分子生物学PPT课件—蛋白质翻译.ppt

4 生物信息的传递（下）,基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA；再由mRNA将遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程称翻译，即蛋白质的生物合成过程。,蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。细胞所用来进行合成代谢总能量的90%消耗在蛋白质合成过程中，而参与蛋白质合成的各种组分约占细胞干质量的35%。,翻译过程：翻译的起始：核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。肽链的延伸：核糖体沿mRNA 5端向3端移动，开始了从N端向C端的多肽合成。肽链的终止与释放：核糖体从mRNA上解离。,在翻译过程中：核糖体是蛋白质合成的场所。mRNA是蛋白质合成的模板。tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。,4.1 遗传密码三联子,mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个AA，这3个核苷酸就称为密码，也叫三联子密码（codon)翻译时从起始密码子开始，沿着mRNA5-3连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定序列的多肽链蛋白质。,4.1.1 三联子密码及其破译,遗传密码的破译是多位科学家经过一系列的数学推理和试验研究，于1966年解决。基因密码的破译先后经历了二十世纪五十年代的数学推理阶段和1961-1965年的实验研究阶段。,7.2.2.1 遗传密码的推测,1954年物理学家Gamov 首先对遗传密码进行探讨，提出不可能是一个碱基或两个碱基决定一个氨基酸（41=4，42=16），如果用三个碱基决定一个氨基酸，43=64，就足以编码20种氨基酸，密码子应是三联体（triplet）；是否重叠？1961年Crick 等用T4噬菌体试验表明，mRNA中加入或减少1或2个核苷酸，可导致形成不正常的蛋白质；但加入或减少3个核苷酸则生成的蛋白质常具有活性。因此，认为三联体密码子学说是正确的。这被以后的实验证明。,确认三联子：1 移码突变2 烟草坏死病外壳蛋白亚基400aa/1200bp,破译密码子最简单的方法是将DNA或mRNA的顺序与多肽进行比较。（1）体外翻译系统的建立在生物体内，蛋白质合成过程中需要200多种生物大分子参加，包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。在体外能否进行蛋白质的合成？,1962年，用E.coil提取液进行体外合成实验，加入细菌病毒f2的mRNA，合成了与天然f2蛋白完全相同的蛋白质。证明在体外条件下可准确地按mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质。现在已用无细胞系统合成多种病毒和细菌蛋白以及哺乳动物蛋白（如血红蛋白、轻链和重链免疫球蛋白、肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白等），证明高等生物蛋白也能在体外合成。,用于蛋白质生物合成研究的体外翻译系统主要有：细菌（大肠杆菌）无细胞系统、动物无核细胞系统、网织红细胞裂解系统和麦胚系统等。只要加入外源mRNA模板，则可进行体外翻译。,（2）核酸的人工合成技术的发展,Nirenberg and Mathaei（1961）开始用实验方法研究遗传密码。所用的方法是人工合成一定的RNA,作为mRNA。人工合成了poly(U)做模板，加入到体外无细胞翻译系统中；将翻译产物分析后，发现合成的肽链中的氨基酸全部是Phe。据此就确认了Phe 的密码子是UUU。类似的实验不能证明GGG是哪种氨基酸的密码子；因为poly(G)形成了复杂的二级结构，不与核糖体结合。UUUUUUUUUUUUUUUUUU-PhePhePhePhePhePhe CCCCCCCCCCCCCCCCCC-ProProProProProPro AAAAAAAAAAAAAAAAAA-LysLysLysLysLysLys,Speyer等（1963）用人工合成2个碱基的共聚物(mixed copolymers)破译密码的方法。以A和C原料合成polyAC。polyAC包含有8种不同的密码子，实验中AC共聚物作模板翻译出的肽链由6种氨基酸组成，其中两种已证明是CCC和AAA。这些氨基酸的掺入比例随A/C比率而异。如多聚AC中A的量大大超过C的量，则Gln的参入大大多于 His，可推断Gln的密码子含2A和1C，而His的密码子含2C和1A；但此方法不能确定A和C的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成。用其它2个碱基的共聚物进行类似的实验，也可以推断出其他密码子的碱基组成，但不能确定密码子中碱基排列。,A/C共聚核苷：CCC CCA CAC ACC CAA ACA AAC AAA Pro Pro His Thr Gln Thr Asn Lys多聚二核苷酸poly UG:UGUGUGUGUGUGUGUGUG-CysValCysValCysVal多聚三核苷酸poly UUC:UUCUUCUUCUUCUUCUUC-PhePhePhePhePhePhe UCUUCUUCUUCUUCUUCU-SerSerSerSerSerSer CUUCUUCUUCUUCUUCUU-LueLueLueLueLueLue,（3）核糖体结合技术（ribosome binding technique）,将三核苷酸、氨基酰-tRNA混合物和核糖体一起放入硝酸纤维滤膜，游离的氨基酰-tRNA会被洗脱通过，核糖体无法通过滤膜，与密码子对应的氨基酰-tRNA和密码子一起与核糖体结合而留在滤膜上。,方法：合成1个三联体核苷酸（RNA）模拟一个密码子，如UUU。准备各种负载tRNA，如Thr、Phe或Lys的tRNA混合物，并将其中的一种氨基酸（如Phe）用放射性元素标记。将密码子、负载tRNA及核糖体一起放入硝酸纤维滤膜。游离的密码子和负载tRNA会被洗脱而通过滤膜，核糖体无法通过滤膜。但与密码子对应的tRNA能与密码子一起与核糖体结合而留在滤膜上。检验滤膜看是否含放射性元素。若有放射性，表明此标记氨基酸(Phe)与此密码子(UUU)对应。否则，二者无对应关系。合成其它密码子并标记其他氨基酸重复此实验。,尽管已经合成了所有64种可能的三联体核苷酸，希望通过这种方法确定每一种密码子。但是有些三核苷酸序列与核糖体的结合不是很有效的，因而无法哪一种密码子对应哪一个氨基酸。而且用这种方法也把一些密码子定错了。用这种方法实际上确定了50种密码子。在应用三核苷酸技术的同时，Khorana用有机化学与酶学技术相结合的方法合成了已知顺序的含2、3或4种碱基的共聚物(repeating copolymers)。,The universal genetic code(通用遗传密码表),4.1.2 遗传密码的性质,密码的连续性。起始密码子决定所有后续密码子的位置。密码间无间断也没有重叠。密码的简并性。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并，对应于同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子（synonymous codon)。,密码的普遍性与特殊性。密码子表是具有普遍性的，适用于一切生物，但也有些特殊情况。,密码子与反密码子的相互作用。tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上的密码子相互作用的。,摆动假说（wobble hypothesis)在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。解释了反密码子中某些稀有成分的配对，以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题。,一个tRNA究竟能识别多少个密码子是由反密码子的第一位碱基的性质决定的。,如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA.原核生物中大约有30-50中tRNA，真核生物中可能存在50种tRNA。,tRNA在蛋白质合成中处于关键地位。tRNA不仅为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供运送载体，它又被称为第二遗传密码。特点：存在经过特殊修饰的碱基，3端都以CCA-OH结束，这是其氨基酸结合位点。,4.2 tRNA,tRNA产生,二级结构由于小片段碱基互补配对，形成三叶草形的二级结构。三叶草形tRNA分子上有4条根据它们的结构或已知功能命名的手臂：受体臂：链两端碱基序列互补形成的杆状结构；3端有未配对的34个碱基；3端的CCA，最后一个碱基2和3烃基可被氨酰化。TC臂：其中psai表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂：位于套索中央有三联反密码子。D臂：含有二氢尿嘧啶。,各种tRNA均有74-95个核苷酸，其中有22个核苷酸是恒定不变的。受体臂：链两端碱基序列互补形成7bp的茎；3端有未配对的34个碱基；3端的CCA，最后一个碱基2和3烃基可被氨酰化。TC臂：常由5bp的茎和7nt的环组成。负责核糖体的识别。反密码子臂：常由5bp的茎和7nt的环组成。D臂：含有二氢尿嘧啶。茎的长度常为4bp。额外臂：4-21nt不等。,tRNA上碱基的修饰,tRNA的稀有碱基非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少有2个稀有碱基，最多有19个。,多数分布在非配对区，尤其反密码子3端附近部位，且大多为嘌呤核苷酸。对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对很重要。,所有的tRNA都能够与核糖体的A位点和P位点结合。A:氨酰-tRNA结合位点P:肽酰-tRNA结合位点tRNA能被翻译辅助因子识别：,起始因子 翻译辅助因子,4.2.1 tRNA的L形三级结构,酵母苯丙氨酸tRNA的三级氢键,tRNA的三级结构主要由二级结构中未配对碱基间形成氢键而引发。,受体臂顶端的碱基位于“L”的一个端点，反密码子臂的套索状结构生成了”L”的另一个端点。分子中两个不同的功能基团是最大限度分离的。,4.2.2 tRNA的功能,翻译阶段遗传信息从mRNA转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联密码子形式存在的，这里起作用的是tRNA的解码机制。氨基酸在合成蛋白质之前先通过AAtRNA合成酶活化，在消耗ATP的情况下结合到tRNA上，生成有蛋白质合成活性的AAtRNA，由AAtRNA上的反密码子与mRNA上的密码子相互识别并配对，将AA带到mRNA-核糖体复合物上，插入到正在合成的多肽链的适当位置上。tRNA的性质是由反密码子而不是它所携带的氨基酸所决定的：试验：14C-Cys-tRNAcys-Ni-14C-Ala-tRNAcys,4.2.3 tRNA的种类,1.起始tRNA和延伸tRNA。一类能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。起始tRNA具有独特的结构特征。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸fMet，真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸Met。原核生物中Met-tRNAfMet必须首先甲酰化才能参与蛋白质合成。2.同工tRNA:几个代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨酰-tRNA合成酶。tRNA的二级和三级结构对它的专一性有重要作用。,校正tRNA。分两类：无义突变的校正tRNA和错义突变的校正tRNA。均通过改变其反密码子区校正突变而依然合成原氨基酸。无义突变(nonsense mutation)：一个核苷酸的改变使代表某氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽。错义突变(missense mutation):由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。,无义突变和错义突变的校正,校正tRNA在进行校正的过程中必须与正常的tRNA竞争结合密码子。某个校正基因的效率不仅决定于反密码子与密码子的亲和力，也决定于它在细胞中的浓度及竞争中的其他参数。50%校正可能引起细胞的变化或伤害。,4.2.4 氨酰-tRNA合成酶,第一步：AA+ATP+酶(E)E-AA-AMP+PPi,第二步：E-AA-AMP+tRNA AA-tRNA+E+AMP,氨酰-tRNA合成酶能精确识别tRNA和氨基酸。大多数细胞可产生二十种不同的氨酰-tRNA合成酶，每一种酶负责一种氨基酸。它们各不相同，各负其责，使一种氨基酸与其相应的一套tRNA分子结合。,4.3 核糖体,生物细胞内，核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。核糖体是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个。,真核生物中，正在进行蛋白翻译的核糖体都直接或间接地与细胞骨架结构有关联或与内质网膜结构相连。原核生物中，大都通过与mRNA的相互作用，被固定在核基因组上。,4.3.1 核糖体的结构,1 核糖体由大小两个亚基组成,真核：RNA-3/5 蛋白质-2/5,原核：RNA-2/3 蛋白质-1/3,核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为大小两个亚基，大亚基约为小亚基相对分子质量的二倍。每个亚基都含有一个分子质量较大的rRNA和许多蛋白质分子。这些大分子rRNA能在特定位点与蛋白质结合，从而完成核糖体不同亚基的组装。,原核生物、真核生物细胞质及细胞质的核糖体存在着很大差异,2 核糖体蛋白（ribosomal protein,r-蛋白）,核糖体是一个许多酶的集合体，单个酶或蛋白只有在这个总体结构内才拥有催化活性，共同承担了蛋白质生物合成的任务。大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1S21表示，大亚基由36种蛋白质组成，分别用L1L36表示。真核生物细胞核糖体蛋白质中，大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。,在高倍电镜下得到的原核生物70S核糖体大、小亚基相结合的模型，核糖体分子可容纳两个tRNA和约40bp长的mRNA。,3 核糖体RNA,真核生物rRNA剪切和核糖体的组装,核糖体内的rRNA不仅是核糖体的重要结构成分，也是核糖体发挥生理功能的重要元件。,原核rRNA前体加工示意,4 核糖体有3个tRNA结合位点,A位点（aminoacyl site）P位点（peptidyl site）E位点（exit site）,4.3.2 核糖体的功能,核糖体存在于每个细胞中进行蛋白质的合成。尽管在不同生物体内其大小有别，但组织结构基本相同，而且执行的功能完全相同。核糖体包括5个以上活性中心，即：mRNA结合部位接受AA-tRNA部位(A位)结合肽基tRNA的部位(P位)肽基转移部位形成肽键的部位(转肽酶中心)此外，还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。,大小亚基功能：核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别、密码子与反密码子的相互作用等，mRNA的结合位点也在小亚基上。大亚基负责携带AA-tRNA、肽键的形成、AA-tRNA与肽链的结合、A位、P位、转肽酶中心等在大亚基上。,在翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成70S/80S颗粒，开始翻译进程。体外反应体系中，核糖体的结合或解离取决于离子浓度。,4.4 蛋白质合成的生物学机制,20种氨基酸结构图,4.4.1 氨基酸的活化,至少存在20种以上具有AA专一性的氨酰-tRNA合成酶，能识别并通过AA的-COOH与tRNA3端腺苷酸核糖基上3-OH缩水形成二酯键。同一氨酰-tRNA合成酶具有把相同AA加到两个或更多个带有不同反密码子tRNA分子上的功能。,N-甲酰甲硫氨酰-tRNAfMet的形成：Met+tRNAfmet+ATP Met-tRNAfmet+AMP+PPiN-甲酰四氢叶酸+Met-tRNAfMet 四氢叶酸+N-甲酰甲硫氨酰-tRNAfMet,原核生物,真核生物体内存在两种tRNAmet，只有甲硫氨酰-tRNAimet才能与40S小亚基结合，起始肽链合成。普通tRNAmet中携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中。,在多肽链合成的过程中或之后，去甲酰酶（deformylase）将这个甲酰从氨基端去掉。实际上，许多原核细胞的蛋白质甚至不是以Met开始的，因为氨肽酶（aminopeptidases）通常在氨基端切除 Met以及另外的1-2个氨基酸残基。,the last position of the acceptor arm connected to the amino acid are paired in all tRNAs except tRNAifMet.The absence of this pair is therefore important in preventing tRNAifMet from being used in elongation.It is also needed for the formylation reaction The 3 G-C pairs in the anticodon stem is unique to tRNAifMet,are required to allow the tRNAifMet to be inserted directly into the P site.,起始tRNA与延伸tRNA的区别,4.4.2 翻译的起始,蛋白质合成的起始是在起始因子帮助下，使mRNA与核糖体进行正确定位，识别起始密码子，组装成核糖体-mRNA-起始tRNA复合体，并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点的过程。起始因子（原核生物简称 IF，真核生物简称eIF)是在蛋白质合成的起始阶段与核糖体小亚基结合，帮助形成起始复合物的蛋白因子。这些蛋白因子只与核糖体小亚基结合，当小亚基与大亚基结合成核糖体（70S or 80S)时，起始因子即被释放。,1 原核生物翻译的起始细菌中翻译的起始需要如下7种成分:30S小亚基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3个翻译起始因子（IF-l、IF-2和IF-3），GTP，50S大亚基，Mg2。,IF1-直接结合到小亚基未来A位点的位置上，防止tRNA结合到小亚基A位点的位置上；70S起始复合物生成后促进IF2释放，从而完成蛋白质合成的起始过程。IF2 是GTP酶，它与起始过程的3个主要成分（小亚基、IF1 和fMet-tRNAi fMet）相互作用。通过与这些成分相互作用，IF2催化了fMet-tRNAi fMet与小亚基的结合，并且阻止其它负载tRNA与小亚基结合；对于30S起始复合物与50S亚基的连接是必需的。IF3 协助小亚基专一性识别和选择起始位点；阻止大、小亚基结合（翻译起始需要游离的小亚基，对翻译的每一轮新的循环非常重要）；占据了E位点，防止其与负载tRNA结合。,只有fmet-tRNAfmet能与第一个P位点想结合，其他所有tRNA都必须通过A位点到达P位点，再由E位点离开核糖体。,2 真核生物翻译的起始,与原核生物比较：核糖体较大有较多的起始因子 Met-tRNAMet不甲酰化mRNA分子5 端的“帽子”和3 端的多聚A都参与形成翻译起始复合物,Kozak 扫描模型,真核生物翻译起始示意图,5.Merrick,WC.2003,31:378385.6.即内部核糖体进入位点。7.LeFebvre AK,et al.,2006,281:2291722932.8.酿酒酵母eIF3的亚基数为6。9.eIF4F由eIF4A、4E、4G组成.10.为推测，未经证实,4.4.3 肽链的延伸,第一个AA与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键被有序的结合上去。肽键的生成由肽基转移酶催化。,肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。,EF-Tu只能与fMet-tRNA以外的其他AA-tRNA反应,移位必需的蛋白因子,核糖体沿mRNA移动与肽酰-tRNA的移位是偶联的。,EF-Tu和EF-Ts促进AA-tRNA进入A位，EF-G促进移位和卸载tRNA的释放。,4.4.4 肽链的终止,I类释放因子：识别终止密码子，并能催化新合成的肽链从P位点的tRNA中水解释放出来。II类释放因子：在多肽链释放之后，刺激I类释放因子从核糖体中解离出来。,大肠杆菌核糖体上蛋白质合成的终止过程,终止密码子出现在A位，无相应AA-tRNA与之结合；释放因子识别这些密码子并与之结合；释放因子水解多肽链与tRNA间的二酯键；新生肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。,4.4.5 蛋白质前体的加工,新生多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。N端fMet或Met的切除二硫键的形成特定氨基酸的修饰。氨基酸侧链的修饰包括：磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）、乙基化（如组蛋白）、羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等。切除新生链中非功能片段,1 N端fMet或Met的切除 不管是原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。,二硫键的形成 正确形成可稳定蛋白的天然构象。,3 特定氨基酸的修饰,磷酸化（如核糖体蛋白质）糖基化（如各种糖蛋白）甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）乙基化（如组蛋白）羟基化（如胶原蛋白）羧基化,糖基化,4 切除新生链中非功能片段,前胰岛素原的加工,4.4.6 蛋白质的折叠,新生多肽链必须经过正确的折叠，才能形成动力学和热力学稳定的三维构象，从而表现出生物学活性或功能。多肽链的折叠是一个复杂的过程，新生肽链一般首先折叠成二级结构，再进一步折叠盘绕成三级结构。对于寡聚蛋白质，一般还需要组装成更为复杂的四级结构。分子伴侣是能在细胞内辅助新生肽链正确折叠的一类蛋白质。它是一类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。分为两类：热休克蛋白、伴侣素。,伴侣分子主要通过防止或消除肽链的错误折叠，增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用，而并非加快折叠反应速度。分子伴侣本身并不参与最终产物的形成。,4.4.7 蛋白质合成的抑制剂,主要是抗生素、干扰素、核糖体灭活蛋白等。抗菌素对蛋白质合成的作用：阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素）；阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素类）；干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卡那霉素等）；作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。如链霉素能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。,碱性三糖 作用位点在30S亚基上。多种方式抑制核糖体：干扰fMet-tRNA与核糖体的结合；导致mRNA的错读。,嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，不需要延伸因子就可以结合在A位。通过提前释放肽链来抑制蛋白质的合成。,干扰素处理细胞后引起翻译起始抑制和mRNA降解,抗生素在蛋白质合成不同阶段的抑制作用,4.4 蛋白质转运机制,翻译-转运同步机制 蛋白质的合成和运转同时发生。分泌蛋白质大多是以同步机制运输的。翻译后转运机制 蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。,蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。信号肽紧接在起始密码之后，大部分是疏水氨基酸。信号肽的长度在1336个残基。信号肽的特点：1015个疏水氨基酸；N端有带正电荷的氨基酸；C端接近切割点处代数个极性氨基酸；离切割点最近的氨基酸往往带有很短的侧链（Ala,Gly）。,4.5.1 翻译-转运同步机制,机制过程：分泌蛋白的生物合成开始于核糖体，翻译到大约50个氨基酸残基，信号肽开始从核糖体的大亚基露出，被内质网膜上的受体识别并与之结合。信号肽过膜后被内质网腔的信号肽酶水解，新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂。当核糖体移到mRNA的“终止”密码子，蛋白质合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖体重新处于自由状态。,1.完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件。2.仅有信号肽还不足以保证蛋白质转运的发生，还要求转运蛋白质在信号序列以外的部分有相应的结构变化。3.信号序列的切除并不是转运所必需的。4.并非所有的转运蛋白都有可降解的信号肽。,信号识别蛋白,新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程,核糖体组装、翻译起始；位于蛋白质N端的信号肽序列首先被翻译；SRP与核糖体、GTP以及带有信号肽新生蛋白质相结合，暂时中止肽链延伸；核糖体-SRP复合物与膜上的受体相结合；GTP水解，释放SRP并进入新一轮循环；肽链重新开始延伸并不断向内腔运输；信号肽被切除；多肽合成结束，核糖体解离并恢复到翻译起始前的状态。,4.5.2 翻译后转运机制,叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。,线粒体蛋白质跨膜转运特征:通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和位于N端的一段前导肽（leader peptide）共同组成，前导肽约含2080个氨基酸残基，当前体蛋白过膜时，前导肽被多肽酶所水解，释放成熟蛋白质。蛋白质通过线粒体膜运转是一种需要能量的过程。蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。,Tom：Transporter Outer Membrane Tim：Transporter Inner Membrane,前导肽的作用与性质拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，则失去继续跨膜能力。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转起着关键作用。,前导肽具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）-螺旋结构的能力。,叶绿体蛋白质的跨膜转运叶绿体多肽在胞质中的游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子，多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点。叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。,叶绿体蛋白质转运有如下特点：活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内。叶绿体膜能够特异地与叶绿体蛋白的前体结合。叶绿体膜上有识别叶绿体蛋白质的特异性受体，保证叶绿体蛋白质只能进入叶绿体内，而不是其他细胞器中。叶绿体前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。,4.5.3 核定位蛋白的转运机制,为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽 被称为核定位序列（NLSNuclear Localization Sequence）一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输过程需要核运转因子（Importin）、和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。,核定位蛋白跨细胞核膜运转过程示意图,细菌中蛋白质的跨膜转运,细菌同样能通过定位于蛋白质N端的信号肽将新合成的多肽转运到不同部位。,4.5.4 蛋白质的降解,大肠杆菌蛋白的降解需要一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）。细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶会被激活。每切除一个肽键需消耗2分子ATP。真核生物蛋白降解依赖于泛蛋白（ubiquitin）。一旦被降解蛋白与泛蛋白相连接，这个复合体就能被运送到蛋白降解体系中直到完全降解。,泛蛋白与被降解蛋白连接示意图,E1酶负责活化泛素蛋白、E2酶通过转硫醇作用从E1酶处获得泛素蛋白，并将其与底物蛋白相结合，然后E3酶将泛素蛋白与底物连接。泛素蛋白的C末端通常都经由酰胺键（amide linkage）与靶蛋白的氨基团连接在一起。不过也可以与靶蛋白的N末端相连。在多泛素链中，一个泛素蛋白分子的赖氨酸侧链与另一个泛素蛋白的C末端相连，如此反复形成多泛素链。泛素蛋白含有7个赖氨酸残基，所有这些赖氨酸残基都可以参与上述多泛素链的合成过程。,蛋白质的半衰期大约从30s到许多天不等。像血红蛋白这样少数蛋白的半衰期与细胞周期同样长。成熟蛋白N端的第一个氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物）在蛋白的降解中的影响很大。当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3min就被降解了。,蛋白质的半衰期与N-端氨基酸残基的关系,