第十三章 转基因动物ppt课件.ppt
第十二章 转基因动物,转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。,（一）转基因动物的概念 转基因动物（transgenic animal）是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种动物叫转基因动物。严格说，转基因动物有别于嵌合体。嵌合体动物（chimeric animal）：只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。,Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序TGM。1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。,After Dolly,继“多莉羊”之后：,13岁成年牛,转基因无毛鼠,异体动物克隆-北山羊,黄禹锡学生克隆成功的阿富汗猎狗,在韩国首都汉城的汉城大学，世界上首只克隆狗-小猎犬斯纳皮首次公开亮相。,克隆兔在广西大学诞生,美国加州的一家公司可为顾客克隆其宠物,二、转基因动物技术的主要步骤,获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物,三、转基因动物的技术路线,经典的技术路线 目的基因 显微注射已交配的 取出 移植 受体动物 妊娠供体动物 受精卵 输卵管 转基因动物 缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。,转基因动物的技术路线(续),整合胚胎移植的技术路线 转基因动物 受体动物子宫 目的基因 非手术 胚胎移植 体外受精 体外培养 多细胞胚胎 检测 整合外源基因卵子 受精卵 或囊胚 的胚胎精子优点：受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高，提高受孕率。,转基因动物的技术路线（续）,核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物 导入 动物胎儿成纤维细胞 妊娠 取核动物 去核 重组的 体外培养 囊胚期 胚胎移植 卵细胞 受精卵 胚胎 受体动物子宫特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。,转基因动物的技术路线（续）,整合卵受精的技术路线：目的基因 转基因动物 导入 逆转录病毒 妊娠 精子 感染 体外受精 胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。,四 转基因动物的制作方法,1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载体法6、YAC法,1、雄原核显微注射法,以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。,这一方法的实验程序如下：（1）准备假孕母鼠（养母）（2）受精卵的准备（3）基因导入（4）胚胎移植（5）对幼鼠的鉴定,Timing of Pre-Implantation events,Oviduct Transfers,优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默,2、胚胎干细胞（ES细胞）法,ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。,Generating ES Cells,Retrieval of Blastocysts,Injection of ES cells into blastocysts,优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,五 转基因动物的特性,整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相连接的形式存在。整合是随机的。整合是稳定的，可以传给子代。外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。少数外源基因两侧序列有重排现象。基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应”有关。,六 转基因动物的意义,转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究：基因表达有时空与组织的特异性；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表现调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究。也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要。还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。,免疫缺陷动物（Immunodeficient animal）,（一）定义：是指由于先天性遗传突变或用人工方法,造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。（二）分类：1、先天性免疫缺陷动物：a.T淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠 b.B淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠 c.NK细胞功能缺陷动物：Beige小鼠 d.联合免疫缺陷动物：SCID小鼠等2、获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠、猫等AIDS模型,（三）裸小鼠（Nude Mice）,1、发现与发展,1962年英国格拉斯哥医院Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛。1966年证实是由于第11对染色体基因突变所致。1968年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。和纯系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（Inbred Nude Mice）新种。1969年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。,2、生物学特点,（1）一般特点纯合子突变裸鼠（nu/nu）主要表现为无毛以及胸腺缺陷。杂合子小鼠（nu/+）各方面表现正常。体重小于同龄普通鼠，发育缓慢。必须养育在SPF环境中。繁殖方式：一般采用隐性纯合子雄性与杂合子雌鼠交配（nu/nunu/+）。,（2）解剖生理特点,胸腺残留一些上皮样细胞；淋巴组织胸腺依赖区的淋巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。虽然有原始的T细胞，但缺乏成熟的T细胞。T细胞的辅助，抑制及杀伤功能不全。在混合淋巴细胞反应中无有丝分裂反应，对刀豆素A或植物凝集素P无促分裂原应答。无接触敏感性，无移植排斥，无移植物 抗宿主反应。B细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是IgM，只有少量IgG。粒细胞功能较低，NK细胞活性高。,BALB/c-nu的胸腺,昆明小鼠的胸腺,3、裸鼠的应用,裸鼠在肿瘤研究上的应用：制作人类肿瘤移植瘤模型人类肿瘤移植于动物的历史免疫排斥问题眼前房，脑内，地鼠的颊囊等免疫逃避部位免疫抑制剂、射线照射的使用裸鼠作为人类肿瘤受体,肿瘤移植瘤模型在肿瘤基础研究中的意义添加人为因子（致突变剂，癌基因，药物等）观察肿瘤 病因及机理和治疗。建立肿瘤细胞株：提供大量肿瘤组织供分析。诊断和预后：建立平行模型，明确诊断和 跟踪预后。个体化疗有效试验：对于晚期和复发肿瘤有重要意义。药物有效的标准：1.肿瘤不生长；2.肿瘤生长缓慢；3.肿 瘤长出后又消失；4.肿瘤无转移；5.动物寿命延长。,肿瘤移植瘤模型制作方法,肿瘤组织块或肿瘤细胞皮下移植腹腔内或肾包膜下移植原位移植,移植瘤模型成功制作的影响因素：,肿瘤组织：恶性程度：恶性和转移复发瘤成功率较高 种类：细胞系成功率活检标本 来源：淋巴瘤、骨肿瘤等难获成功 部位：肿瘤块的外周部接种易成活裸鼠：遗传背景：胰腺癌接种BALB/c 成功，NIH系失败 性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢 鼠龄：4-6周 动物健康状态,接种部位：原位移植成功率高，移植肿瘤与人类原发瘤相似。有些肿瘤需要接种在特定的部位（对雌激素依赖的人乳腺癌MCF-7细胞系，接种乳腺脂肪垫才能成活）。其他：环境：细菌病毒可以影响NK细胞活性；接种时间越早越好，注意无菌操作。（2）裸鼠在医学其他领域的应用：免疫学：研究体液免疫与细胞免疫的关系，研究免疫相关疾病寄生虫：寄生虫感染的动物模型，美洲锥虫，卡氏肺囊虫皮肤：鱼鳞病免疫缺陷模型：麻风，结核,严重联合免疫缺陷小鼠（Sever Combined Immunodeficient Mice,SCID mice）,1983年Bosma首次报告，来源于C.B-17小鼠。由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响B、T细胞的正常功能分化。1988年我国医科院动物所从美国Jackson实验室引进；,1、生物学特点：,外观体重与普通小鼠相同。繁殖特点：纯合子兄妹交配。对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡。必须养育在SPF环境中，平均寿命1年以上。2、组织解剖学特点：脾脏、胸腺、淋巴结体积低于普通小鼠的30%，淋巴组织缺乏淋巴细胞。（胸腺残留上皮样细胞和成纤维细胞，脾脏没有脾小体，白髓缺限，红髓正常，淋巴结由网状细胞构成。）外周血白细胞总数减少，淋巴细胞占1020%，非淋巴性造血细胞如粒细胞，巨噬细胞正常，NK、LAK细胞正常。,3、免疫功能特点：,没有B、T 阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫。NK、LAK细胞功能正常或增高；肥大细胞因缺乏T细胞因子而分化受阻。约2-23%的SCID小鼠在青年期B、T细胞功能可以恢复，称为渗漏（Leaky），此时仍带有SCID基因，淋巴细胞不受影响而发育成熟，原因不明，可以用血清学和组织学方法诊断。4、SCID小鼠的应用用于自然防御细胞如NK、LAK、巨噬细胞、粒细胞，及免疫辅助细胞的分化和功能研究，也可以研究这些细胞与输入的B、T细胞、淋巴因子的相互作用。能接受人类造血组织的移植，是淋巴细胞分化功能的活体测试系统，可以用于评价人各类淋巴细胞的抗肿瘤活性。肿瘤接种成活率比裸鼠高。何杰金氏淋巴瘤，白血病模型寄生虫：人血丝虫病,转基因动物作为食物引起的社会反响,1 欧洲和美国的态度截然不同 知识宣传 政府支持 宗教问题2 中国和日本 起步阶段 仍需宣传,关于转基因动物安全性,一 对自然界基因库的影响二 对人类健康的影响 输入人生长激素基因的猪的生长速度和出肉量都比普通猪高一倍，但却百病缠身，人类食用后是否有损于健康迄今全然不知。应特别注意并谨慎对待以下几种情况；1 涉及人类转基因问题2 转基因鱼类的制作与释放3 转基因昆虫的制作与管理4 各类转基因小动物疾病模型的制作和管理,特殊动物基因资源的保护,中国的国宝-大熊猫 中国长江的河豚 美国野黄牛,器官移植,据现有的考古发现，人类开展移植手术的时间可以追溯到史前时期的青铜器时代。考古学家们在一具出土的史前人类的颅骨上，发现了颅骨环切术的痕迹，并且十分清楚地看见，在这个史前人类颅骨的缺损部，一块移植骨恰到好处的填补了这一部位。,尽管在该标本上，颅骨的手术切口没有愈合，而且显然导致了该史前人的死亡，然而，大量的文献资料和考古证据都足以说明，远古时代所施行的这些颅骨环切修补术，具有一定程度的治疗作用。,现代的器官移植是从肾移植开始的。最早的肾移植是在1936年，一位前苏联医生沃罗诺夫将一个尸体的肾脏移植到一位汞中毒的病人体内。病人是一位年仅26岁的青年人，由于肾衰竭已经病入膏肓，无药可救。于是沃罗诺夫给他做了手术，但是一直没有获得成功，病人在48小时后死去了。,器官发生了排斥，怎样解决呢？,1954年，美国波士顿的莫雷医生，为一位21岁的女病人进行了肾移植，用的是她同卵双生姐姐的一只肾。病人患有严重的肾炎，在生命垂危之际接受了这项珍贵的卷，成为异体移植成功并且长期存活的第一位病人。后来，这对双胞姐妹都成了几个孩子的母亲。莫雷因此获得了诺贝尔生理学医学奖。这是器官移植史上的一个重要的里程碑，前百年来人类的幻想终于变成了现实。,心脏移植,1967年12月3日，一位25岁的年轻女子不幸死于车祸，她的心脏却完好无损。这件突发的事件，给45岁的南非医生巴纳德带了一次成功的机会。当天，他为一名54岁的商人成功地作了人类首例异体心脏移植手术。这位病人患有晚期动脉硬化性心脏病，心脏移植是挽救他生命唯一可能的方法。巴纳的一生的手术成功了，病人手术后顺利地度过了17天，虽然由于肺炎最终夺取了他的第二次生命，但是，这在人类器官移植史上毕竟是一个里程碑式的伟大成就。,不久，巴纳德又为第二名病人移植了心脏。这一次，病人存活了18个月。1971年，他为一位心脏病人做的手术非常成功，病人换心后，居然又活了20多年，一直到1994年七月，才因中风去世。巴纳德熠熠生辉的创举，不仅为自己竖起了一座丰碑，也标志着在世界医学的领域中，人类又开辟了一块新大陆。,肾移植的成功，标志着器官移植进入了临床应用阶段，也推动了器官移植的发展。于是，医学界上出现了大量使用亲属肾进行移植的手术，病人术前都要接受免疫抑制治疗。这个时期的医学人才辈出，捷报频传。1963年，肝移植和肺移植先后获得成功，1966年胰腺移植也取得了成功。,人数众多 至今全世界不下20万人接受了肾移植，并以每年2万例的速度增加着；1963年开始的肝移植到90年代已超过了14000例，最长存活者已超过了20年；心脏移植，根据国际移植中心统计已达12631例，即美国截至2000年大约就有2300人接受了心脏移植手术，并且有70%的患者生存时间至少有4年；肺移植自1967年哈斯利医生首次进行以来，至1995年止，全世界已有3809例。,我国的情况 在中国，器官移植始于20世纪50年代末，研究人员先是在动物身上做了大量的实验，然后在60年代由吴阶平教授在国内率先开展了肾脏移植手术。到70年代末，中国器官移植就开始加快了步伐，至90年代中期已有近2万人接受了器官移植。现在，中国许多大医院都能实行肾脏移植手术，仅2001年中国就做了肾移植手术5500多例次,难度更大的肺脏移植发展就比较缓慢。据报道，自1993年以来，在中国大陆共实行单肺移植8例，双肺移植2例。接受肺脏移植存活最长者，当数北京安贞医院做的单肺移植患者，存活了五年11个月，患者最后死于急性肝萎缩和霉菌性肺炎；安贞医院做的另一例双肺移植到2002年初时仍健在，当时已存活了3年9个月，也是国内唯一存活的肺脏移植患者。,关于器官移植 的伦理学问题,案例一,1998年10月北京某医院眼科博士，在准备为两位失去视力的眼疾病人移植角膜时，发现储存的角膜已经坏死。于是他进入停尸房将一女性尸体的角膜摘除，换上异眼，未告知死者家属，未获得家属同意。在火葬前家属发现死者角膜已被摘除，将医生告上法庭，控告他犯盗尸罪。1999年三月初北京市西城区人民检察院做出了对这位医生摘取尸体眼球一案不予起诉的决定。,案例二,有一个病人甲因多年酗酒，肝脏功能衰竭，急需移植肾。另一青年乙因抓歹徒被歹徒刺伤肝脏，也急需移植。正好有一肾可供移植，而且组织配型与这两位病人也正好相容。甲经济条件好，付得起肝移植费用；而乙是待业青年，无力负担移植费用。,克隆动物生产费用,多莉78万英镑成功率0.36%,进行克隆研究的主要单位,中国科学院发育生物所中国科学院动物所中国农业科学院畜牧所西北农林科技大学东北农业大学广西农业大学扬州大学华南师范大学,
