第10章食品安全检测技术课件.ppt

第十章,食品安全检测技术,第一节 食品安全检测技术概论,食品安全检测技术主要包括如下几个方面的内容:光谱分析技术;电子传感器技术;生物传感技术;生物芯片检测技术;免疫学检测技术;聚合酶链检测技术(PCR技术)。,一、色谱分析技术,色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一。作为一种物理化学分离、分析方法，色谱技术最初仅仅是作为一种分离手段。到20世纪50年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为在环境、生化、药物、精细化工产品及食品污染物分析等领域中广泛应用的物质分离和分析的一种重要手段。,色谱法有多种类型，可分为以下几种：,(1)按流动相的物态可分为气相色谱法(流动相为气体)和液相色谱法(流动相为液体)。(2)按固定相的物态可分为气固色谱法(固定相为固体吸附剂)、气液色谱法(固定相为涂在固相载体上或毛细管壁上的液体)、液固色谱法和液液色谱法。(3)按固定相的使用形式可分为柱色谱法(固定相装在色谱柱中)、纸色谱(固定相为滤纸和薄层色谱法(固定相为吸附粉末制成的薄层)。(4)按分离过程的机制可分为吸附色谱法(利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异进行分离)、分配色谱法(利用不同组分在两相中有不同的分配系数来进行分离)、离子交换色谱法(利用离子交换原理)和排阻色谱法(利用多孔性物质对不同大小的排阻作用)等。,二、气相色谱法（GC）,气相色谱（gas chromatography 简称GC）是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成就。气相色谱是采用气体作为流动相的一种色谱法。在此方法中，载气(不与被测物作用，用来载送试样的惰性气体，如氢气、氮气等)承载着待分离或检测的试样通过色谱柱中的固定相，使试样中各组分分离，然后分别检测。具有分离效能高、灵敏度高、分析速度快、应用范围广等重要特点。,安捷伦气相色谱仪6890N,气相色谱的组成和工作流程,气相色谱法用于食品添加剂的检测 气相色谱用于食品中致病菌的检测,三、高效液相色谱法,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是指流动相为液体的色谱技术，也叫高压液相色谱。它是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，具有高压、高速、高效和高灵敏度的特点。可用于高沸点、热稳定性好、相对分子量较大(大于400以上)的有机物的分离和检测。,高效液相色谱的组成和工作流程,氨基甲酸脂类农药是一类应用范围广、药效高、对哺乳 动物毒性较有机磷低的农药，由于这类农药多数为热不稳定，因此不适合采用气相色谱测定。有机磷农药中大多数化合物的吸收都在远紫外，故用气相色谱分析比较方便。但该类农药中有些农药性质不很稳定，故可使用高效液相色谱技术进行分析。高效液相色谱可用于食品中兽药残留检测。,计算机技术对食品安全检测技术产生的影响体现,1.计算机技术提高了食品安全检测系统的数据处理能力2.计算机促进食品安全检测技术自动化程度的提高 3.计算机使食品安全检测更趋智能化,第二节 气相色谱-质谱联用检测技术,一、GC-MS系统的组成,计算机系统交互式地控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理，是GC-MS的中央控制单元。,二、GC-MS联用中主要的技术问题,1.仪器接口 气相色谱仪的入口端压力高于大气压，在高于大气压力的状态下，样品混合物的气态分子在载气的带动下，因在流动相和固定相上的分配系数不同而产生的各组分在色谱柱内的流速不同，使各组分分离，最后和载气一起流出色谱柱。,质谱仪中的样品气态分子在具有一定真空度的离子源中转化为样品气态离子。这些离子在高真空的条件下进入质量分析器运动。在质量扫描部件的作用下，检测器记录这些离子流强度及其随时间的变化。,仪器接口,接口技术中要解决的问题是气相色谱仪的大气压的工作条件和质谱仪的真空工作条件的连接和匹配。接口要把气相色谱柱流出物中的载气尽可能多地除去，保留或浓缩待测物，协调色谱仪和质谱仪的工作流量。,2.扫描速度 没有与色谱仪连接的质谱仪一般对扫描速度要求不高。和气相色谱仪连接的质谱仪，由于气相色谱峰很窄，有的仅几秒时间。一个完整的色谱峰通常需要至少6个以上数据点。这样就要求质谱仪有较高的扫描速度，才能在很短的时间内完成多次全质量范围的质量扫描。另一方面，要求质谱仪能很快地在不同的质量数之间来回切换，以满足选择离子检测的需要。,三、GC-MS联用仪和气相色谱仪的主要区别,GC-MS联用后，气相色谱仪部分的气路系统和质谱仪的真空系统几乎不变，仅增加了接口的气路和接口真空系统。气质联用法和气相色谱法一些性能和操作上的区别：GC-MS方法定性参数增加，定性远比GC方法可靠。GC-MS方法灵敏度却远高于GC方法。采用气质联用中的提取离子色谱、选择离子检测等技术可降低化学噪声的影响气质联用仪的定量精度优于气相色谱仪。气质联用中检测器不需要经常清洗，最常需要清洗的是离子源或离子盒。,四、GC-MS联用仪器的分类,GC-MS仪器的分类：按照质谱技术：GC-MS通常是指四极杆质谱或磁质谱，GC-ITMS通常是指气相色谱-离子阱质谱，GC-TOFMS是指气相色谱-飞行时间质谱等。按照质谱仪的分辨率：可以分为高分辨(通常分辨率高于5000)、中分辨(通常分辨率在1000-5000之间)、低分辨(通常分辨率低于1000)气质联用仪。,GC-MS在食品污染物检测中的应用,1.GC-MS用于食品中农药残留的检测2.GC-MS用于食品中兽药残留的检测 3.GC-MS在食品添加剂检测 4.GC-MS在食品中环境污染物检测,第三节 液相色谱-质谱联用(LC-MS)及接口,色谱与质谱(MS)的联用集高效分离、多组分同时定性和定量为一体，是分析混合物最为有效的工具。但由于许多有机化合物的高极性、热不稳定性、高分子量和低挥发度等原因，它们其中的90%以上需要用液相色谱(LC)分离，因此，LC和MS的联用在有机混合物分析中具有明显的优越性。,液相色谱-质谱(LC-MS)联用接口,自开始研究LC-MS以来，前后至少提出过27种以上的接口技术，但能够商品化并被广泛或在一定程度上使用的只有如下几种。,1.移动带技术 2.直接液体导人接口 3.热喷雾接口 4.粒子束接口 5.快原子轰击 因此，对于一个现代化并从事多方面分析的实验室，需要具备几种LC-MS接口技术，以适应LC分离化合物的多样性。,LC-MS在食品污染物检测中的应用,LC-MS在食品中农药残留检测 LC-MS在食品中兽药残留检测 LC-MS在食品添加剂检测,第三节 生物芯片检测技术,生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列。然后与己标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描或电荷耦联摄影机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。,一、生物芯片分析步骤,二、生物芯片在微生物检测中的应用,采用基因芯片技术建立的水中常见致病菌的检测与鉴定方法:致病菌污染饮用水可导致多种疾病的暴发与流行，严重威胁着人类的健康。传统的细菌培养方法及生化鉴定，操作繁琐，且需要数天才能得到结果。常规PCR一次只能检出一种致病菌，对水中分离的未知菌，或有多种细菌污染的样品则显得无从下手。利用在细菌学分类上具有重要意义的16SrRNA基因作为检测的靶分子，并在其间设计检测探针，建立一套水中致病菌的基因芯片快速检测技术(4h)。（可以定性和半定量地检出致病菌。用这种芯片可以特异地检出水中副溶血弧菌、李斯特菌、耶尔森菌、变形杆菌及铜绿假单胞菌等）。,基因芯片与传统方法相比其先进性,基因芯片可以对水中致病菌实现高通量、并行检测，一次实验即可得出全部结果;操作简便、快速，整个检测4h基本可以得到结果，而传统的方法(包括仪器分析)一般需要4-7天;特异性强、敏感性高，可以检测水中常见的致病菌。,三、基因芯片检测致病菌的特点,基因芯片可以实现对样品的高通量检测：（可以同时对成千上万个样品进行检测与分析）芯片技术可以对大量样品进行“并行”检测。在基因芯片分析中可以采用荧光对样品进行标记。反应体积小，降低了试剂的消耗。反应物在单位体积内浓度高，反应快，缩短检测时间。特异性较强基因芯片检测的特异性与传统的PCR结合探针杂交检测的特异性一致。基因芯片可以完全实现自动化及快速检测。,四、基因芯片技术检测致病微生物存在的问题,1.基因序列信息缺乏2.基因及基因芯片技术专利的限制 3.相关技术亟须改进与提高 4.检测费用过高 基因芯片技术是一项多学科交叉、基础研究与应用开发研究密切结合的技术，必须依靠各相关学科科学家的鼎力合作才能取得突破。基因芯片技术本身面临许多问题需要解决。,五、基因芯片技术的发展前景,基因芯片技术一经出现就受到各领域的高度重视，并迅速在生命科学领域、医药卫生领域，尤其是食品安全领域得到快速发展。沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157等致病菌已成为危害食品安全及消费者健康的主要病原菌。快速而准确地检测这些致病菌是确保食品安全的首要任务，而基因芯片技术则为快速检测这些致病菌提供了广阔的应用前景 目前，以生物芯片技术为核心的相关产业在全球迅速崛起，国际上已有数百家公司在做相关研究与开发。,基因芯片从实验室走向工业化,POTOMAC,渗滤式蛋白芯片的设计,将应用物品先准备好。,检测实例,在晶片盒視窗內滴加3滴試劑A，必要時用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。,待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢样品100l。,待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。,待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。,反應完畢後0.5小時內，將晶片放入晶片閱讀系統進行閱讀分析。,大淵的PBT-X2-02型生物芯片識別儀器組成。,第五节 生物传感器检测技术,生物传感器的基本原理,生物传感器是由固定化的具有分子识别功能的生物材料、换能器和信号处理放大装置组成的分析工具或系统。,生物传感器的结构一般有两个主要组成部分:其一是生物分子识别元件(感受器)，是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等);其二是信号转换器(换能器)，主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管等。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目,换能器（Transducer）,感受器（Receptor）,测量信号（Measurable Signal）,=分析物（Analyte）,溶液（Solution）,选择性膜（Thin selective membrane）,识别元件（RECOGNITION）,生物传感器工作机理,生物传感器按生物分子识别元件敏感物质分类,一、生物传感器的分类,(1)根据传感器输出信号的产生方式可分为生物亲和型传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器。(2)根据生物传感器中生物分子识别元件的敏感性物质可分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、基因传感器、免疫传感器等。(3)依据生物传感器的信号转换器可分为电化学生物传感器、半导体生物 传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等。,生物传感器在食品污染物检测中的应用,1.农药和抗生素残留分析检测(1)农药残留的生物传感器检测 目前，有机磷农药中的马拉松、甲基马拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲醋类农药中的滴灭威、西维因、灭虫多和残杀威等农药在食品中残留量的生物传感器检测都有相应的研究报道。(2)抗生素残留分析 2.生物传感器在食品添加剂检测3.生物传感器在食品微生物污染检测 食品中常见沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气英膜梭菌和蜡样芽抱杆菌等目前都可用光纤生物传感器、免疫生物传感器和DNA生物传感器进行检测。4.生物传感器在食品生物毒素污染检测 细菌和真菌毒素的检测,三、生物传感器的发展趋势,1.开发新材料2.采用新工艺 3.研究多功能集成传感器 4.研究智能型传感器 5.研究仿生传感器 由于生物传感器具有方便、快捷、选择性高、可用于复杂体系等突出的优越性，它在分析仪器市场中所占的份额越来越大，并已开始大量取代相同领域内的其他分析仪器。,快速葡萄糖(glucose)分析仪,生物传感器应用举例,德国研发的环境废水BOD分析仪,一种血糖乳酸自动分析仪,第六节 酶联免疫(ELISA)吸附测定,免疫酶技术(ELISA)是将抗原一抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原连接，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应做抗原一抗体的定性和定量。目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附测定(ELISA)，它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原、抗体反应均在载体表面进行，从而简化了分离步骤，提高了灵敏度，既可检测抗原，也可检测抗体。,一、酶联免疫吸附测定原理,以间接法测定抗体为例简要说明其原理:利用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附剂，吸附抗原，使之固定化，此过程称之为包被。之后加待测抗体，再加相应的酶标记抗抗体进行两次抗原-抗体的特异性免疫反应，生成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。最后加入酶的底物，进行酶促反应，生成有色产物，待测抗体的量与有色产物的颜色成正比，用特定波长测定产物的光吸收值即可得到待测抗体的量。,DNM-9602G酶标分析仪,DNM-9602 标配酶标分析仪,DNM-9602A酶标分析仪,几种酶标分析仪,二、酶免疫测定法的特点,酶免疫测定法是利用抗原一抗体的免疫学反应的实验技术，具有高度特异性，要求参加反应的抗原和抗体纯度高，消除非特异性反应和假阳性反应，避免交叉反应，去除内源性酶活性等。酶免疫测定法是利用抗原抗体的初级免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在纳克级水平。酶免疫测定法中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定，实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶免疫测定法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样品，不需要特殊的仪器设备。,三、几种常用类型的ELISA测定法,1.间接法测抗体效价2.双抗体夹心法测定抗原量 3.竞争法测定抗原量,ELISA在食品污染物检测中的应用主要集中在以下几方面,(1)真菌毒素的检测（1977年，LaWell首次采用了ELISA法来检测黄曲霉毒素）。近十几年来国内外用于生物毒素检测的ELISA方法得到迅速发展，已有多种ELISA诊断试剂盒用于分析不同的毒素。可检测的真菌毒素有黄曲霉毒素B1、M1，赫曲霉毒素A(OA)等。,(2)食品中农药残留的测定 常用ELISA检测的农药残留种类：有机磷农药 拟除虫菊脂类农药。,(3)食品中致病菌的检测 ELISA法可用于检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、大肠杆菌等致病微生物。(4)其他污染物成分及违禁药物检测 盐酸克伦特罗（瘦肉精）,传统检测方法(如化学分析法、比色法和微生物法)不同程度存在对实验人员有较高的要求，样品基质背景复杂，前处理过程烦琐，需要耗费较多的时间，被测感分浓度较低，分析仪器的定性能力受到限制，仪器检测灵敏度不够等不足之处，不但不适于大批量产品质量的监控，也很难达到国际上现行的、越来越严格的标准。ELISA技术虽然只有短短几十年，但因其简便、快速、灵敏、微量化等诸多优点，国内外有多家公司制作了大量的ELISA商业试剂盒，可供作相应项目的检测。,ELISA技术还应从以下几个方面不断发展，如:通过DNA重组技术和蛋白质工程技术，研究开发高免疫原性的重组抗原替代在天然材料中无法分离纯化的抗原物质，进而扩大ELISA检测范围;通过重组工程技术表达特定的融合蛋白，将多种不同蛋白质的功能构建在一起，可以快速方便地同时检测多项标志物以用于多项标记快速测定。另外，还需进一步加强酶体外定向进化用于免疫检测的研究和全自动酶联免疫测定仪在食品安全检测中的应用。,第七节 聚合酶链检测技术,聚合酶链反应(PCR)又称无细胞分子克隆系统或特性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是1985年由美国加州Mullis博士 等人创立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法，发明人Mullis也因此获得1993年诺贝尔化学奖。PCR技术在疾病诊断、食源性病原菌和食品转基因成分的检测等方面得到了广泛的应用并显示出巨大的发展潜力。,PCR的特点,1.特异性强2.灵敏度高 3.操作简便快速 4.对标本纯度要求低并且无放射性污染 5.可扩增RNA或DNA,美国ABI 实时荧光定量PCR芯片系统,美国ABI 2720型PCR扩增仪,PCR的类型,PCR因实验材料、实验目的和实验要求等的不同，在标准PCR的基础上，已衍生出近几十种不同类型的PCR，这些PCR和标准PCR的原理相同，但是由于实验目的不同，具体的操作过程略有不同。,美国ABI 7900高通量快速实时PCR系统,思考题,1.食品安全检测技术的主要内容是什么?2.GC-MS联用仪和气相色谱仪有何区别?3.酶联免疫吸附测定原理是什么?4.聚合酶链检测技术(PCR)有何特点?,