看第十三章植物细胞的遗传转化ppt课件.ppt
植物遗传转化系统的建立,张志胜 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China Tel 38297154 E-mail,内 容,一、植物遗传转化系统概述二、植物遗传转化受体系统的建立三、植物基因转化的方法四、转基因植株的再生及其检测,一、植物遗传转化系统概述(general situation of plant genetic transformation system),1、植物遗传转化（plant genetic transformation）是指利用重组DNA技术，将外源基因导入植物细胞，外源基因与受体植物染色体整合并稳定遗传和表达的过程或技术。植物遗传转化技术是分子育种的核心技术之一，已经成为培育植物新品种的有效方法之一.,全球转基因作物种植面积,1、怎样开展遗传转化工作,确定育种目标,获得目的基因,受体材料的选择,工程载体的构建,遗传转化受体系统的建立,采用一定的方法将目的基因导入细胞,转化细胞的筛选和植株再生,转基因植株鉴定和目标性状鉴定,植物遗传转化受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的系统（王关林和方宏筠，1998）,二、植物遗传转化受体系统的建立,1、植物遗传转化常用的受体（1）植物组织和器官：幼叶、未成熟子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、根和鳞茎等。,植物遗传转化受体系统的建立是 基因工程的重要环节,（2）中间繁殖体：,在离体培养过程中形成的具有一定形态结构的中间繁殖材料。包括：原球茎、根状茎、丛芽、胚状体、愈伤组织和悬浮细胞等。,（3）原生质体,2、植物基因转化受体的条件 高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的来源 对抗生素敏感 抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化 中用来抑制农杆菌生长的抗生素。选择性抗生素：用来对转化子进行早 期筛选的抗生素,作为选择性抗生素的条件,植物材料对所选用的抗生素有一定的敏感性抗生素对受体植物没有剧烈的毒性常用的选择性抗生素：抑菌抗生素：氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素选择性抗生素：潮霉素、卡那霉素农杆菌敏感性 LAB4404 EHA105,3、植物基因转化系统的类型及其特性,（1）组织器官受体系统 组织器官受体系统是 指以植物的组织器官为转基因的受体，然后通过脱分化和再分化获得再生植株的受体系统。特点：受体来源广泛，容易获得；适合于各种遗传转化方法，特别是农杆菌介导法；适应于各种能够通过组织培养获得再生植株的植物；获得再生植株的周期长。叶盘法、生殖细胞受体系统,烟草叶盘遗传转化体系，其阳性转基因植株频率可达 5 7.1%（张宁等，2004）大白菜，最高转化频率可达5.74%（杨广东等，2002）水稻成熟胚、幼胚、幼穗遗传转化受体系统。幼胚最高，基因枪法比农杆菌介导法高（王芋华等，2004）。,（2）中间繁殖体受体系统,是指以植物组织培养过程中产生的中间繁殖体为转基因的受体，然后通过再分化获得再生植株的受体系统。特点：最理想的基因转化受体体统 获得再生植株周期短 快速简单方便 适合多种转化方法 接受外源基因能力强，转化率高,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培品种“费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体系,其转化频率分别可达25.6%和36.8%（张宁等，2004）,（3）原生质体受体系统 以原生质体为受体材料，然后通过原生质体培 养获得再生植株的受体系统。特点：转化率高 获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因稳定性差 出现的嵌合体少 技术难度大,（4）生殖细胞受体系统,以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进行基因转化有两种途径：一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。,特点,A、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，避免了基因显隐性的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程；B、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与常规育种紧密结合，也有利于目的基因在转基因后代中的稳定表达；C、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之一。,4、遗传转化受体系统的建立,（1）高频再生系统的建立 理想的高频再生系统应具备的条件 具有高的中间繁殖体的诱导率 具有高的植株再生能力 易培养，重复性好 体细胞无性系变异少,高频再生系统建立的方法 高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的基础 外植体的选择 外植体的生理年龄 外植体的生理状态 外植体的遗传背景 选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提,培养基的筛选是高频再生系统的核心 培养基影响组培效果 培养基影响变异程度 培养基影响分化途径,培养基,培养基,基本培养基激素的选择：生长素（2，4-D、NAA、IAA、IBA和2，4，5-T）和细胞分裂素（ZT、BAP、6-BA、2iP和 KT）糖的种类和浓度有机附加物的选择,培养条件,培养条件是影响高频再生系统的重要因素 影响组培的效果 影响变异频率 温度光照：强度、光周期和光质,高频再生系统的评价,中间繁殖体诱导率中间繁殖体增殖率植株分化率变异率移栽成活率,抗生素敏感性试验,选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的保证（农杆菌介导法）外植体 诱导培养基 含不同浓度抗生素培养基 植株再生 综合评价,农杆菌敏感性试验,选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的关键（农杆菌介导法）不同植物材料 农杆菌菌株浸染 敏感性评价（结瘤或发根率，发生时间，生长状况等）,（2）受体系统常见的问题及其解决途径,再生能力及其遗传稳定性 选择合适外植体 减少继代次数 选择合适培养基等愈伤组织褐变再生植株玻璃化,三、植物遗传转化的方法,（1）载体转化系统：农杆菌介导法、植物病毒载体法；（2）直接转化系统：化学法（PEG法和脂质体法）和物理法（基因枪法、电击法和显微注射法等）；（3）种质转化系统：花粉管通道法、萌动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。,(一）农杆菌介导转化法,1、根癌农杆菌介导转化原理 农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带有的质粒中一部分T-DNA导入植物细胞中，并整合到植物核 DNA上，然后在植物细胞中得到转录和翻译，表达出目的基因的性状。,2、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序,（1）受体系统的建立（2）Ti质粒转化载体的构建（3）目的基因的转化与鉴定,目的基因的转化程序,根癌农杆菌的培养、纯化、保存 Vir区基因的活化和工程菌液的制备 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 外植体脱菌及选择培养 转化体的选择和植株再生 转基因植株的鉴定,叶盘转化法,打孔器从消毒叶片上获得叶盘 在工程菌液中浸数秒 培养基上共培养23天 在含有抑菌剂的培养基上培养 转化体选择和再生,不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度*,原生质体共培养转化法,原生质体分离 原生质体培养 共培养23天（工程菌：原生质体=1：1000）去菌培养和转化体的选择 植株再生,3、影响农杆菌介导法转化效率的因素,（1）农杆菌（2）质粒（3）受体材料（4）共培养：时间、培养基和培养条件（5）抗氧化剂,（二）基因枪法 particle gun,Particle bombardment Biolistics High velocity microprojectile1、基本原理 利用火药爆炸、高压放电或高压惰性气体作驱动力，将包裹有外源DNA的钨粉或金粉颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，微粒上的DNA进入到细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而达到将外源基因导入植物的目的,2、方法和步骤,（1）DNA微弹的制备 60100mg金粉 1ml无水乙醇中，超声波洗涤 离心去乙醇 1ml无菌水洗涤2次后，加 1ml无菌水重悬 25l悬浮液+25l DNA（1 g/l），混均，再加入25l 2.5mol/L CaCl2，手指振荡5次，加入20 l 40%PEG4000，手指振荡5次，混合液在室温下静置10min 离心5min，移去50-60 l 上清，其余混均，每次用量8 l,（2）材料的准备，将材料接入培养皿中，把培养皿放入基因枪的样品室中，并对准子弹发射中轴。（3）按基因枪操作程序进行微弹轰击（4）轰击后材料的培养和鉴定,3、影响基因枪转化效率的因素,（1）金属微粒的种类和直径（2）沉淀助溶剂（3）DNA纯度和浓度（4）轰击参数：粒子速度、入射速度、阻挡板至样品室高度、轰击次数等（5）植物受体系统,基因枪转化法的特点,不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞作为靶材料操作简便外源基因随机整合，并且常常是多拷贝整合，因而易造成转基因沉默和转基因后代目的基因分离复杂化与农杆菌转化法相比，其转化效率还较低,由于转化事件总是发生在少数细胞内，这就带来了如何富集转化细胞而淘汰未转化细胞的问题筛选(screening).同时，即使在非常严格的筛选条件下再生的转化体也仍可能存在假转化体(或交叉保护的逃脱体escapee),所以必须对转化体（transformants）进行严格的鉴定，以确证其为转基因植株（transgenic plant）,四、转基因植株的再生及其检测,1、转化体的筛选,利用选择标记基因，借助一定的手段使已转化的细胞存活下来，而杀死未转化的细胞。选择标记基因通常与目的基因置于同一质粒载体。亦可将二者分置于不同质粒载体进行共转化，如此便于在后代筛选出无标记基因的转化植株。,通常目的基因所编码的产物不易检测，在转化初期无法判断该基因是否已导入植物。为此，可将一个易于检测产物的基因与目的基因相连，共同转化植物，借助该基因的表达检测即可报告目的基因是否已同时导入受体。这个产物易于检测、用于报告目的片段是否导入受体细胞的基因称之 报告基因必须具有两大特点：1.其表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞内不存在2.便于检测,报告基因,植物转化常用报告基因及标记基因,目的基因的整合鉴定 如 PCR、Southern blot DNA水平 目的基因的表达鉴定 如 Northern blot转录水平 Western blot 翻译水平 生物学鉴定或田间表型鉴定,2 转化体的鉴定(verification),转基因的整合鉴定PCR检测,CK：非转化对照 P：hpt 质粒,提取转化植株基因组DNA设计目的基因特异引物以基因组DNA为模板进行PCR扩增 特点：只需少量DNA、可快速检测大量样品,转基因的整合鉴定Southern blot,CK P T0 转 化 植 株,探针：hpt 基因 CK：非转化对照 P：hpt 质粒特点：需要较多DNA样品、灵敏度高,提取转化植株基因组DNADNA电泳并转尼龙膜制备目的基因探针探针与膜杂交显影,转基因的表达鉴定Northern blot,提取转化植株总RNARNA电泳并转尼龙膜制备目的基因探针探针与膜杂交显影,转基因的表达鉴定Hm浸泡筛选,转 hpt 基因植株,非转化对照植株,五、外源基因的整合特性与表达,1、外源基因的整合 一般认为外源基因是随即插入到植物染色体上 某种特定的外源基因对特定的宿主细胞染色体，其插入位点在序列上有一定的倾向性 在载体DNA上接一段与受体DNA同源的片段能提高转化率 基因插入的拷贝数差异很大,2、外源基因的表达,研究方法：Northern blot，Western blot 同一来源的不同转化植株中，外源基因的表达水平常常存在差异拷贝数对基因的表达有一定的影响共抑制：导入的基因及受体内与其同源的基因表达减弱的现象基因沉默转基因的遗传及稳定性,六、实验安排,1、高频再生系统的建立（8学时）（1）原球茎的诱导（2）原球茎的增殖和分化（3）生根和壮苗（4）试管苗移栽（5）变异的检测,2、抗生素敏感性实验（5）3、农杆菌转化实验（13）,
