流式细胞仪教材课件.ppt
流式细胞仪,1.流式细胞术概述,2.流式细胞仪概述,3.流式细胞仪系统结构,4.流式细胞仪软件介绍,目 录,5.流式细胞仪其它,1.流式细胞术概述,1.流式细胞术概述,流式细胞术定义流式细胞术发展史流式细胞术特点,1.流式细胞术概述,1.流式细胞术定义：流式细胞术(Flow Cytometry，FCM或 FACS)：是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞术是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。,1.流式细胞术概述,2.流式细胞术发展史：1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究；1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞；1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利；1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪,1.流式细胞术概述,3.流式细胞术特点：分析对象：单细胞悬液或生物颗粒分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数）可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads Array,CBA）检测结果：精度高、准确性好先进的细胞定量技术,2.流式细胞仪概述,2.流式细胞仪概述,流式细胞仪定义流式细胞仪的发展史与商品化流式细胞仪的生产厂家流式细胞仪的分类BD公司、Beckman公司的分析仪及分选仪外观,2.流式细胞仪概述,贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪,2.流式细胞仪概述,1.流式细胞仪定义：流式细胞仪(Flow Cytometor,FCM)是以流式细胞术为核心技术，对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。,2.流式细胞仪概述,2.流式细胞仪的发展史与商品化：1953年：Parker 和 Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏型；1969年：Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计；1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM，DNA定量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激光光源，吖啶橙染色，测定淋巴、单核、中性粒C；1972年：Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪（FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化时代到来；1973年：Becton Dikinson(BD)公司投入市场，第一台FACS-问世，其后20多年来不断改进完善产品，先后推出FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-、FACSVantage、FACSDiva、FACSAria等；1975年：Kochler 和 Milstein 提出单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础；鉴于商业仪器的发展;,2.流式细胞仪概述,1983年：Shapiro 认为多参数分析流式细胞仪可以实现。此后，流式细胞仪进入一个快速发展的时期；1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受到广泛关注；2008年：美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、立体分选。,2.流式细胞仪概述,4.流式细胞仪生产厂家：目流式细胞仪生产厂家主要有 BD、Beckman Coulter、Partec、Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等等。美国 BD、Beckman Coulter 和德国的 Partec 占领着流式细胞仪市场的统治地位。BD、Beckman Coulter 产品型号种类齐全，占市场份额较大，如：经济普及型流式细胞仪：FACSCount、Cytomics FC500；大型科研型流式细胞仪：BD FACSAria、EPICS；特点：产品价格昂贵，我国使用的单位基本上是科研机构。Partec 产品结构紧凑，造价低，便于携带，适合边远地区和发展中国家，在植物学的研究中占有较大份额。Partec 公司的 CyFlow 于2004 年 1 月进入太空站用于研究工作，成为世界上首台升上太空的流式细胞仪，证明其结构紧凑，性能优越的特点。,2.流式细胞仪概述,5.流式细胞仪分类：临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握，适用于临床常规测试；科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上，适用于科研。,2.流式细胞仪概述,BD公司的流式细胞分析仪,2.流式细胞仪概述,BD公司的流式细胞分选仪,2.流式细胞仪概述,Beckman公司的流式细胞分析仪,2.流式细胞仪概述,Beckman公司的流式细胞分选仪：,3.流式细胞仪系统结构,3.流式细胞仪系统结构,流动室与液流系统激光光源与光学系统信号检测与分析系统分选系统,3.流式细胞仪系统结构,流 式 细 胞 仪 结 构 图,3.流式细胞仪系统结构,1.流动室和液流系统流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器,3.流式细胞仪系统结构,流动室：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出;流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,3.流式细胞仪系统结构,流体的动力学聚焦,3.流式细胞仪系统结构,3.流式细胞仪系统结构,流动室与液流驱动系统模拟图,3.流式细胞仪系统结构,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,3.流式细胞仪系统结构,入管道前，边缘与中心速度一致；入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变；大约管道50倍直径处，稳定层流形成，产生流体聚焦效应；液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱。,3.流式细胞仪系统结构,2.激光光源与光学系统FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤光片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光）FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）,3.流式细胞仪系统结构,激光光源激光特点：单波长、高强度、高稳定性目前主流产品标准配置：(1)多采用氩离子激光器或氦氖激光器(2)一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光(3)最多检测13个荧光参数,3.流式细胞仪系统结构,3.流式细胞仪系统结构,3.流式细胞仪系统结构,光学系统示意图,3.流式细胞仪系统结构,3.流式细胞仪系统结构,光收集系统：光电倍增管（PMT）,光电倍增管(PMT：photomultiplier tube)：放大电信号,光灵敏度高；响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区；用于测定弱信号(SSC、FL1、FL2、FL3、FL4)。光电二极管：光灵敏度低，测定强信号（FSC）。,3.流式细胞仪系统结构,3.信号检测与分析系统信号检测系统由特异信号检测器件和非特异信号检测器件构成。当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生非特异的散射光和特异的荧光信号。荧光信号由PMT检测,前向角散射光信号由光电二极管检测。,3.流式细胞仪系统结构,散射光的测定：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向角散射光和侧向角散射光。,3.流式细胞仪系统结构,前向角散射光（FSC:forward scatter）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,3.流式细胞仪系统结构,前向角散射光示意图,3.流式细胞仪系统结构,侧向角散射光(SSC:side scatter):激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、核膜变化更敏感，用于检测细胞内部结构属性。,3.流式细胞仪系统结构,侧向角散射光示意图,3.流式细胞仪系统结构,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,光散射测量最有效的用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,3.流式细胞仪系统结构,荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,3.流式细胞仪系统结构,荧光激发及发射原理,特点：荧光方向与SSC相同，SSC的波长与激发光波长相同，荧光波长比激发光波长要长（双色反射镜和带通滤光片将二者分开）,3.流式细胞仪系统结构,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 670,3.流式细胞仪系统结构,荧光信号线性测量和对数测量 线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。对细胞膜表面抗原等参数进行荧光检测时，通常使用对数放大器。线性放大器 对数放大器,3.流式细胞仪系统结构,荧光信噪比1.荧光信号主要包括两部分：自发荧光：即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；特征荧光：即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。2.减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：尽量选用较亮的荧光染料；选用适宜的激光和滤片光学系统；采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。,3.流式细胞仪系统结构,4.分选系统分选目的：通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究。,3.流式细胞仪系统结构,分选原理：,3.流式细胞仪系统结构,分选指标分选指标主要包括分选速度、分选纯度、细胞回收率、分选得率。分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,4.流式细胞仪软件介绍,4.流式细胞仪软件介绍,4.流式细胞仪软件介绍,BD仪器软件基本应用软件：CellQuest:完成仪器设置、数据获取、统计分析等全能工具FACSComp:自动调整仪器设置自动化获取分析软件：1）SimulSET/MultiSET：双色和多色免疫表型分析或绝对计数2）ProCOUNT：造血干/祖细胞自动化分析，报告CD34+细胞绝对值3）HLA-B27分析软件：血液T淋巴细胞HLA-B27定量分析4）ReticCOUNT：网织红细胞自动化分析分析软件：1）ModFit软件：DNA周期、倍体和凋亡的自动或手动分析2）QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量（ABC），主要检测白细胞表面分化抗原和细胞活化指标3）PAINT-A-GATE：多维参数资料分析，同时分辨显示多个细胞群体4）ATTRACTOR软件：多参数资料的自动快速批量分析分选软件：FACS Diva,5.流式细胞仪其它,5.流式细胞仪其它,流式细胞仪工作过程流式细胞仪与显微镜的区别流式细胞仪的应用流式细胞仪性能技术指标,流式细胞仪工作过程,流式细胞仪工作过程,流式细胞仪与显微镜的区别,流式细胞仪与显微镜的区别：流式细胞仪是一种特殊的显微镜,流式细胞仪的应用,流式细胞仪的应用在肿瘤学中的应用在血液学中的应用在免疫学中的应用在细胞凋亡检测中的应用,流式细胞仪性能技术指标,流式细胞仪性能技术指标流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选/分选速度及纯度等。荧光分辨率：指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV 值）来表示。现在市场上主流型号的荧光分辨率小于 2.0%，有的甚至在 1%之内；荧光灵敏度：反映了仪器探测最小荧光光强的能力，一般用荧光微球上可测出的荧光（FITC）的最小分子数来表示。目前仪器可以达到 1000左右；样品浓度：仪器工作时样品浓度的适用范围一般在1010细胞/ml的数量级；分析/分选速度：分析速度一般为 5000-10000 个细胞/s，分选速度控制在 1000 个细胞/s 以下，分选纯度 98%。,参考资料,参考资料,谢谢!,
