化学酶工程课件.pptx

第一节 酶分子的化学修饰,第二节 模拟酶,第三节 抗体酶,第四节 印迹酶,第五章 化学酶工程,第一节 酶分子的化学修饰,游离酶缺点：抗原性；稳定性差；活性不够高。,第五章 化学酶工程,广义：凡是通过化学的方法和手段或是通过化学反应使酶的分子结构发生改变的技术或过程，都可称为酶的化学修饰。狭义：酶的化学修饰则主要是指在较温和的条件下，以可控的方式使酶同某些化学试剂发生特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变的过程。,定义,第一节 酶分子的化学修饰,酶化学修饰的目的：人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的特性，扩大酶的应用领域。,酶化学修饰后的变化：,改变活性部位的构象。,提高生物活性。,增强酶的稳定性。,降低酶类药物的抗原性。,改变酶学性质。,第一节 酶分子的化学修饰,酶化学修饰的原理,利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性，直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而使酶分子的结构发生改变。,被修饰酶。,修饰剂的选择。,修饰反应条件的选择。,第一节 酶分子的化学修饰,考虑因素,酶分子侧链基团的化学修饰 酶分子表面的化学修饰,方法及修饰剂,第一节 酶分子的化学修饰,采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶的性质发生改变，以满足人们的需要。,常用的大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。,常见的修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。,酶分子表面的化学修饰,第一节 酶分子的化学修饰,酶分子侧链基团的化学修饰,酶蛋白的侧链主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。,第一节 酶分子的化学修饰,氨基的化学修饰（赖氨酸）,乙酸酐,2,4,6三硝基苯磺酸,2,4二硝基氟苯,碘乙酸,氨基的化学修饰（赖氨酸）,酶分子侧链基团的化学修饰,丹璜酰氯,氨基的化学修饰（赖氨酸）,酶分子侧链基团的化学修饰,羧基的化学修饰（谷氨酸、天冬氨酸）,碳二亚胺,硼氟化三甲烊盐,巯基的化学修饰（半胱氨酸）,5,5/-二硫代 双（2-硝基苯甲酸）,4,4/-二硫二吡啶,对氯汞苯甲酸,N-乙基 马来酰亚胺,2-氯汞-4-硝基苯酚,巯基的化学修饰（半胱氨酸）,组氨酸咪唑基的化学修饰,碘乙酸,焦碳酸二乙酯,酶分子侧链基团的化学修饰,精氨酸胍基的化学修饰,丁二酮,1,2-环己二酮,丁二酮,1,2-环己二酮,苯乙二醛,精氨酸胍基的化学修饰,酶分子侧链基团的化学修饰,色氨酸吲哚基的化学修饰,2 羟基 5-硝基苄溴,4-硝基苯硫氯,酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰,N-乙酰咪唑,酶分子侧链基团的化学修饰,丝氨酸残基-二异丙基氟磷酸酯,四硝基甲烷,酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰,甲硫氨酸残基的化学修饰,甲硫氨酸亚砜,过甲酸,碘乙酰胺,采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶的性质发生改变，以满足人们的需要。,常用的大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。,常见的修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。,酶分子表面的化学修饰,第一节 酶分子的化学修饰,聚乙二醇对酶的修饰（单甲氧基聚乙二醇MPEG）,MPEG均三嗪类衍生物,MPEG1,MPEG2,聚乙二醇对酶的修饰（单甲氧基聚乙二醇MPEG）,MPEG氨基类衍生物,蜂巢型MPEG,聚乙二醇对酶的修饰（单甲氧基聚乙二醇MPEG）,第一节 酶分子的化学修饰,右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶的修饰,右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上的羟基经活化后可与酶分子上的氨基结合。,（右旋糖酐）,羟基活化-溴化氰法,羟基活化-高碘酸氧化法,糖肽对酶的修饰,异氰酸法,戊二醛法,具有生物活性的大分子对酶的修饰,肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量20000左右。,肝素增加酶的稳定性，由于肝素在体内还具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，极适合用来修饰血栓溶解酶而增加其疗效。,碳二亚胺法,三氯均嗪法,蛋白质或其他大分子对酶的修饰,修饰剂：人血清白蛋白,修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法,活化酯法,琥珀酸酐,影响酶化学修饰的因素,反应时间的影响,分子量的影响,pH对化学修饰的影响,修饰剂与酶的用量之比对修饰效果的影响,温度的影响,第一节 酶分子的化学修饰,修饰酶的性质,修饰酶的稳定性得到提高-热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。修饰酶的抗原性得到降低-PEG和人血清白蛋白效果明显。修饰酶的半衰期得到延长-保持药用酶的体内疗效修饰酶的最适pH变化-在生理和临床应用上具有重要意义。修饰酶的动力学性质-Vmax没有变化，有些Km会增大。,第一节 酶分子的化学修饰,概述,模拟天然酶（生物酶）的结构、特性、作用原理及其在生物体内的化学反应过程，人工合成的具有分子识别和催化能力的化合物质，称为模拟酶,天然酶的缺点：很容易受到多种物理、化学及生物影响而失活。,第二节 模拟酶,目前模拟酶的研究方向：,模拟酶的金属辅基。,模拟酶的活性功能基。,模拟酶的高分子作用方式。,模拟酶与底物的作用。,模拟酶的性状。,第二节 模拟酶,酶学基础：Pauling的稳定过渡态理论酶先结合底物，进而选择性地让底物稳定处于某一特定反应的过渡态，降低反应的活化能，从而加速反应速度。,模拟酶的理论基础：,第二节 模拟酶,超分子化学基础-Pederson、Cram、Lehn提出：超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范德华力等。,模拟酶的理论基础：,第二节 模拟酶,模拟酶的分类,主-客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物 分子印迹酶 抗体酶胶束酶模型肽酶半合成酶。,根据模拟酶的属性可分为：,第二节 模拟酶,环糊精是直链淀粉在芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有612个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精中各葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，空间结构呈锥形圆环。环糊精外缘亲水而内腔疏水，因此能像酶一样提供一个疏水的结合部位。,环糊精模拟酶,第二节 模拟酶,环糊精,葡萄糖单元的数量不同可分为(6个)，(7个)及(8个)环糊精三种，,每个葡萄糖残基均呈现无扭曲变形的椅式构象，葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，内有空穴，疏水。外缘亲水,环糊精模拟酶所具有的催化作用（活性）：水解酶活性 核酸酶活性 转氨酶活性 桥联欢糊精仿酶氧化和水解酶活性,环糊精模拟酶,第二节 模拟酶,大环聚醚按结构可分为：冠醚、穴醚、球醚。冠醚是指含杂原子的单环化合物，穴醚是指含杂原子的双环化合物，球醚是指含有杂原子的球状大环醚。大环聚醚模拟酶的活性：水解酶活性肽合成酶活性,大环聚醚及其模拟酶,第二节 模拟酶,Lehn,杯芳烃是由苯酚及其衍生物与甲醛缩合而成，分子上缘由苯环的对位取代基组成，下缘紧密排列着酚羟基，中间是苯环构成的富含电子的疏水空腔，其上缘亲油，下缘亲水，可与中性分子和极性离子等多种物质结合。模拟水解酶活性。,杯芳烃及其模拟酶,第二节 模拟酶,金属卟啉可以模拟以金属离子为辅基或辅酶的天然酶。卟啉是含有四个吡咯分子的大环聚合物，主要骨架是卟吩。金属卟啉分子具有以共轭大电子体系，金属原子价改变为基础的氧化还原性质，因而可作为与分子氧有关的氧化还原酶的模拟酶。,金属卟啉及其模拟酶,第二节 模拟酶,肽酶是模拟天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。环肽在分子识别方面更具有优势。,肽酶,1977年人工合成的八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe具有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可达到天然酶的50%。,第二节 模拟酶,抗体酶的催化特性,具有催化化学反应能力的单克隆抗体，称为抗体酶，又称为催化性抗体。,抗体酶的理论基础及研究背景,酶的催化机制：过渡态理论。（1946，Pauling）,免疫诱导产生底物过渡态的抗体，抗体具有催化性能（1969，Jencks）,单克隆抗体技术发展。（1975，Kohler,Milstein）,第一个催化酯水解的抗体酶。（1986，Lerner,Schultz）,第三节 抗体酶,抗体酶的特点,能催化一些天然酶不能催化的反应有更高的专一性和稳定性催化作用机制不同。,抗体酶和非催化抗体作用的比较,反应的特异性反应的可逆性反应的量效关系反应过程。,第三节 抗体酶,抗体酶的催化作用机制,过渡态理论,抗体酶的催化反应类型,转酰基反应,磷酸酯水解反应,磺酸酯闭环反应,Claisen重排反应,脱羧反应,金属螯合反应,第三节 抗体酶,抗体酶的制备原则,利用某一反应过渡态的类似物作为免疫原，则可诱导得到催化该反应的抗体酶。过渡态类似物结构稳定，可化学合成。,目前制备抗体酶的主要步骤：根据催化目的，通过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备具有催化活性的单克隆抗体。抗原的设计是制备抗体酶的关键。策略：利用抗体稳定带电过渡态抗体作为熵阱抗体静电互补效应,第三节 抗体酶,目前制备抗体酶的主要方法：根据催化目的，通过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备具有催化活性的单克隆抗体。拷贝法化学诱变法。蛋白质工程技术。相似分子诱导法。共价抗原免疫法。,抗体酶的制备方法,第三节 抗体酶,利用过渡态类似物制备抗体酶,抗体酶的制备方法,第三节 抗体酶,使不可能发生的化学反应称为可能。使苛刻条件下的化学反应在温和条件下实现。选择性的催化平行反应中的某一反应。制备蛋白质氨基酸序列快速分析的抗体酶。制备水解病毒蛋白的抗体酶。指导未知酶的寻找。为化学反应的机理研究提供依据。,抗体酶的应用前景,第三节 抗体酶,分子印迹的原理,以一种分子作为模板，在其周围用聚合物交联，当除去该分子时，聚合物中间留下与该分子形状相同的空穴，这种空穴就有可能对该分子具有选择性识别结合的能力。该化合物分子叫印迹分子，也叫模板分子。聚合物称为分子印迹聚合物。制备对某一化合物分子具有选择性识别结合的聚合物的过程称为分子印迹（技术）,第四节 印迹酶,分子印迹的原理,第四节 印迹酶,选定印迹分子和功能性单体，使二者发生互补反应；在印迹分子功能性单体复合物周围发生交联聚合；用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。,分子印迹技术的一般过程：,第四节 印迹酶,分子印迹技术的分类,预组织法,又称共价法。印迹分子先通过共价键与功能性单体结合，聚合后再将共价键断裂除去印迹分子。功能单体：含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚、醇等。共价化合物：硼酸酯、亚胺、希夫碱、缩醛酮等。,特点：结合基团定位精确，对印迹分子选择性高；共价键结合较牢固，对印迹分子的识别和解离较慢。,第四节 印迹酶,又称非共价法。印迹分子与功能性单体自组织排列，以非共价键自发形成具有多个作用位点的复合物。功能单体：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基的苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶类化合物。甲基丙烯酸,特点：操作简单易行，印迹分子易除去，分子识别过程更接近天然的分子识别系统，可同时采用多种功能单体，增加印迹效果；功能单体过量，选择性下降。,分子印迹技术的分类,自组装法,第四节 印迹酶,聚合时，印迹分子与功能基团共价结合。识别时，印迹分子与功能基团非共价结合。,金属离子配位方法,印迹分子-金属离子-功能单体三维复合物进行交联聚合。金属配位作用的强度可通过EDTA简单变换金属离子的种类实现对印迹分子聚合物亲和能力的灵活调节。,分子印迹技术的分类,自组装和预组织相结合的方法,第四节 印迹酶,分子印迹聚合物的制备,功能性单体：羧酸类化合物（甲基丙烯酸、丙烯酸、乙烯基苯甲酸）、磺酸及杂环弱碱类（乙烯基吡啶、乙烯基咪唑），最常用的体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。,交联剂：丙烯酸类交联剂（二亚乙基丙烯酸）,溶剂：溶剂极性越大，产生的识别效果越弱（甲苯，二氯甲烷）,低温聚合：可提高分子印迹聚合物的分辨力。,分子印迹聚合物形态：快、珠、薄膜、表面印迹、固定容器内就地聚合。,第四节 印迹酶,分子印迹酶,具有催化能力（作用）的分子印迹聚合物称为分子印迹酶。,印迹底物及其类似物。,印迹过渡态类似物。,表面印迹过渡态类似物。,第四节 印迹酶,Wulff研究小组充分考虑结合态和定向引入催化基团对催化的作用,印迹磷酸单酯,脒基,思考题1 简述酶分子化学修饰的基本原理，及酶化学修饰方法。2 酶分子被修饰后在性质上有哪些变化？3 酶分子的哪些侧链可以被修饰？4 为什么环糊精及其衍生物可以作为模拟酶模型，该模型与大环冠醚模拟酶模型有何区别？5 简述抗体酶催化的反应类型有哪些？6 抗体酶有何特性？7 简述分子印迹的基本过程。,