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端粒和端粒酶 telomere and telomerase,泰山学堂2013级生物取向郭雪莹,领头链,随从链,5,5,染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题：,3,5,5,3,RNA引物,3,3,RNA引物水解,即DNA复制过程不能自始至终完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解），如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。,Elizabeth Blackburn,Carol Greider,Jack Szostak,在细胞分裂时的染色体如何完整地自我复制如何受到保护以免于退化,1）端粒和端粒酶的定义2）二者的结构和功能3）合成端粒的机制4）在细胞衰老中的作用,1、端粒是染色体末端由重复DNA序列和相关蛋白组成的特殊结构，具有稳定染色体结构和完整性的功能。,2、端粒酶是核蛋白逆转录酶，以自身RNA为模板，合成端粒DNA，将端粒DNA加至真核细胞染色体末端，为细胞持续分裂提供遗传基础。,端粒的结构和功能,由富含G和T的6碱基重复序列组成，结合一些蛋白质，构成染色体的“末端保护帽”。没有游离的末端是染色体末端稳定的关键。,1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：,端粒 染色体DNA 端粒,人端粒的分子组成：,末端补齐机制：,5,GGGGTT,（GGGGTT）n,端粒酶,5,G-G配对回折,3,5,DNA聚合酶,（1）端粒T环结构(terminal loop)，使染色体末端封闭起来，免遭破坏；（2）端粒D环结构(displacement loop)，结合TRF2等蛋白，阻止染色体末端融合和损伤反应。,端粒的结构特点,GT链的5端 3端，总是指向染色体的末端。重复次数不保守。链区内有缺口即游离的3-OH存在。DNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是一个回折结构。,端粒末端回折结构,端粒 染色体DNA 端粒,端粒的作用,稳定染色体末端结构；保持染色体DNA遗传信息复制的完整性，解决决DNA末端复制问题；与细胞衰老有关。细胞愈年轻，端粒愈长；细胞愈老，端粒愈短。,端粒酶的结构,由RNA组分和蛋白质组分组成。,端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（hTERT）端粒酶结合蛋白（TEP）,CAACCCCAA,CAACCCCAA,CAACCCCAA,端粒酶RNA,1）CAACCCCAA结构，有碱基修饰。,2）反义RNA封闭，能抑制酶活性。,反义RNA,端粒酶结构包括部分：端粒酶(）；端粒酶催化亚单位（）端粒相关蛋白质（）。另外，还有0，和等。其中和是端粒酶最关键的结构。,的结构改变或成分的丢失均会影响端粒酶的活性。为端粒酶的催化亚基，是一个包含个氨基酸残基的多态链。具有逆转录酶的共同结构-个蛋白质域以及端粒酶催化亚基独特的框架保守区域。其编码基因位于染色体上。是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位，它可以通过逆转录模板序列，合成端粒重复序列并添加到染色体末端，从而延长端粒长度。,对端粒酶活性的表达，和两种组分缺一不可，但它们的表达调控应该是分离的。在人的组织细胞中广泛表达，是一个普遍现象。而只在有端粒酶活性的细胞中（如生殖细胞、各种具有分裂增殖能力的细胞和绝大多数肿瘤细胞）表达。在端粒酶阴性的细胞中导入编码的基因，则可重建细胞的端粒酶活性，结果细胞的端粒增长，寿命延长。的水平和蛋白表达水平则总是与端粒酶活性呈正相关。端粒酶活性阳性细胞中的基因突变或沉默，则细胞端粒酶活性消长，老化过程延缓，甚至出现永生化现象,端粒的结合或相关蛋白最重要的是人端粒重复序列结合因子,，和等。和均专一性地与端粒重复序列结合。对端粒的长度起负调控作用，可以在一定程度上抑制端粒酶在端粒末端的行为；则可以防止染色体末端相互融合，对维持端粒的正常结构必不可少。其他相关蛋白则可与它们形成复合体，共同行使调控端粒的长度和保护端粒末端结构等功能作用。,端粒帽 染色体DNA 端粒帽,n（CCCCAA）（TTGGGG）n,n（GGGGTT）（AACCCC）n,3,5,端粒结合蛋白,保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合,端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度。它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。,端粒酶RNA(hTR),端粒酶逆转录酶（TERT）,端粒酶结合蛋白（TEP）,端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶组分。端粒酶RNA含有与同源端粒DNA序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H切割此模板区,能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。,人类TERT（hTERT）基因为一单拷贝基因,定位于5p15.33,具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T。破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短。,TEP1、生存动力神经细胞基因(SMN)产物、hsp90、PinX1、Est1p 和Est3p,端粒酶对端粒的作用,Telomerase activity is repressed in somatic cells of multicelluar organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell generation.As this shortening reaches informational DNA,the cells senesce and die.,细胞分裂,端粒阈值,When telomerase activity is repressed,端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老,培养细胞中端粒长度随分裂次数增多而缩短,端粒长度与细胞的年龄呈负相关,端粒长度和细胞分化程度呈反比,Estl突变体酵母活性下降，出现明显衰老,四膜虫端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡,体细胞端粒长度大大短于生殖细胞,端粒平均长度随生物体年龄增大而变短。,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,端粒端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响 GryfeR等于1997年提出了关于细胞衰老和永生学说，认为人的正常体细胞分裂次数达到界限时，染色体端粒长度缩短到一定程度，有丝分裂便不可逆地被阻断在细胞周期的G1期和G2/M期之间的某个时期，这时的细胞便进入了老化期，随后死亡.如果细胞被病毒感染，或p53、RB、p16INK4、ATM、APC等肿瘤抑制基因发生突变，或K ras等原癌基因被激活，或DNA错配修复基因(如hMSH2等)发生突变，或某些基因DNA序列发生了高度甲基化，或仅发生了低度甲基化，从而(在未发生核甘酸突变的情况下)改变了该基因的表达，此时细胞便能越过阻断点继续进行有丝分裂。随着有丝分裂进行，端粒长度不断缩短，缩短到一定程度时，染色体发生结构畸变，大部分细胞便死亡，少部分细胞激活了端粒酶活性，不断合成端粒DNA补充端粒的长度，端粒不再缩短，细胞便获得无限分裂增生能力而成为永生化细胞。这说是端粒-端粒酶假说。,细胞的死亡过程分为两个阶段,当端粒缩短至一关键性长度2kb-4kb 时,染色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进入M1期（mortality stage1 M1）。在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）发送周期停止信号，DNA合成停止，DNA 断裂,导致细胞G1期生长停滞,最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原、PRB,p53,p16 等抑癌基因失活,丧失正常功能,均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达M2期。细胞由于端粒过短,基因不稳定,绝大多数细胞死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活,端粒的功能得到恢复,基因重获稳定,使细胞超越M2期,成为永生化细胞。,端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变 M1M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡,端粒酶在人体细胞永生性转化,端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematire Lengthening of telomere ALT）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在400多例来源于12 种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4。,附表 人体组织中端粒酶活性,近年来，针对端粒酶为作用靶点的抗肿瘤研究非常活跃，其研究目标就是寻找各种有效的途径来抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，目前主要的途径有以下几种：阻断端粒酶的模板作用，包括：1、反义、反义寡核苷酸、锤头状核酶和肽苷酸等；2、针对端粒酶催化亚基的抑制剂：抑制剂、端粒酶蛋白抗体、调节剂等；3、其他抑制剂。,抗癌策略,反义核酸,突变RNA的引入,端粒酶蛋白抑制剂,端粒酶生物学抑制剂,端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的:肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感,作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡;生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下,端粒长度稍有缩短,然后继续生长,端粒不再缩短。,一、以粒酶酶RNA为靶标通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑制 1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是与靶RNA 配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA 形成杂合体,被动和主动地抑制RNA 的逆转录。2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。,二、抑制端粒酶逆转录酶活性1、hTERT 突变 在体内和体外实验中,hTERT 突变后端粒酶活性均明显被抑制。2、逆转录酶抑制剂(reverse transcriptase inhibitors,RTI)由于端粒酶是RNA 依赖的DNA聚合酶,所以RTI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。3、靶向hTERT mRNA的ASODN 针对hTERTmRNA 设计的ASODN 能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。,三、G四联体的稳定 端粒3端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA 结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。四、小分子抑制剂 通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002),但其作用机制尚不清楚。,A 针对人端粒酶RNA组分,反义核酸,核酶,突变RNA的引入,Although much work has been done investigating cellular aging and telomere length,the connection between telomere length and organismal longevity is not straightforward.Formulated by Harley,the telomere hypothesis of cellular aging postulated that telomeres serve as an internal mitotic clock in telomerase negative mammalian somatic cells and when telomere length is exhausted cellular senescence and the eventual death ensues.Multiple studies have found varying results in terms of telomere length and overall organismal longevity.,Studies involvingC.elegans,秀丽线虫 a well-established model for molecular biology of aging,have demonstrated that overall telomere length does not affect or predict the organismal longevity.Danio rerio鲐鱼类shows high levels of telomerase activity throughout its lifespan and maintains telomere length even into late stages of life.No telomere shortening with increasing age is seen in wild-derived mouse 小鼠strains,as well as in the marine bird海鸟Oceanodroma leucorhoa.,甲壳类的端粒始终保持不变，或许有更复杂的因素导致衰老和死亡The crustacean甲壳类,Homarus americanus(lobster)龙虾,was investigated to determine overall telomere length and telomerase activity during aging.These organisms display such extensive lifespans that some predict would be nearly immortal if provided with optimal environment.Lobsters display telomerase activity throughout their lifespan with a relatively unchanged telomere length.Although cellular aging may be well defined by the telomere hypothesis of cellular aging,organismal aging is a multifactor process with a more complicated relationship between telomere length and organismal longevity,机体衰老是由于氧化损伤而非端粒长度Organismal aging is a multifaceted process and the ability to respond to and survive the proteotoxic stress 氧化激化is an important factor in determining the longevity of an organism.There are several theories of aging;however,studies have shown that the pathologies and phenotypes associated with aging may stem from damaged proteins and the inability to repair or eliminate these damaged molecules from cells Although there are many different aspects of the aging process,it is possible that the ability to respond to proteotoxic stress is a better determinant of organismal life span instead of overall length of the telomeres.,应对氧化应激的能力是与长寿命有关的In other words,the cellular damage arising from being unable to respond appropriately to proteotoxic stress may lead to death before the telomere length declines.In addition to heat stress,oxidative damage to proteins also causes proteotoxicity and in multiple organisms investigated,better ability to respond to oxidative stress is correlated with longer lifespans.In the marine crustacean,Acartia tonsa,oxidative damage was found to be greater in the shorter lived male individuals of the species indicating that oxidative damage may play a role in the overall lifespan of this crustacean.,蜜蜂的卵黄蛋白原蛋白保护和端粒长度以外的因素导致了短寿命,A study done in honeybees identified vitellogenin as a protein that protects the organism from oxidative stress and contributes to longevity.Daphniacontain a vitellogenin homolog that could be investigated for any differences inD.pulexvsD.pulicariafor its role in protection from oxidative damage.AsDaphniais emerging as a model system in aging studies our results reveal a non-concordance between telomerase activity,telomere length and the overall organismal aging and indicate that factors other than telomere length maintenance contribute to strikingly short life span inD.pulex.,更多的问题,如端粒结合蛋白的调控机制及其与端粒酶协同作用机制；端粒酶表达和活性的调控机制；少数端粒酶活性阴性的肿瘤细胞的永生化机制是什么，其端粒维持的机制如何；端粒酶独立于端粒之外的抗凋亡和调节细胞生存的作用机制；氧化应激状态下端粒酶的线粒体定位的机制和功能等问题均有待进一步的探讨和阐明。,References1.de Lange T.Protection of mammalian telomeres.Oncogene.2002;21:532540.PubMed2.Hayflick L.The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains.Exp Cell Res.1965;37:614636.PubMed3.Shay JW,Wright WE.Hayflick,his limit,and cellular ageing.Nat Rev Mol Cell Biol.2000;1:7276.PubMed,4.Greider CW,Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell.1985;43:405413.PubMed5.Liu L,Bailey SM,Okuka M,Munoz P,Li C,Zhou L,et al.Telomere lengthening early in development.Nat Cell Biol.2007;9:14361441.PubMed6.Morgan G.Telomerase Regulation and the Intimate Relationship with Aging.Research and Reports in Biochemistry.2013;3:7178.7.Raices M,Maruyama H,Dillin A,Karlseder J.Uncoupling of longevity and telomere length in C.elegans.PLoS Genet.2005;1:e30PMC free articlePubMed,Thank you for your attention!,