第八讲DNA甲基化与组蛋白修饰ppt课件.ppt

DNA甲基化与组蛋白修饰,佳木斯大学2010/03,基因表达模式,一个多细胞生物机体的不同类型细胞,相同的基因型,不同的表型,表观遗传是指在DNA序列没有发生变异的情况下，基因表达的可遗传的改变。它主要通过对DNA或组蛋白的共价修饰（如DNA甲基化，组蛋白乙酰化），同源性的基因沉默（即一个基因被另一个与其同源的基因所抑制），副突变(paramutation)和亲本印迹，RNA编辑，蛋白异构体引起类似显性遗传等机制而产生的。,表观遗传修饰,DNA甲基化(DNA methylation)组蛋白修饰(histone modifications)染色质重塑(chromatin remodeling)基因组印记(genomic imprinting)RNA相关沉默(RNA interference)隔离子(insulator)、边界(boulidary)、核区室化(compartment)副突变(paramutation)位置效应(position effect variegation)X染色体剂量补偿(X-chromosome dose compensation),提 纲,组蛋白的甲基化；组蛋白的乙酰化；组蛋白乙酰化的生物学意义；DNA甲基化；DNA甲基化与医学。,在最近的几年，我们对异染色质的认识有了长足的进展，发现一些生化修饰对于异染色质的形成及其逆转和DNA的转录起到关键作用。这些修饰主要包括组蛋白修饰（包括甲基化、乙酰化、磷酸化等）和DNA的甲基化。,核小体是真核细胞染色质的基本结构单位。每个核小体由4种核心组蛋白构成异源八聚体和缠绕在八聚体之外的约 200bp 的DNA组成。这种结合是依靠作用于DNA磷酸骨架小沟区的静电引力来实现的。由于静电引力的作用，DNA链围绕组蛋白形成螺旋和扭曲，这恰好使DNA双螺旋的小沟区连成一条沟道，组蛋白弯曲的尾巴得以穿过其中，于核小体外与DNA作用，更加稳定了核小体的结构。,但是，核小体的结构也成为各类转录因子与DNA结合的主要障碍。越来越多的实验证据表明，染色质和核小体构型的改变在转录的起始中起到重要的调控作用。现已知有种机制参与染色质构型的改变：依赖于ATP的染色质重构；组蛋白移位；染色质的共价修饰（covalent chromatin modification）。,其中染色质的共价修饰既可发生在DNA 上也可发生在组蛋白上。DNA的修饰主要是胞嘧啶的甲基化，而组蛋白的共价修饰则包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP核糖化，由此构成多种多样的组蛋白密码。不同的调节机制间互相串换，以一种共同协作的状态来完成对染色质结构的调控。,组蛋白的翻译后修饰,组蛋白的甲基化（methylation）；组蛋白核糖基化(ribosylation)；组蛋白的乙酰基化（acetylation）；组蛋白磷酸化（phosphorylation）；组蛋白泛酸化（obiquitination）。,每个组蛋白都有进化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。,组蛋白乙酰化去乙酰化,在真核生物染色质核小体中的组蛋白，其N末端氨基酸残基可发生乙酰化等共价修饰。组蛋白的乙酰化是一可逆的动态过程，而其稳定状态的维持则是多种组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和去乙酰基酶（HDACs）共同作用的结果。这种可逆的乙酰化修饰作用可使染色质结构发生动态的改变，并对基因的转录产生相应的影响。,赖氨酸,引入乙酰基,乙酰基转移酶,去乙酰化酶,组蛋白乙酰化对染色质结构及基因转录的影响,组蛋白乙酰化引起染色质结构改变及基因转录活性变化的机制至少包括以下几个方面：组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化能够使组蛋白携带正电荷量减少，降低其与带负电荷的DNA链的亲和性，导致局部DNA与组蛋白八聚体解开缠绕，从而促使参与转录调控的各种蛋白因子与DNA特异序列结合，进而发挥转录调控作用；,组蛋白的末端尾巴可与参与维持染色质高级结构的多种蛋白质相互作用，更加稳定了核小体的结构。而组蛋白乙酰化却减弱了上述作用，阻碍了核小体装配成规则的高级结构（如螺线管）；组蛋白乙酰基转移酶对相关的转录因子或活化因子进行乙酰化修饰以调节基因的表达。,局部乙酰化和广泛乙酰化模式,组蛋白乙酰化状态呈多样性。与启动子结合的激活因子可募集相应的HATs引起局部组蛋白的乙酰化；而增强子或基因座位控制区LCR结合的活化因子则可募集HATs引起广泛乙酰化。广泛乙酰化使组蛋白维持在一个较高的乙酰化水平，干扰染色质高级结构的折叠，使其不能形成紧密的结构。因此推测，广泛乙酰化为基因表达建立了一个稳定的基础；而局部乙酰化则是基因对细胞外信号的瞬时反应。,组蛋白去乙酰基酶,组蛋白乙酰化为一可逆过程，乙酰化和去乙酰化的动态平衡控制着染色质的结构和基因表达。迄今为止，已有很多种类的组蛋白去乙酰基酶（HDACs）在不同的物种中被鉴定出来，它们具有不同的功能。人的HDACs主要分为3类。HDACs与HATs一样也存在于复合物中，复合物形式可调节其本身的酶活性。,HDACs在转录抑制中具有重要作用。HDACs抑制基因转录的分子机制主要是靠某些转录因子与DNA序列结合后，募集HDACs 并与之形成转录复合物，HDACs作用于相应的组蛋白而调节基因转录。虽然HDACs主要抑制基因的转录，但最近的研究显示酵母的第一类去乙酰基酶Hos2参与基因的活化。,在真核细胞中，组蛋白乙酰化去乙酰化对染色质结构及基因转录的调控可能是一个多层次、多步骤的复杂过程。对这一领域的研究对于进一步阐明基因表达调控的机制，明确肿瘤等相关疾病发病的分子机制以及治疗方法等方面有着重大的意义。,组蛋白的甲基化,组蛋白的甲基化（histone methylation）由组蛋白甲基转移酶介导催化。甲基化修饰通常发生在组蛋白的N端尾部结构域。甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X 染色体失活和转录调控方面。最重要的效应之一就是导致基因的转录功能丧失。甲基化位点多位于H3、H4的赖氨酸和精氨酸残基上，组蛋白H3氨基尾段上的K4和K9便是其中的两个甲基化的常发位点。不同位点上甲基化，由不同的酶所负责。,目前发现24 个组蛋白甲基化位点，其中17 个位于赖氨酸，其他7 个位于精氨酸。赖氨酸可以是单甲基化、双甲基化和三甲基化，精氨酸也可以是单甲基化或者双甲基化。如果把这3 种甲基化状态都考虑在内，应该一共有31011种组蛋白甲基化组合状态，复杂的组合为组蛋白甲基化发挥功能调控作用提供更大的潜能。,过去发现一些组蛋白可以快速的乙酰化，然后又去乙酰化以使基因表达受到调控。但是，人们一直都认为甲基化作用是一种不可逆的过程。最新的研究发现，甲基化作用是可逆的，组蛋白可以发生去甲基化作用。有一种酶会对组蛋白中赖氨酸和精氨酸甲基化作用进行去除。这重新定义了组蛋白甲基化的本质，同时也让组蛋白修饰通路更加复杂化了。,哈佛大学的分子生物学家施洋及其同事在2004年12月16日的细胞杂志网络版上报告：他们发现了一种组蛋白去甲基酶，命名为赖氨酸特异性去甲基酶1(LSD1)(lysine-specific demethylase 1)。这种酶能使某种组蛋白尾部的一个氨基酸-赖氨酸失去甲基。某些类型的白血病、结肠癌等疾病，被认为可能与错误的甲基化过程有关，组蛋白去甲基酶可能成为颇有潜力的药物标靶。,甲基转移酶,去甲基酶使组蛋白失去甲基,Shi Y J,Lan F,Matson C,et al.Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.Cell,2004,119(7):941953,SET 结构域存在于许多与肿瘤发生相关的人类基因之中。过去10年的研究发现，具有此结构域的基因多数都发挥肿瘤抑制的功能。最近发现组蛋白甲基转移酶也具有SET结构域，那么很自然地推测组蛋白甲基转移酶是否也具有肿瘤抑制的功能？,组蛋白甲基化与疾病,RIZ1(PRDM2)具有H3K9 位甲基转移酶活性。研究发现，在某些肿瘤中，例如：乳腺癌、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、脊髓瘤、肺癌和骨肿瘤中，该基因发生突变而失去活性，而其失活又引起G2-M 期的细胞周期延长，调亡抑制，因此推测H3K9位组蛋白甲基转移酶可能具有肿瘤抑制功能，它的功能缺失可能参与癌症的发生有关。,最近，美国一项临床研究发现，组蛋白甲基化在前列腺癌患者标本中比例很高，估计其他肿瘤中也可能有相似发现。另外，还有报道缺乏甲基的饮食会导致组蛋白甲基化程度低，这类人群发生肿瘤的比例较正常人群高.这也提示组蛋白甲基化可能与肿瘤发生有关。,组蛋白甲基化研究尚处起步阶段，不同甲基化位点的具体功能还没有明确。组蛋白甲基化与其他表观遗传学修饰方式的关系尚未涉及。异常甲基化与肿瘤和其他疾病的关系也未阐明。缺乏甲基的饮食导致肿瘤的具体机制依然不清楚。组蛋白去甲基化酶的具体功能和作用机理仍需进一步探讨，其他新的去甲基化酶也丞待发。随着组蛋白甲基化研究的深入，必将为分子生物学、遗传学和肿瘤学的发展提供新的思路。,组蛋白密码,染色体的多级折叠过程中，需要DNA同组蛋白(H3、H4、H2、H2B和H1)结合在一起。研究中，人们发现组蛋白在进化中是保守的，但它们并不是通常认为的静态结构。组蛋白在翻译后的修饰中会发生改变，从而提供一种识别的标志，为其它蛋白与DNA的结合产生协同或拮抗效应，它是一种动态转录调控成分，称为组蛋白密码(histonecode)。,所谓组蛋白密码就是对结合DNA的组蛋白进行一系列修饰,从而影响某些基因何时以及以何种方式被打开或关闭。组蛋白密码信息存在于转录后组蛋白修饰等过程中，这些修饰的多样性、整体性及生物学功能的多样性表明存在这样一种组蛋白密码。组蛋白修饰作为一种重要的表观标志，与其他表观标志之间也存在一定的联系，构成了一个复杂的网络。组蛋白密码大大丰富了传统遗传密码的信息含量。组蛋白氨基末端的多样化修饰扩充了遗传密码的信息库。,这种常见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等等，它们都是组蛋白密码的基本元素。与DNA密码不同的是，组蛋白密码在动物、植物和真菌类中是不同的。我们从植物细胞保留有发育成整个植株的全能性和去分化的特性中，就可以看出它们在建立和保持表观遗传信息方面与动物是不同的。,在组蛋白的修饰中，乙酰化、甲基化研究最多。乙酰化修饰大多在组蛋白H3的Lys 9、14、18、23和H4的Lys 5、8、12、16等位点。对这两种修饰结果的研究显示，它们既能激活基因也能使基因沉默。甲基化修饰主要在组蛋白H3和H4的赖氨酸和精氨酸两类残基上。研究也显示，在进化过程中组蛋白甲基化和DNA甲基化两者在机能上被联系在一起。,每个组蛋白都有进化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。,一般来说，组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。乙酰化修饰和甲基化修饰往往是相互排斥的。在细胞有丝分裂和凋亡过程中，磷酸化修饰能调控蛋白质复合体向染色质集结。,细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都会涉及到染色质活性的改变，这一改变就是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现的。既然几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能反应相应的特定生物学过程。,组蛋白修饰的生物学意义,细胞对外在刺激作出反应，多数是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现的；染色质的转录活性与组蛋白修饰相伴；有丝分裂过程也与特异性组蛋白修饰有显著的相关性；组蛋白修饰还参与DNA损伤和凋亡。,研究组蛋白密码对药物开发具有战略意义，多种组蛋白修饰酶已成为相关疾病治疗的靶目标。比如，组蛋白去乙酰酶（HDACs）抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤；探讨遗传调控和表观遗传调控相互作用的网络与不同生物学表型之间的关系；,组蛋白修饰的生物学意义,DNA甲基化,DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的DNA修饰途径之一，也是DNA的一种天然修饰方式，广泛存在于细菌、植物和哺乳动物，具有重要的生物学意义。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。,甲基化所致的转录抑制的可能机制,DNA甲基化,甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段。在脊椎动物中，CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，人们将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛(CpG island)，通常长度在1kb2kb左右。,在真核细胞中，DNA甲基化使得胞嘧啶环5碳的位置添加一个甲基，这个发生在5-3序列(也称作CpG二核苷酸)中的反应受DNA(5-胞嘧啶)甲基转移酶methyltransferase,DNA MTase的催化。这是最常见的真核性DNA修饰。这种现象在植物和动物中都广泛存在，它在正常发育和组织特异的基因表达中起重要作用。,DNA甲基化的主要形式,胞嘧啶甲基化形成5-甲基胞嘧啶，腺嘌呤甲基化形成N6-甲基腺嘌呤和鸟嘌呤甲基化形成7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。,DNA甲基化的主要形式,胞嘧啶 5-甲基胞嘧啶腺嘌呤 N6-甲基腺嘌呤鸟嘌呤 7-甲基鸟嘌呤,5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤,7-甲基鸟嘌呤,在人类基因组DNA中，约34%的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在。大约7080的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核苷酸集中的区域称之为CpG岛，这些CpG岛跨过许多基因的5末端包括启动子、未翻译区和第一外显子。,CpG islands,由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CpG islands，大多位于转录单元的5区。,未甲基化的CpG岛与看家基因相关，而某些组织特异性基因会出现甲基化的CpG岛。DNA甲基化与人类细胞DNA的表达相关，建立在基因表达基础上的信息遗传被分类为表观遗传学，这与建立在基因序列基础上的信息遗传即遗传学不同。人类表观遗传学主要的改变就是定位在CpG岛内的胞嘧啶甲基化以及组蛋白的修饰。,DNA甲基化酶,催化DNA甲基化过程的是DNA甲基化转移酶（DNMT）。根据催化反应类型，可以将DNMT分为三类，但在高等真核生物中只发现了第三种类型的酶，即DNA C5胞嘧啶甲基转移酶，即通常所说的DNMT，又称DNA甲基转移酶，它可以催化将叶酸、甲基钴铵素等甲基供体提供的甲基集团转移至胞嘧啶5位碳上形成5-甲基胞嘧啶。,DNA甲基化转移酶,两种甲基化酶,DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT),真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型（mainte-nance）甲基转移酶，另一种是从头合成（denovo synthesis）甲基转移酶。前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。,日常型甲基转移酶,日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。,DNA甲基转移酶,将甲基转移至胞嘧啶环的酶称为胞嘧啶5-甲基转移酶或DNA甲基转移酶。1988年第一次从小鼠基因克隆出真核DNA MTase基因，称为Dnmt1，这个基因在真核生物中高度保守。DNA MTase作用的靶位点是DNA中回文结构的二核苷酸 C G(CpG)。,在新近复制的DNA分子中,DNA呈半甲基化状态，即亲链甲基化、子链未甲基化。哺乳动物DNA甲基转移酶与这种半甲基化底物有高度亲和性。在体外实验中也能够使未甲基化底物重新甲基化(de novo methylation)。,去甲基化酶,去甲基化酶(DNA demethylase，dMTase)有两种类型：位点特异性去甲基化酶和总基因组DNA去甲基化酶。两者是一致的，与发育和肿瘤发生中基因的活化有关。总DNA去甲基化酶与整个的去甲基化过程有关。,DNA甲基化状态通过从头甲基化、维持甲基化和去甲基化3个过程受到调节。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组DNA各CpG位点甲基化状态的差异构成基因组DNA甲基化谱，组织特异的DNA甲基化谱是哺乳动物基因组的显著特征。,组蛋白乙酰化和DNA甲基化,组蛋白乙酰化和DNA甲基化是调控基因表达的两种主要方式，目前认为组蛋白乙酰化和DNA低甲基化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化和DNA高甲基化可抑制基因表达。组蛋白乙酰化和DNA甲基化这两种分子机制相互协调，实现基因表达的精细调控。,DNA甲基化转移酶,组蛋白去乙酰化酶,DNA甲基化,去乙酰化组蛋白,染色质重塑,组蛋白的乙酰化状态控制DNA甲基化，组蛋白低乙酰化可促进DNA甲基化，组蛋白高乙酰化可抑制DNA甲基化。甲基化的DNA序列可募集HDACs，后者引起组蛋白去乙酰化，组蛋白去乙酰化又可引发DNA甲基化，这种模式导致一种稳定的基因抑制状态。组蛋白乙酰化和DNA甲基化这两种机制相互协调，实现基因表达的精细调控。,DNA甲基化生物学意义,在哺乳动物，甲基化是DNA最常见的复制后调节方式之一，是正常发育、分化所必需的，具有重要的生物学意义。DNA甲基化对生物遗传信息进行调节，在基因表达调控、发育调节、X染色体失活和基因组印迹等方面发挥重要作用，甲基化异常还与肿瘤发生有关。,DNA甲基化修饰的生物学功能,参与基因的表达调控 参与真核生物胚胎发育调节 基因组印记 X染色体的失活 与细胞分化和增生有关 DNA甲基化与肿瘤,(一)参与基因的表达调控,一般来说，DNA甲基化与基因表达呈负相关，甲基化可以抑制转录起始，但并不阻止转录的延伸。这种抑制需要关键位点的甲基化，并不需要全面的甲基化，也不存在启动子甲基化的阈值。但是，甲基化位点与转录起始点的相对位置对转录抑制是至关重要的。,DNA甲基化能抑制基因表达的机制可能是甲基DNA分子的大沟中突出，而大沟正是众多蛋白质因子与DNA结合的部位，这样就阻止了转录因子与基因的相互作用。DNA甲基化作为细胞核防御体系的组成部分，可以灭活一些潜在的危险DNA序列，抑制寄生序列和前病毒DNA的活动。,(二)参与真核生物胚胎发育调节,受精卵中来自亲本的两套染色体具有不同的甲基化图谱，但这些甲基化在发育过程中迅速丢失。及至桑椹胚时，所有被检测的CpG位点均已发生甲基化，这种状态一直维持到囊胚期。当发育到前肠胚时，上述位点又重新甲基化，并以此奠定了成体甲基化的基础。,这种在生物胚胎发育的不同阶段所发生的广泛去甲基化及随后发生的重新甲基化，可能是为了使胚胎消除其亲本特异的甲基化谱，这样才能使胚胎进入正常的发育阶段。DNA的甲基化的修饰可以使某些特定组织或特定细胞里的一些不必要的基因不表达。而在特定时期又可通过去甲基化的修饰来表达该基因，从而调节胚胎发育。,在哺乳动物的植入前发育中，卵母细胞和精子DNA上截然不同的遗传外标记被重塑成一种胚胎模式。早期胚胎的遗传外重新编程过程抹去了配子从亲本遗传下来的特异甲基化模式。这个基因的广泛去甲基化过程可能对多能干细胞的形成过程起关键性的作用，这些多能干细胞对以后的发育很重要。在植入后的发育过程中，又发生了重新甲基化，基因组DNA在限定的发育时间和特异的位点被甲基化。遗传外修饰的另一去甲基化/重新甲基化事件发生在生殖细胞发育期，这是重建基因组印记所必需的。,为使高度特化的精子和卵母细胞能重新恢复发育的全能性，或使那些已按分化途径分化为特定功能的体细胞恢复发育的全能性，遗传外重新编程是必不可少的，其中DNA的甲基化和去甲基化是重要的步骤之一。,（三）基因组印记,基因组印记(imprinting)是指基因保留其配子的某些特征并进行选择性差异表达，此与胚胎发育有关。大多数印记基因可以调节胚胎的生长和发育。印记功能的紊乱将导致多种发育异常甚至死胎。基因组印记的特征是亲本特异基因的表达，这种印记在生殖细胞发育过程中即已建立，以便用于区别印记基因的亲本来源。,基因组印记是一种特别的非孟德尔遗传现象，即来自双亲的等位基因在子代中的差异性表达，是遗传后的基因调控方式，主要与基因组甲基化模式有关，包括去甲基化、重新甲基化及甲基化维持三个过程。印记基因主要通过对启动子、边界元件及非编码RNA的作用来调控基因表达。基因组印记异常与一些先天性疾病相关，也与肿瘤发生和易感性有关。,雌核发育和雄核发育的胚胎均不能完成发育的全过程，雄核发育的胚胎生长不良，而胎盘发育较好；雌核发育的胚胎生长较好而胎盘发育不良，可以推测父源性印记基因促进胎盘生长而母源性印记基因有利于胚胎生长。在所有印记细胞中均发现有差异甲基化区，当DNA甲基化有缺陷或差异甲基化区缺失时，小鼠的印记也丢失。目前认为差异DNA甲基化是形成基因印记的种可能机制。,两个阶段,哺乳动物的发育存在两个大规模的遗传外重新编程的阶段。第一个发生在生殖细胞发育期，此时DNA甲基化的丢失是和发育中配子印记标记擦除和随后的重建有关的。第二个阶段发生在胚胎发育的植入前阶段，在这个阶段，尽管发生了DNA甲基化的大规模丢失，但是，印记的甲基化仍然保持。,(四)X染色体的失活,在雌性哺乳动物的体细胞中，X染色体的剂量补偿可用X染色体的失活来实现。X染色体的失活反映了染色体结构DNA甲基化模式的改变。当乙酰化的组蛋白H4缺失时，染色质是高度聚缩的，而且许多X染色体相连基因上结合的CpG是高度甲基化的，这种结构难以进行DNA的转录，从而引起女性X染色体的失活。,DNA甲基化和转录抑制,在大量的基因中观察到胞嘧啶甲基化与转录反相关，但其确切的作用机制尚不十分清楚。目前有三种可能的机制来解释DNA甲基化对转录的抑制：第一种是DNA甲基化直接参与干扰特异转录因子与启动子上各自识别位点的结合。第二种可能机制是直接使特异的转录阻遏物与甲基化的DNA结合。第三种机制是改变染色质结构。,(五)DNA甲基化与肿瘤,现已明确DNA的甲基化与肿瘤的发生有着密切的联系，DNA甲基化在肿瘤的发生和发展中扮演着极其重要的角色，其异常是通过影响癌基因和抑瘤基因的表达以及基因组的稳定性而参与肿瘤的发生和发展的。,近来人们发现肿瘤细胞的总基因组甲基化水平比正常细胞低，但是伴有某些特定CpG岛甲基化程度的增高。抑癌基因的高度广泛甲基化使DNA发生转录抑制，抑癌基因的不能表达参与了肿瘤的发生。近年来，癌基因和抑癌基因的甲基化与肿瘤的发生和发展之间的关系已成为肿瘤研究的另一热点。,癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化,肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低，这是癌变早期的一种分子异常现象。基因组范围的DNA低甲基化会增加染色体的不稳定性，促使原来处于沉默状态的基因如生长促进基因，特别是原癌基因的表达，促进细胞恶性转化。多种癌基因如c-raf、c-myc、c-fos等在肿瘤组织中普遍低甲基化，且随着肿瘤的发展低甲基化程度愈发明显，那些原癌基因甲基化程度更低的肿瘤表现出更大的恶性侵袭能力。,在肿瘤细胞总体甲基化水平降低的同时也伴有某些CpG岛甲基化程度升高，主要表现为调控基因启动子的异常甲基化，由此导致的调控基因的沉默是癌症产生的重要途径。如在循环系统的肿瘤细胞中就发现许多基因的过度甲基化，这导致肿瘤抑制基因、DNA修复基因和转移抑制基因的失活，并使这些基因成为突变靶点，失去对细胞周期和细胞分化的控制。,许多肿瘤细胞的p53基因由于其启动子区域(-199+142 bp)中15个CpG位点的甲基化而失去转录活性。肿瘤转移抑制基因Ecadhersn在乳腺癌和前列腺癌中的低表达也是启动子区高甲基化的结果。,DNA甲基化对生命过程非常重要，它是为人所熟知的基因外遗传信号。目前在肿瘤和基因紊乱性遗传病中，DNA甲基化处于中心环节，而且治疗的可能性也很明确，因为突变过程是经常发生的，而甲基化过程是可逆转的。,DNA甲基化与癌,DNA甲基化在肿瘤形成中起作用的假设已提出很多年。大量的研究显示肿瘤细胞中DNA甲基转移酶的活性出现异常，细胞中常有总DNA甲基转移酶活性增加，正常甲基化位点中的甲基化广泛丢失，更多区域的高甲基化。DNA甲基化可能以下列机制中的一种或多种对肿瘤形成起作用。,DNA甲基化机制,肿瘤细胞中突变 癌中的低甲基化 肿瘤抑制基因的高甲基化 诱导染色体的不稳定性 肿瘤中DNAMTase活性的改变,DNA甲基化与临床,DNA甲基化可作为肿瘤标记物 DNA甲基化可作为治疗的目标 DNA甲基化与药物耐受的逆转,DNA甲基化可作为肿瘤标记物,1、肿瘤早期诊断：不同的人体组织发现，肌肉或者肝脏中的同一种基因，其甲基化模式差异却非常明显。这一研究结果为DNA甲基化在不同组织上具有不同模式提供了“确定性的证据”。这也为肿瘤的早期诊断提供了一定的依据。而肿瘤早期诊断对肿瘤治疗非常重要。,以前肿瘤诊断主要集中在肿瘤特异性DNA的鉴定、分析。如抑癌基因的突变，由于突变位点的不确定性，限制了对肿瘤的广泛筛选。相比而言，DNA甲基化对肿瘤的诊断很有用，因为对于某一肿瘤，DNA甲基化变化不存在个体差异。利用MSP（methylation-specific PCR）就可建立一种高度敏感而且普遍实用的诊断方法。,肿瘤特异性DNA早期检测可利用非原发位点的标本，例如肺癌患者可以检测痰标本、前列腺癌患者可以检测尿标本。肿瘤患者血清还可以检测到大量的肿瘤 DNA。令人兴奋的是肺癌患者痰标本和癌组织，二个甲基化标记物中总有一个出现阳性，而且现有方法临床确诊的3年前，痰液里就可以检测到该肿瘤特异性甲基化变化。,2、DNA甲基化状态分析还可用于肿瘤的预测。血清游离肿瘤DNA，是肿瘤治疗监测的一种手段，而游离DNA甲基化检测同样可作为肿瘤形成过程和药物治疗的监测手段。,DNA甲基化可作为治疗的目标,虽然遗传性与外遗传机制对肿瘤的形成有相同的地位，由于对肿瘤形成的基本原理的差异，抗肿瘤治疗也就有潜在的意义。首先，遗传性的变化是固定的，基因的失活是不可逆转的，外遗传变化不影响基因序列，因而是可逆的。外遗传所致的基因失活可以从两个不同方面减轻：抑制DNA甲基化和抑制组蛋白的脱乙酰基作用。,在体外，DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基作用的抑制剂可以调节基因的转录活性。DNA甲基化特异性抑制剂5-AzaDc 在实验中得到广泛的应用，在临床上已用于对急性白血病和脊髓发育不良的治疗。DNA甲基化抑制剂最大的缺陷是缺乏特异性，它可导致处于抑制状态的基因恢复活性，从而限制甲基化抑制剂的应用。特异性DNA甲基化抑制剂的研究就显得很重要。,DNA甲基化与药物耐受的逆转,化疗药物广泛用于肿瘤的治疗，但其固有的或获得性的药物耐受对肿瘤治疗的有效性具有不可欲知性。如果知道药物耐受的细胞和分子机制，就可以设计和使用相应的化疗药物。药物耐受通过DNA甲基化作用而逆转，这也可能为一条有效途径。,多种化疗药物是通过感应细胞的生理性死亡程序如凋亡而对易感细胞起作用，因此，反常基因的激活和凋亡可能是药物耐受的主要机制。一个显著的例子就是细胞毒素性药物如阿霉素和顺铂的耐受与凋亡相关蛋白caspase-8的减少相关，采用5-AzaDc治疗，使caspase-8启动子脱甲基化，caspase-8 重新表达，那么可以恢复化疗的敏感性。,问题与展望,低甲基化激活原癌基因、高甲基化使肿瘤抑制基因转录失活等因素均可导致肿瘤形成。DNA甲基化的选择性调节在临床上可以用来预防和治疗癌。最近已经将DNA甲基化和组蛋白去乙酰基作用两种整体机制联系起来作进一步研究。,人类疾病有半数原因与基因遗传有关，另一半则取决于基因组外遗传变化，这种基因组外遗传变化不改变遗传信息，但可导致细胞遗传性质发生变化，被认为是控制基因活动的“开关”。这样对DNA 甲基化的认识，可看作是对肿瘤形成机制的一个补充。,Thanks,佳木斯大学,