谓细胞分化（differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化；同一种细胞后代，由于所处的环境（如部位）不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的分化。,单细胞生物仅有时间上的分化，如噬菌体的溶菌型和溶原型。多细胞生物的细胞不但有时间上的分化，而且由于在同一个体上的各个细胞所处的位置不同，因而发生机能上的分工，于是又有空间上的分化，如一个植物个体在其顶端、根、茎、叶等不同部位具有不同的细胞。,细胞分化与基因组变化 染色体重复复制 DNA的差异扩增 基因重排,极性与细胞分化 所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。极性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。极性一旦建立，在一般情况下不可逆转。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。,TE细胞分化及其调控 作为维管系统的主要成分，管状分子（tracheary elements，TEs）在维管系统的形成中具有中心作用。在植物系统发育条件下，TEs由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。在离体培养条件下，TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成，这也是愈伤组织细胞分化器官的前提。,激素在细胞分化中的调控作用 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一定的调节作用。,1.2 器官发生,植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。,1.2.1 离体培养中器官发生的方式 通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：第一种方式是先芽后根 第二种方式为先根后芽 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。,1.2.2 器官分化过程,离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段。第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。第三阶段是器官原基及器官形成。,在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。,研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细胞。,1.2.3 起始材料对器官分化的影响,母体植株的遗传基础,外植体的类型 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不同的植物类型则有较大差异。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。1974年Tran Thanh Van等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。,激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。,1.2.4 激素对器官分化的调控,光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。,1.2.5 光照对器官分化的影响,离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。,1.3 体细胞胚胎发生,这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培养中器官发生形成个体的途径（崔凯荣和戴若兰，2000）。,1.3.1 体细胞胚的形成,体细胞胚从外植体上直接发生 在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：第一个阶段为诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进入分裂状态。第二个阶段是胚胎发育期。在这一阶段，形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等发育过程，最后形成体细胞胚。,经过愈伤组织的体细胞胚发生经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段：第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织；第二阶段是诱导愈伤组织胚性化；第三阶段是体细胞胚形成。,在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发生体细胞胚。因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键。进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚胎发育。,细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞胚胎形成的细胞学观察表明，其培养物中存在两种类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。,胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎的生产效率。,与器官发生形成个体的途径相比：体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有双极性（double polarity），二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离（physiological isolation）现象。由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再生植株，其遗传特性相对稳定。,1.3.2 体细胞胚的结构与发育特点,与合子胚相比：合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚，这一点更为明显。合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶。,与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。,（1）外源激素对体细胞胚胎发生的调控 2，4D是应用最为广泛的生长素。2，4D的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2，4D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细胞胚的继续发育。,1.3.3 影响体细胞胚发生的因素,（2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响 体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。球形胚形成后，如果降低培养基的无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。,（3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异 体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异。在已成功获得体细胞胚的植物中，以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多，且培养条件相对较为简单，如咖啡属植物、芸香科植物等。,即使是同类植物的不同基因型，在体细胞胚诱导的难易、形成时间以及单个外植体产生体细胞胚的数量上也存在明显差异。马铃薯18个不同基因型品种的体细胞胚形成能力的比较研究显示，以接种外植体与体细胞胚能否形成的资料统计，有7个品种的体细胞胚发生率为100，而频率最低则只有10。,（1）体细胞胚形成过程中内源生长素的变化 体细胞胚胎发育研究表明，外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。,1.3.4 体细胞胚胎发生的生化与分子基础,体细胞胚胎发生中，外源生长素的使用模式或者说规律，在大多数植物中是相似的，如诱导胚性细胞产生，或诱导愈伤组织转化为胚性愈伤组织，均需要高浓度的生长素。当球形胚形成后，则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育。研究显示，生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的。,（2）体细胞胚发生过程中的特异蛋白质 有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不同研究在绝对含量上不尽相同，但总体趋势均表现出，体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。,（3）体细胞胚形成的基因表达调控 通过基因表达的差异显示和胚胎发育突变体等技术，已分离出几十个与体细胞胚发育相关的基因。除了一些典型的激素调控基因外，还有其它类型的基因。,第二章 离体培养下的遗传与变异,细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。从理论上来说，无论是细胞还是组织培养，再生的个体均承传了母体的遗传基础，这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基础。,由于培育过程的影响，离体培养的细胞、愈伤组织以及再生植株均普遍存在着变异。由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的受精，因此，Larkin和Scowcroft（1981）提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。就对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身包含了双重性：遗传的稳定性和变异性。,2.1 离体培养中的遗传与变异特点,2.2 体细胞变异的细胞遗传学基础,2.3 体细胞变异的分子遗传学基础,2.4 体细胞无性系变异的诱导与选择,离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。,2.1.1 离体培养中的遗传稳定性,2.1 离体培养中的遗传与变异特点,在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是，即使发生某些变异，也可以即时淘汰变异。,普遍性：变异可发生在各种培养类型中；变异发生在各种植物的培养中；变异发生与培养方式有关。,2.1.2 离体培养条件下遗传变异的特点,局限性：从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。嵌合性：嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。,2.1.3 影响体细胞遗传与变异的因素,A 供体植物供体植物倍性水平；基因型；外植体细胞分化程度,B 培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。,C 继代培养的次数 一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。,2.2 体细胞变异的细胞遗传学基础,DNA在核内重复复制（endoreduplication）但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。,2.2.1 DNA核内重复复制,2.2.2 染色体断裂与重组,染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象。染色体结构变异的细胞学特征是，分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。,离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。,2.2.3 非正常有丝分裂,2.3 体细胞变异的分子遗传学基础,碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。如果改变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置，就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传，而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实（张春义和杨汉民，1994）。,2.3.1 碱基突变,在许多植物中均观察到，DNA分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。Lapitan等（1988）以生物素标记的480 bp重复序列DNA片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代7R染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了扩增，而且这种扩增可以遗传至少三代。,2.3.2 DNA序列的选择性扩增与丢失,在许多植物种类中还观察到，在组织培养过程中，以及经组织培养再生的植株，甚至在这些植株的后代中，有时也会发生DNA序列丢失的现象。现有资料显示，DNA序列丢失多发生在rDNA及其间隔序列，某些重复序列DNA区域也易发生丢失。研究还发现，DNA的减少不仅发生在核DNA中，也有发生在叶绿体基因组中。一些DNA序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，植株再生过程中又恢复到正常状态，目前还不清楚这种变化的生物学意义。,转座子（transposon）首先是由McClintock在玉米中发现的，现已证实它是引起许多遗传不稳定现象的重要原因。上个世纪80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。,2.3.3 转座子活化,我国学者朱至清（1991）认为，也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座，从而造成染色体的结构变异。目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限，但许多学者认为，用转座子解释体细胞变异有许多合理性，如变异频率高、沉默基因活化等。因此，有关转座子在体细胞无性系变异中的作用，也是将来体细胞遗传变异研究的热点。,2.3.4 DNA甲基化,DNA甲基化（methylation）在基因表达调控中具有重要作用。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶转变为5甲基胞嘧啶。,离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生超甲基化，而另一些再生植株却只在与G相邻的C上发生甲基化，而且这种甲基化在基因组中的分布是不均匀的。,胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因DNA甲基化改变而产生的体细胞变异（刁现民和孙敬三，1994）。除了DNA甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异还来自于DNA甲基化程度的降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异。（Rival，1997）。,2.4 体细胞无性系变异的诱导与选择,离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点：（1）由于筛选可以在离体条件下进行，从而可以在小空间内对大量个体进行选择。（2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制，因此筛选效率高。,（3）因为试验是在人工设计的培养条件下进行的，因此诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。（4）由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体，因而可以省去变异分离的麻烦。（5）在细胞培养系统中，理化诱变剂可较均匀地接触细胞，因此可以引起培养细胞相对较高频率地发生突变，增加了选择机会。,选择起始材料需根据试验目标确定，一般需考虑以下几方面的问题：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。,2.4.1 体细胞变异诱导材料的选择,其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。,离体培养的植物细胞会出现较高频率的自发变异，离体培养中体细胞自发突变所产生的变异往往比较稳定，没有人工诱变的后续干扰，有利于分离和选择。育种家们应用自发突变的这些优点，已选育出一些新品种，如美国RNA植物技术公司已从番茄体细胞无性系变异中选育出新品种，台湾的育种家也从甘蔗体细胞无性系再生植株变异中选育出新品种。,2.4.2 培养细胞的自发变异,2.4.3 培养细胞的诱变,A 物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场以及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括X射线、射线、快中子、紫外线等。,B 化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有：烷化剂（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷EO，乙烯亚胺 EI等），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变；,碱基类似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物，2氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配；移码诱变剂，如ICR化合物和吖啶类似物等；其它如亚硝酸、羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。,C 复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理，亦可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。D 转座子插入诱变 转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。,目前，使用较多的转座子体系主要是玉米的Ac/Ds系统，其主要操作过程是，首先采用基因转化的方法将Ac/Ds导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使Ac因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除Ac的植株中筛选出不同变异。利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。,A 直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。,2.4.4 体细胞突变体的筛选,最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。,B 间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。如脯氨酸（Pro）作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生物学意义。植物在非生物胁迫如干旱、低温等条件下，体内Pro常常有不同程度的升高，而且耐干旱和耐寒植物的体内Pro往往较高。,抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。由于在离体培养中直接接种病原物会严重障碍细胞生长，因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。赤霉病是小麦最严重的真菌性病害之一，同时由赤霉菌产生的赤霉菌毒素（DON）不仅影响小麦正常生长，还可残留在籽粒中，严重时可造成人畜中毒。,A 创造育种中间材料或直接筛选新品种 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。在全世界50多个国家中，已培育出1000多个由直接突变获得的或由这些突变体杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性和抗逆性等。,2.4.5 体细胞变异的利用,B 遗传研究 突变体作为基因克隆和标记筛选具有独特的优点。因为突变一旦发生，即可在表现型上与供体显著不同，通过差异显示或分子杂交筛选，即可快速获得突变位点的DNA序列，经过测序与功能鉴定，就可能获得与突变性状相关的基因。即使通过分析不能获得功能基因，这些DNA序列也可作为与突变性状相关的分子标记，用于相关遗传研究。,突变体用于基因克隆和功能鉴定早已成为模式植物如拟南芥等的常规方法，近年来也已开始广泛用于其它作物中。特别是与转座子标签插入突变技术相结合，更显现出这一途径的高效性。目前，利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢酶基因ADH，赤霉素合成相关基因GA1、GA4，生长素敏感性基因AUX1、AUX2、番茄抗病基因Df9等。,C 发育生物学研究 植物的个体发育是一个渐进过程，每一个器官和组织的分化都是一个复杂的调控过程。利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究取得了突破性进展。特别是利用拟南芥和金鱼草等模式植物，已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，包括顶端分生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突变体的研究，不仅建立了器官发育模式，而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，包括维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因，以及相关修饰基因（许智宏和刘春明，1998）。,D 生化代谢途径研究 生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因此，突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分便利和高效的优势。,体细胞突变技术的不断成熟，使多细胞生物大群体突变的建立成为可能。我们可以根据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体，也可以根据需要与基因工程相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行，因此而发展起来的新型学科领域称之为代谢工程。,植物突变体用于代谢研究，早期最经典的例子是通过烟草突变体对硝酸还原酶的研究。硝酸还原酶缺失突变体有两种类型：cnx和nia。两种突变体具有同一表现型，即在以硝态氮为唯一氮源的培养基上不能生存。但将这两种突变体的原生质体融合后，融合细胞即可在只有硝态氮源的培养基上生长。由此说明，两种突变体存在独立的基因位点，而不同位点的基因又可能通过不同的途径控制硝酸还原酶的活性。研究显示。cnx和nia突变体分别通过影响钼因子和酶蛋白来影响硝酸还原酶的活性。近年来，通过体细胞突变研究激素、次生代谢产物等代谢途径的研究已有许多报道。,离体培养中遗传的稳定性是相对的，而体细胞变异发生是普遍的，但变异的程度可以通过培养类型和条件进行控制，从而使我们能够更好地应用离体培养技术。选用适当的外植体和培养方式，减少体细胞变异发生，使培养群体维持遗传稳定，可以充分利用离体培养的快速繁殖优势繁殖健康种苗。将离体培养技术与诱变技术相结合，可以提高变异频率，增加变异选择的基础材料，丰富遗传资源。特别是随着诱变途径的不断完善和分子生物学技术的应用，必将使体细胞变异的研究和应用潜力得以更充分的发挥。,第三章 植物组织和器官培养,3.1 植物脱毒及快速繁殖技术,3.2 花药及花粉培养,3.3 植物胚胎培养,意义：能够有效地保持优良品种的特性；生产无毒种苗，防止品种退化；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；节约耕地，提高农产品的商品率；便于运输。,3.1 植物脱毒及快速繁殖技术,3.1.1 概念与意义,植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞 中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。,目前受病毒危害严重影响生产的有：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等,块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如：大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。马铃薯：留种量占产量的十分之一。贝 母：留种量占产量的三分之一。,A 基本原理 理论假说(1)能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。,3.1.2 植物的脱毒技术,(2)传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。(3)激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。,(4)酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。(5)抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。,茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径(1)、药物防治病毒病效率低，(2)、抗病毒育种步履艰难(3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染,*母体植株的选择和预处理母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。预处理：,B 植物脱毒的技术规程,香石竹在3840条件下经两个月处理可除去全部病毒。菊花在3538的条件下处理60天可使病毒失活。马铃薯在37条件下处理1020天能除去卷叶病毒。柑橘速衰病毒、黄化病毒需在40/30条件下处理7-12周。鳞皮病毒需要在40/30条件下处理8周。啐叶病毒需要在50条件下处理322小时。亚洲青果病毒在50条件下处理3040分钟。,*茎尖分生组织培养再生植株茎尖分生组织培养有两个概念：shoot tipshoot apex；apical meristemapical dome.,*脱毒效果检测 指示植物鉴定(test plants)所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。血清鉴定(serologic test)试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。,*脱毒苗的保存与繁殖 脱毒苗的离体保存与繁殖 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系 木本植物建立隔离的脱毒苗母本园,*母体材料病毒侵染的程度*起始培养的茎尖大小,*外植体的生理状态,C 影响脱毒效果的因素,A 离体繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增殖:腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖;愈伤组织增殖 生根培养 生产用苗的培植,3.1.3 离体无性繁殖(propagation in vitro),B 离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。,C 离体繁殖的有关问题：外源生长调节剂对品种典型性的影响 继代次数与变异 增殖方式的合理选择,3.2 花药及花粉培养,3.2.1 概念及意义 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。,花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。,油菜成熟花药的结构,花粉囊,花粉囊壁,成熟花粉粒,花药裂口,单倍体植物的特点 所谓单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。,单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。,单倍体的应用潜力 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限,获得育种中间材料与诱变育种相结合可以提高诱变频率与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义作为遗传工程受体更为有效用作基础遗传研究的各个领域,3.2.2 花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有250多种植物花药培养成功。目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。,花药培养的基本程序是：外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,A 外植体的选择：供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态 花粉的发育时期 四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉 最适期,Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察：,花药发生、花粉的发育及形成过程,花药,药隔及维管束,幼花粉囊,原表皮,孢原细胞,平周分裂,初生壁细胞,平周分裂,药室内壁中层绒毡层,纤维层(花药开裂),(最后消失),(提供养料,最后消失),花粉囊壁,造孢细胞,有丝分裂,花粉母细胞,减数分裂,四分体,小孢子,营养细胞,生殖细胞,有丝分裂,精细胞精细胞,表皮,成熟花粉(雄配子体),3细胞花粉 2细胞花粉,营养细胞,B 花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。,低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。,C 培养基及培养条件培养基 花药培养常用的基本培养基：MS Nitsch N6 B5,附加成分：蔗糖；激素。,生长素类：NAA naphthalene acetic acid IAA indole-3-acetic acid 2,4-D,花药培养常用的激素有：细胞分裂素类：BA 6-benzyladenine KT kinetin Zeatin,高秀云等对茄子的研究表明：MS2,4-D0.5mgl-1KT 1mgl-1 n 93.8%2n 6.2%MS2,4-D 2mgl-1 KT 1mgl-1 n 64,1%2n 35.9%高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，从而增加了二倍体细胞发育的机会。,1974年日本：花药培养可以脱除 草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L（增殖分化培养基）1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L（生根培养基）,培养条件温度和光照温度：不同植物对温度的要求不同，如：柑橘在20C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到2125C时便会有胚状体形成，而当温度提高到26 以上时又完全不能形成胚状体。油菜若将接种后的花药在30 条件下培养23天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33C条件下培养35天，可提高成愈率和绿苗率。光照：先弱后强,D 花药培养中单倍体形成的途径 花药的结构：花药壁(2n)、药隔(2n)、花粉粒(n),培养初期花粉发育的途径 根据Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可以把早期的花粉发育分为三类：(1)、单核正常分裂成一个生殖核、一个营养核。以后或一个生殖核发育，或一个营养核发育，或二者均等发育。(2)、单核均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。(3)、异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到4核花粉发育成胚状体；Nemec在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂3次，形成类似8核胚囊的现象，称为花粉胚囊。,通过胚状体形成单倍体植株,单倍体植株形成途径,通过愈伤组织形成植株,3.2.3 花粉及小孢子培养A 取材时期的确定四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期B 花粉或小孢子的分离,小 孢 子,花 粉 粒,花粉培养,花药培养,C 培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 双层培养,双层培养,在35mm*10mm的小培养皿中铺加一层（1ml）琼脂培养基，固化后，在其表面再加入0.5ml的液体培养基。优点在于：花药在培养的早期可以从活性高的液体培养基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没，可以在通气良好的条件下分化成植株。,3.2.4 单倍体植株的鉴定与二倍化 A 鉴定方法：形态学鉴定 染色体分析 B 单倍体植株的二倍化：继代加倍 创伤法加倍 秋水仙素