核酸的提取课件.ppt

核酸的提取和检测,营养与食品卫生学教研室 李颖,分子生物学实验技术,分子生物学从分子水平的角度，以研究生命本质为目的，研究核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象的一门新兴边缘学科。分子生物学是当前生命科学中发展最快并正与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。,生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。,一、分子生物学的概念,揭开生命秘密的科学家们,1928年，英国的细菌学家格里菲思（Griffith）进行了著名的肺炎双球菌转化实验。加热杀死的S型肺炎球菌可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌，为什么呢？在美国纽约洛克菲勒研究所工作的艾弗里（Avery）立刻敏感地抓住了这一问题，进行了“转化因子”实验，艾弗里等人的研究工作表明：DNA是遗传物质。,更有说服力的是1952年赫尔希（Hershey）和蔡斯（Chase）利用病毒为实验材料完成的噬菌体侵染细菌的实验，从1944年到1952年，用了8年时间，全世界科学家才一致接受了艾弗里：生命的遗传物质是DNA。,揭开生命秘密的科学家们,1953年2月的一天，沃森（Watson）在伦敦的威尔金斯那里看到了弗兰克林（Franklin）拍摄的DNA照片。在弗兰克林（Franklin）拍摄的DNA照片的启发下，沃森与克里克（Crick）终于确立了DNA双螺旋结构理论，4月25日，在英国出版的国际权威杂志自然上，克里克和沃森把他们对DNA分子双螺旋结构的研究成果用文章的形式公诸于世。,揭开生命秘密的科学家们,核酸 储存生命活动的各种信息蛋白质 一切生命活动的执行者,核酸（DNA，RNA）蛋白质,基础理论,技术,二、分子生物学的研究内容,研究内容包括基因的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。,由于分子生物学涉及生命本质的认识，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础，特别是对临床诊断和治疗水平的提高起到了积极的推动作用。,分子生物学与医学,1.从机体表型来认识疾病,即根据现象和检查所获知的症状与体征。2.从组织细胞的病理、生理变化来分析和诊断疾病。使人类积累了十分丰富的医学资料。但都不能从本质上真正认识疾病发生的根本原因，更不能从根本上治愈疾病和阐明疾病的发病机制。,人类对疾病的认识：,随着分子生物学的诞生与发展，导致基础医学和临床医学都从分子水平来探讨多种多样的生命现象，使各种生理和病理现象的机制都可能从分子水平找到答案。,“分子病”（molecular disease）：,1949年美国化学家L.C.波林在研究镰形细胞贫血症时，发现患者的异常血红蛋白是由链N端的第6位的谷氨酸被缬氨酸所替代所致。进而提出“分子病”的概念。,指由于基因突变导致蛋白质分子结构或合成量的异常所引起的疾病。,构成血红蛋白B链单个氨基酸替换基因变化(GAA)(GUA).蛋白质变换（谷氨酸 缬氨酸）蛋白质一级结构发生亲水性谷氨酸 疏水性缬氨酸血红蛋白分子表面形成“粘性”突起使细胞弯曲成镰刀状不宜通过毛细血管 容易破裂,在继“分子病”之后，又陆续的提出“基因病”、“构象病”和“信息病”等分子生物学新概念。使得医学研究的整个格局和观念逐步发生了改变，使人们对疾病的认识不断地深入到分子水平阶段。,DNA、RNA 和蛋白质成为人类治病、防病的一类新型的生物制品或药物。基因诊断和基因治疗的开展也是分子生物学在医学领域中的应用典范。,“构象病”,疯牛病的机理Prion的蛋白质,在正常机体中，是神经活动所需要的蛋白质某些因素折叠异常、折叠错误-蛋白质在空间构象上出现疏水面，导致积聚-（朊病毒）Prion进入脑组织，正常的Prion被感染，转变为朊病毒，在脑中沉积，使脑组织海绵状坏死，最后造成动物死亡。,朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起人和动物神经退行性病变而表现疯牛病症状，症状出现后，进行性加重，一般只需2个星期到3个月，疯牛以死亡而告终。,疯牛病,（淀粉样纤维沉淀）,Prion（朊病毒）蛋白质,分子生物学,在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。,可能发生了什么,预测,赖以发生了什么,病因,已经发生了什么,结果,基因组学,蛋白质组学,代谢组学,23对染色体（包括常染色体和性染色体）,问题一、DNA提取需要的样本来源？卵细胞、精子、受精卵细胞、体细胞、培养细胞、微生物、血液、精斑、毛发、骨骼、牙齿问题二、待测提取样品的保存条件？问题三、获得DNA后，用于哪些研究和实验？,组织/细胞,获取DNA:,细胞核,染色体,DNA,核苷酸,脱氧核糖,碱基,磷酸,一、DNA（或RNA）的特点：,由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。,一、DNA（或RNA）的特点：,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系(260nm)从核酸的分子结构上看，核酸是两性电离，在碱性环境下带负电荷。DNA空间构象不同，电泳时迁移率不同，环形的、螺旋形就比线形的迁移率快。,嘌呤,一、DNA（或RNA）的特点：,天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。,DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,一、DNA（或RNA）的特点：,根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针。DNA的双螺旋结构DNA在细胞中存在部位不同（细胞核、线粒体、质粒），RNA存在于细胞质中。,破碎细胞,去除与核酸结合的物质,纯化DNA,浓缩,释放DNA,去除盐类、有机溶剂等杂质,DNA的提取、纯化,（1）酚抽提法（2）甲酰胺解聚法（3）玻璃棒缠绕法（4）异丙醇沉淀法,（一）酚抽提法的基本原理,破碎细胞,去除与核酸结合的物质,纯化,浓缩,用去污剂蛋白酶K,酚/氯仿,盐和乙醇沉淀DNA,细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入蛋白酶K可使细胞壁破碎。,(二)核酸提取的原则,1.保证核酸一级结构的完整性。2.排除其他分子的污染，即纯度要高。,机械剪切力 高温 细胞突然放在低渗溶液 反复冻融,减少物理因素对核酸的降解:,避免生物因素对核酸的降解:,细胞内外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在广泛，稳定，极易降解核酸。应注意采用核酸酶抑制剂和其他破坏方法。,1核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。2其他生物大分子，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度。3排除其他核酸分子的污染，如提取DNA时，应去除RNA；反之亦然。,对于核酸纯度的要求,注意事项,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。,2）减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH4pH10的条件下进行。,1 磷酸盐缓冲液（phosphorate buffer solution,PBS）2 DNA抽提缓冲液：10 mmol/L TrisCl（盐酸三羟基甲基氨基甲烷）pH 8.0 0.1 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸），pH8.0 20 g/ml胰RNA酶，0.5%SDS（十二烷基硫酸钠）3 20mg/ml蛋白酶K4 酚（用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0饱和），5 10 mol/L NH4Ac，6乙醇7 TE（Tris和EDTA混合液）8 透析液：50 mmol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0,（二）试剂,（三）样品前处理,1生物组织 取1g3g左右的组织，冻结组织。破碎细胞。,在离心管中加入10ml DNA抽提液；用玻璃棒边搅动边加入组织粉末，（37保温1h，一方面有利于SDS破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度达到37，为下一步反应准备适宜条件。,2培养的细胞,收集细胞：悬浮培养的细胞，可以直接进行1500g离心，410min后收集细胞；贴壁生长的细胞，用胰酶消化后再离心收集。细胞数应在5107个左右。,漂洗细胞：将离心沉淀的细胞用冰预冷的PBS或生理盐水，漂洗1次再离心，弃上清收集细胞，可重复漂洗12次。用10ml DNA抽提液将细胞沉淀悬浮，并在37保温1h。,3.血液样品,将20ml新鲜血液与3.5ml抗 凝液混匀，0下保存数天或-70下长期冻贮，备用。解冻后，加入等容积PBS混匀，3500g离心15分钟，弃去含裂解红细胞的上清，将白细胞沉淀悬浮于15mlDNA抽提液中，37 保温1小时。新鲜血液，离心去上清，转移到新的离心管，再离心，弃去上层血浆相，下层白细胞用DNA抽提液悬浮，37 保温1小时。,Detergent,Add about 2 tablespoons of detergent,swirl to mix.Let the mixture sit for 5-10 minutes.,Why add detergent?,Blending separated the pea cells,but each cell is surrounded by a sack(the cell membrane).DNA is found inside a second sack(the nucleus)within each cell.To see the DNA,we have to break open these two sacks.,Why add detergent?,We do this with detergent.Think about why you use soap to wash dishes or your hands.To remove grease and dirt,right?,Why add detergent?,Soap molecules and grease molecules are made of two parts:Heads,which like water Tails,which hate water.,Why add detergent?,Both soap and grease molecules organize themselves in bubbles(spheres)with their heads outside to face the water and their tails inside to hide from the water.,Why add detergent?,When soap comes close to grease,their similar structures cause them to combine,forming a greasy soapy ball.,Why add detergent?,A cells membranes have two layers of lipid(fat)molecules with proteins going through them.,Why add detergent?,When detergent comes close to the cell,it captures the lipids and proteins.,（四）DNA提取步骤,1消化 向上述预处理好的样品溶液中（样品溶解在DNA抽提液并保温1h），加入20mg/ml的蛋白酶K，至终浓度为100g/ml，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，至溶液呈粘稠状，此时细胞破裂，蛋白、核酸释放。将反应液放在50水浴3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时轻轻摇匀反应液。,2加酚混匀 将反应液冷却至室温，加入等容积饱和的酚溶液，轻轻地上下转动离心管，混匀两相，反复该动作10min，直至水相与酚相混匀或呈乳状液。若没有达到这种效果，可用多角度震荡器温和地混匀1h。混匀非常重要，充分的混匀有利于将蛋白质等大分子物质从水相赶出。,3离心 室温5000g离心15min，使两相分开，DNA溶于水相。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。,4取上层水相并用酚重复抽提两次，取上层水相时，因水相粘稠，应用大口径（0.3cm）吸管操作。,沉淀处理：,酚抽提后，将上层水相移入1个新离心管中，加入0.2倍容积的乙酸铵和2倍容积95%乙醇，室温下轻慢摇动混匀，可见白色丝状DNA沉淀，用玻璃棒捞出DNA纤维，放入70%乙醇中漂洗2次。,沉淀处理：对于100kb150kb DNA的提取，在酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，,水,酚,0.2倍体积的10mol/L NH4Ac和2倍体积95%乙醇,DNA沉淀,放入70%乙醇中漂洗2次,室温5,000g离心5min,室温下挥发残留乙醇,然后加TE（pH8.0）溶解DNA，一般需要12h24h才能完全溶解。,1 OD50g/ml（双链DNA）；1 OD40g/ml（单链DNA或RNA）1 OD30g/ml（olig核苷酸）。,6样品测定,在260nm紫外线下,根据A260/A280比值，可判断所提取核酸（DNA）的纯度:DNA纯度比较理想的比值是1.8，RNA比值是2.0。提取的DNA溶液的A260/A280比值高于1.8，说明有RNA的污染；低于1.8或1.75，则认为是蛋白质或酚污染。,如果根据A260/A280比值判断，DNA样品纯度不符合要求（尤其是A260/A280比值小于1.8时），可用酚、酚/氯仿或氯仿抽提2 3次。用氯仿抽提后，还要用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚。最后用盐和乙醇沉淀DNA，用TE溶解。,cell growth,cell harvest and lysis,DNA purification,DNA purification:overview,DNA concentration,Bacterial genomic DNA prep:cell extract,Lysis:Detergents Organic solvent Proteases(lysozyme)Heat,“cell extract”,Genomic DNA prep:removing proteins and RNA,Add the enzyme RNase to degrade RNA in the aqueous layer,Need to mix gently!(to avoid shearing breakage of the genomic DNA),chloroform,2 ways to concentrate the genomic DNA,70%final conc.,“spooling”,Ethanol precipitation,思考题,1.DNA的分离提取过程中为什么在低温下进行？2.加EDTA的作用？3.制备的DNA 在什么溶液中较稳定?4为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？5.在DNA提取过程中加SDS的作用？6.脑、肝脏、骨骼肌和脂肪细胞中DNA含量排序？,思考题：,检测某基因与肝癌发生的关系，需要如何获取生物样品？简要的分析过程。,