基因定点突变技术课件.ppt
基因定点突变技术,目录,一、定点突变简介二、基因定点诱变三、基因定点突变应用四、展望,一、定点突变简介,定点突变（site-directed mutagenesis）技术可以有目的性地在已知 序列中取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以有目的或针对性的改变序列中的碱基次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理，也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关系。,定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动对分子的复制，该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂，且易发生其他突变；,1、寡核苷酸盒式诱变（Cassette mutagenesis）,利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列。,2、寡核苷酸引物诱变,使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列,将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体上，制备单链DNA将合成的寡核酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链DNA将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因突变体的筛选：寡核酸探针杂交筛选法,3、重叠延伸介导的定点诱变,首先将模板DNA分别分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）和2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链DNA，进行PCR3扩增。最后，用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段（PCR4)。,4、大引物诱变法,首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA。由于F2中的退火温度显著高于第一轮PCR所使用的引物M和R1，因此，可忽略引物M和R1在本轮反应中所造成的干扰。,PCR介导的定点突变的优势,1、突变体回收率高，有时不需要进行突变体筛选；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变；3、可以在同一试管中完成所有反应；4、快速简便，无需再噬菌体M13载体上进行分子克隆。,三、基因定点突变应用,近年来，由于突变技术使得人们可以按照自己的意愿改造基因或蛋白质的产物，从而取得改变后的产物，使其造福于人类。因此突变技术已广泛应用在各个领域，具有着广阔的应用前景。分为：1、突变技术在蛋白质工程中的应用2、缺失改造,1、突变技术在蛋白质工程中的应用,突变技术在蛋白质工程中的应用非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且也是研究蛋白质结构和功能关系的重要方法。,在农业方面：利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机磷污染 民用杀虫剂。在酶工业方面：一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、极端、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的结构和功能。在医药方面：通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非常重要的指导意义。,、缺失改造,心钠素（）和干扰素（）在临床上有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物一样，人们便采用寡核苷酸指导的定点突变技术，成功地对这些多余的核苷酸进行了缺失改造，以期得到正确的产物。,四、展望,定点突变技术可以高效地应用于缺失改造、蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明的应用前景。,谢谢大家,
