动物细胞培养和核移植技术课件.ppt

二动物细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,生产单克隆抗体,动物细胞核移植,动物细胞工程常用技术,强调 其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,(一）动物细胞培养,思考回答下列问题：,（1）动物细胞培养液成分？,（2）动物细胞培养过程？,（3）原代培养与传代培养、细胞株与细胞系的区别？,（4）动物细胞培养的应用？,阅读4447页第一段（与植物组织培养对比）,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（取材）,细胞悬液,10代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,（分解细胞间的蛋白质）,1 过程：,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,贴壁生长接触抑制,动物细胞培养不能最终培养成生物体,.动物细胞生长特性：,细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,2.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,有关概念:,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,细胞株和细胞系的区别：,遗传物质,培养代数,细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,原代培养与传代培养的区别,原代培养：传代培养：,分装之前，10代以前,分装后继续培养，10代以后,3.动物细胞培养条件：,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素 定期更换培养液培养液和培养器具无菌处理2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和PH 36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）,补充合成培养基中缺乏的物质保证细胞顺利的生长增殖,培养基的不同是动物细胞培养和植物组织培养最重要的区别,与植物培养基相比其特点?,液体培养基 含有动物血清,动物细胞培养,植物组织培养,植物细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体或组织,快速繁殖、培育无病毒植株等,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,液体培养基,固体培养基,细胞增殖,培养结果,培养目的,培养基特有成分,培养基性质,原理,4、应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）作为基因工程中的受体细胞培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,巩固,1、植物组织培养过程要将组织分散成单个细胞吗？,2、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞吗？,3、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,4、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？,5、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？,没有,是,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖,先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成份是蛋白质,、细胞膜的主要化学成份是什么？,、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？,、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？,、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛,11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？,12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？,13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,易于培养细胞贴壁，进行生长增殖,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。,将贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的过程叫做传代培养,14、如何理解原代培养和传代培养？,上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养,（二）动物细胞融合与单克隆抗体,请同学们阅读课本P52动物细胞融合内容并结合图223问题：什么是动物细胞融合？它相当于植物体细胞杂交过程的哪一步？它们的过程、基本原理、诱导融合方法和意义是否相同？,动物细胞融合（细胞杂交）,1、概念：,指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,2、结果：,形成单核的杂交细胞,3、原理：,细胞膜的流动性,4、诱导方式,物理法：离心、振动、电激,化学法：聚乙二醇（PEG),生物法：灭活的病毒,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,5、过程：,动物细胞A动物细胞B,诱导，融合,2个完整的杂交细胞AB,有丝分裂,（膜融合、质融合）,（核融合）,细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核,与植物原生质体融合原理相同，方法类似。,思考,1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？,植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。,诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。,6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,最有价值的应用,制备单克隆抗体,问题：抗体由什么细胞产生？其化学本质是什么？与抗原作用的特点？主要分布在哪里？,单克隆抗体的概念,抗体的传统生产方法,从血清中分离抗体,该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。,多种效应B细胞,动物体内,多种抗体,抗原,1 传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？,（）B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生特异性抗体。()动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体,每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。()但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。()在体外，一个淋巴细胞是不可能无限增殖的。,产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。,2 分析：,B淋巴细胞与抗体的关系,3、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念,用单个B细胞进行无性繁殖（克隆），得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高,提示1：对B细胞进行细胞培养可行吗？,提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,提示3：从诱变育种、基因工程、细胞工程等角度有哪些可能的设计思路？,问题：如何大量生产单克隆抗体？,单克隆抗体的制备,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖,杂种细胞,动物细胞培养技术,设计方案：,动物细胞融合,创始人：米尔斯坦,单克隆抗体,既能产生特异性抗体，又能大量繁殖,免疫小鼠,培养骨髓瘤细胞,融合,骨髓瘤细胞,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,选择培养基上培养,专一抗体检验阳性,专一抗体检验阳性,注射到小鼠体内,体外培养,单克隆抗体,克隆杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,多种杂交细胞,杂交瘤细胞有何特点？,本过程利用的那些技术？,动物细胞融合技术动物细胞培养技术,是否注射抗原,（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？几种融合细胞？,两次筛选的目的分别是什么？,1、单克隆抗体制备过程,与传统制备的抗体相比具有什么特点？,.单克隆抗体的应用：,作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质并特异性结合 优点：准确、高效、简易、快速,用于,运载药物：制成“生物导弹”“生物导弹”单克隆抗体药物,治疗疾病：主要用于癌症治疗,。,两个过程,动物细胞融合过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法,一个新细胞,一个优势,小结,你记住了吗？,灭活的病毒,杂交瘤细胞(特点？）,单克隆抗体（特点？）特异性强、灵敏度高的优势,如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,（只考虑两两融合）培养液中细胞有几种类型？融合细胞几种类型？,骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞B淋巴细胞-B淋巴细胞B淋巴细胞-骨髓瘤细胞,多种杂交细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,1、单克隆抗体的制备过程,第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。,第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能产生专一抗体又能无限增殖。,杂交瘤细胞有何特点？,特异性强，灵敏度高,?-,8、植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,获得杂种植株,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性细胞的全能性,去除细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）,物理、化学方法（同左）灭活的病毒,既然动物体细胞核仍具有全能性，为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？,想一想,利用动物体细胞核移植技术,动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。,怎样才能使动物体细胞表现出全能呢？,动物体细胞核移植的过程,黑面绵羊去核卵母细胞,白面绵羊乳腺细胞核,重组细胞,动物细胞培养（或早期胚胎培养）,早期胚胎,胚胎移植,另一头绵羊的子宫,妊娠、出生,克隆羊多利,细胞核移植,（三）.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）,2分类,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度高，恢复全能性不容易,1 动物细胞核移植 概念：,克隆动物概念：,用核移植方法得到的动物,3、克隆过程运用的技术手段？,动物体细胞核移植、动物细胞培养和胚胎移植,4、多利的大部分性状与谁一样？,白面绵羊,（5、）结论？,高度分化的体细胞核具有全能性,5 克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种 3.作为异种移植的供体4.保护濒危动物,6 体细胞核移植技术存在的问题,1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。2.成功率非常低3、克隆动物食品的安全性问题。,（6.）在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,（7.）用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,1.动物细胞培养要经过脱分化吗？为什么？2.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,课堂反馈,克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,归纳:1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,核移植过程,动物细胞培养发展历史,20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,补充：,