分子生物学(基因组、转录组、蛋白组)ppt课件.ppt

Molecular Genetics and GenomicsFall Semester,2010主讲教师：薛树林 联系电话：84396024地址：金陵研究院316E-mail:植物应用基因组学与生物信息中心,1.出勤及回答问题情况：30%（随机提问形式）2.期末考试：70%（闭卷）,考核方式,对于选修基因组学课程的同学，采取写一篇课程论文的考核方式（70%）。2学分，周五 3-5节，教学楼B301,References,Genomes 2,Genomes 3 by Brown TAGene VIII,Gene IX by B.LewinJournals on Plant Molecular Genetics现代分子生物学，朱玉贤，李毅 著基因组学杨金水 著分子克隆实验指南（第3版），萨姆布鲁克（美）主编,Chapter 1:Genomes,Transcriptomes and ProteomesChapter 2:Studying DNAChapter 3:Mapping GenomesChapter 4:Sequencing and Annotation of GenomesChapter 5:Eukaryotic Nuclear GenomesChapter 6:Genomes of Prokaryotes and Eukaryotic OrganellesChapter 7:Genome ExpressionChapter 8:Genome Evolution,Outline of this course,Chapter 1:Genomes,Transcriptomes and Proteomes,基因组（Genome）：由德国汉堡大学威克勒教授于1920年首创，指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。基因组学（Genomics）：由罗德里克于1986年首创，指研究生物的整个基因组，涉及基因组作图、测序和功能分析的一门学科。,1.概述,基因组所包含的生物信息的利用需要酶及其他参与基因组表达过程中一系列复杂生化反应的蛋白质的协同活性。基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组由转录过程来维持。基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这是通过翻译过程来完成的。,细胞的蛋白质库,DNA由Johann Friedrich Miescher在1869年发现,这位瑞士生物学家当时在德国蒂宾根（Tubingen）工作。,2.DNA,2.1 Genes are made of DNA,奥地利神父孟德尔1865年根据7个碗豆性状的实验提出了遗传因子假说，认为每个性状由遗传因子控制，并提出了遗传因子的分离与自由组合两大遗传规律。,证明基因由核酸(DNA或RNA)组成的3个著名实验：肺炎双球菌的转化试验；噬菌体感染实验；烟草花叶病毒的感染实验。,A.1928年，荷兰细菌学家格里菲斯（Griffith）的肺炎双球菌转化实验 Griffith在研究肺炎球菌时发现肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一种菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得败血病。这些有毒的球菌外面有保护作用的多糖胶状荚膜，使它们可以不被宿主的正常保护机构所破坏；当它们生长在培养基上时，每一个细菌长成一个明亮的光滑菌落，叫光滑型（S）菌株；另外一些菌株无荚膜，菌落粗糙，没有毒性，不会引起疾病，叫R型菌株。,(1),(2),(3),(4),这表明无毒性的R型活细菌在与被加热杀死的S型细菌混合后，转化成了有毒性的S型活细菌。这些转化成的S型细菌的后代也是有毒性的S型细菌，可见这种性状的转化是可以遗传的。1944年，艾弗里从S型活细菌中提取了DNA，蛋白质和多糖等物质，然后分别加入到培养R型细菌的培养基中。结果发现只有加入DNA时，R型细菌才能转化成S型细菌。通过上述研究表明，DNA是使R型细菌产生转化的物质，所以DNA是遗传物质。,B.噬菌体感染实验 噬菌体T2有一个蛋白质的外壳，DNA裹在其中。当噬菌体T2感染大肠杆菌时，它的尾部吸附在菌体上。然后，菌体内形成大量噬菌体，菌体裂解后，释放出几十个乃至几百个与原来感染细菌一样的噬菌体T2。构成蛋白质的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸含有硫，DNA中不含S，所以S只存在于T2噬菌体的蛋白质。相反，P主要存在于DNA中，至少占T2噬菌体含磷量的99。Alfed Hershey和Martha Chase(1952)将宿主菌细胞分别放在含35S或含32P的培养基中。宿主细胞在生长过程中就被35S或32P标记上了。然后用噬菌体去感染分别被S或P标记的细菌，并在这些细菌中复制增殖。宿主菌裂解释放出很多子代噬菌体，这些子代噬菌体也被标记上35S或32P。,接着，用分别被35S或32p标记的噬菌体去感染没有被放射性同位素标记的宿主菌，然后测定宿主菌细胞带有的同位素。被35S标记的噬菌体所感染的宿主菌细胞内很少有35S，而大多数 35S出现在宿主菌细胞的外面。也就是说，35S标记的噬菌体蛋白质外壳在感染宿主菌细胞后，并未进入宿主菌细胞内部而是留在细胞外面。被32p标记的噬菌体感染宿主菌细胞后，测定宿主菌的同位素，发现32p主要集中在宿主菌细胞内。所以噬菌体感染宿主菌细胞时进入细胞内的主要是DNA。由此可以得出结论：噬菌体注入宿主菌细胞内的物质是DNA，释放出来的是跟原先感染细菌细胞一样的噬菌体。可见在噬菌体的生活史中，只有DNA是联系亲代和子代的物质。,C.烟草花叶病毒的感染实验对病毒的研究逐渐深入以后，发现一些植物的病毒仅含有RNA没有DNA。当用烟草花叶病毒（TMV）的RNA和蛋白质分别进行感染试验，发现只有RNA才能诱发感染。RNA也是遗传物质,RNA,蛋白质,2.2 The structure of DNA,核苷酸,A.Nucleotides and polynucleotides,2-脱氧核糖,多聚核苷酸,3,5-磷酸二酯键,DNA多聚核苷酸合成的聚合反应,2.2 The structure of DNA,B.The model of double helix,DNA晶体X射线衍射图谱为揭示DNA分子的二级结构提供了重要实验证据,a.Watson and Crick(1953)提出的DNA双螺旋结构模型：DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。戊糖磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2.37 nm。,Width 2.37 nm,3.4nm,4,3,1,4,2,5,6,尽管氢键使得双链中的碱基间的配对具有特异性（只有互补的两条链之间才能形成DNA双链），但其对于双螺旋的总体上的稳定性并无太大贡献。核酸分子的稳定性的根源在于碱基对之间的疏水堆积力。作为芳香族化合物，碱基的平面使其不能在自由溶液中与水分子形成氢键，即它们是疏水的。疏水效应使双链DNA成为能量上最为稳定的结构。尽管这种堆积作用在RNA中也存在，但其在双链DNA中达到了最大化。,b.DNA双螺旋结构的稳定力：碱基间形成的氢键相邻碱基间的疏水堆积力碱基相互作用的范德华力,c.DNA双螺旋结构的类型:三种形态的DNA：A-DNA,B-DNA,Z-DNA两类：右手螺旋和左手螺旋,A,B,Z,DNA双螺旋不同构象的特征,螺旋直径,螺距,3.RNA and the Transcriptome,基因组表达的最初产物是转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。,3.1 The structure of RNA,核糖,A,C,G,U,稳定性差主要以单链形式存在,依赖模板的RNA合成,DNA-dependent RNA polymerases,3.2 细胞内的RNA组分,一个典型的细菌细胞含有 0.050.10 pg的RNA，约占其总质量的6%。一个哺乳动物细胞，比细菌大得多，含有2030pg RNA，但是只占细胞总质量的1%。,细胞内的RNA组分,核小RNA,核仁小RNA,微小RNA,短干扰RNA,所有生物,仅真核生物,核小RNA(SnRNA)：发现于真核生物细胞核中，与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程相关。核仁小RNA（snoRNA）：发现于真核细胞核的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起到核心作用（比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基）。微小RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）：是调控个别基因表达的小RNA。,3.3 Processing of precursor RNA,末端修饰,剪接,剪切,化学修饰,pre-rRNApre-tRNA,RNA editing,新的化学基团,3.4 The transcriptome,转录组虽然不到细胞总RNA的4%，却是细胞中最重要的组分，因为它包含了基因组表达的下一个阶段中所要使用的编码RNA。转录组从不从头合成（de novo），一个细胞通过细胞分裂诞生时就接收了其上一代的部分转录组，并维持一生。各蛋白质编码基因的转录过程并不是导致转录组的合成，而是通过替换被降解的mRNA来维持转录组，并通过开闭不同的基因的表达来改变转录组的组成。,3.5 转录组研究的方法,A.通过序列分析研究转录组,研究转录组最直接的方法是将其中的mRNA转变为cDNA，并对所有cDNA克隆进行测序，再与基因组序列进行比较分析。还可以借助第二、三代测序技术直接对RNA进行测序。,3.5 转录组研究的方法,A.通过序列分析研究转录组,基因表达系列分析（Serial analysis of gene expresion,SAGE）,SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。,技术基础：412=16,777,216 bp，真核mRNA平均1500 bp，412相当于11,000个转录物，这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多，因此12bp序列能够代表某一种mRNA。,BsmF1是一种不常见的限制性内切酶，它不在其识别序列内部，而是在识别位点下游10-14个nt处切割。,SAGE,纤维素微粒,4bp,频繁切割,洗脱去除,连接一个含有BsmF1识别序列的寡聚核苷酸,切下来的片段被收集起来，头尾相连以产生一个串联体，进行测序分析。串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对，从而可以分析哪些基因被转录，表达水平如何。,SAGE,3.5 转录组研究的方法,B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组,探针：,原位合成并固化的寡聚核苷酸PCR产物cDNA,优点：可用于快速评估两个或多个转录组间的差异。,109拷贝，过量,构成转录组的mRNA总体被反转录成一个cDNA的混合物，然后被标记，用于和芯片或微阵列杂交。,3.5 转录组研究的方法,B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组,与基因中不同位置匹配的寡聚核苷酸链（包含20种左右）,探针标记效率杂交效率,玻璃片，尼龙膜,玻璃片，硅片,用不同的荧光来标记cDNA样品，微阵列与两个样品同时杂交，可以减少由于试验误差引起的差异。,4.Proteins and the Proteome,基因组表达的第二个产物是蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。这些蛋白质是通过翻译那些组成转录组的mRNA分子而合成的。,Mol cell proteomics:8.8Proteomics:4.4,4.1 Protein structure,蛋白质和DNA分子一样，是一个线性的无分支的多聚体。蛋白质中的单体亚单位称为氨基酸。氨基酸形成的多聚体或多肽在长度上很少超过2000个单位。,氨基酸的一般结构,A.The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,a.primary structure,A.The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,b.secondary structure,指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。螺旋；片层,A.The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,b.tertiary structure,是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。,它被各种化学力所稳定：,A.The four levels of protein structure,4.1 Protein structure,d.quaternary structure,两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。,不是所有蛋白质都有四级结构；稳定力包括：二硫键（稳定）；氢键，疏水作用（松散）,Nature,27 NOV,2008,B.蛋白质的多样性取决于氨基酸的多样性,4.1 Protein structure,组成蛋白质的氨基酸在化学性质上有多样性，因此蛋白质的功能也是多种多样的。氨基酸的多样性源于R基团。,氨基酸的R基团,非极性（疏水）,极性（亲水）,带负电荷,p19,带正电荷,4.2 The proteome,蛋白质组包括了在特定时间存在于细胞中的所有蛋白质。一个典型的哺乳动物细胞，如肝细胞中，含有1000020000种不同的蛋白质，共有约 8 x 109 个蛋白质分子，重约0.5 ng，占细胞总重量的18-20%。各种蛋白质的拷贝数差别很大，最少的每个细胞中不足20000个，最多的可达1亿个。每个细胞中拷贝数大于50000的蛋白质被认为含量较丰富，通常哺乳动物细胞中约有2000种蛋白质属于此类，它们大多属于管家蛋白。,4.2 The proteome,A.The link between the transcriptome and the proteome,Genetic code,四个标点密码子,4.2 The proteome,B.The genetic code is not universal,4.2 The proteome,B.蛋白质组和细胞生化功能之间的联系,基因组编码的生物学信息最终由蛋白质表现。蛋白质能够执行各种生物学功能：,生物催化作用（酶）；结构（细胞骨架由蛋白质决定）；运动（收缩蛋白）；运输（血红蛋白运输血液中的氧）；调节细胞进程（信号蛋白、活化调节因子）；保护细胞个体（抗体）；储藏功能（麦醇溶蛋白）。,4.3 蛋白质组研究的方法,A.蛋白谱（表达蛋白质组学）,用来研究一个蛋白质组组成的特定技术。,蛋白谱基于两项技术：蛋白电泳和质谱,a.双向电泳：,分子量,等电点：蛋白质的净电荷为零时溶液的PH值。,等电聚焦,等电点,双向凝胶电泳结果,寻找差异表达点,b.MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱),4.3 蛋白质组研究的方法,A.蛋白谱,用于鉴定蛋白组中的蛋白质，最多可以分析出50个氨基酸长度的多肽，因此一个蛋白质可以通过胰酶将其消化后进行测定。一旦多肽片段被离子化，多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电离源到检测器的“飞行时间”来确定。通过质荷比能够确认多肽片段的分子质量。计算机中含有一个由所研究的物种基因组编码的每一个蛋白质经胰酶消化后各个片段的预计相对分子质量的数据库，计算机通过比较数据库与检测到的多肽片段的分子质量来确认最可能的初始蛋白质。,质量/电荷比,多肽通过来自激光的脉冲能量被电离化,柱腔,质量/电荷比,波谱数据,计算机通过比较数据库与检测到的多肽质量来确认最可能的初始蛋白质。,4.3 蛋白质组研究的方法,B.蛋白质印迹法（Western杂交）,Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目标蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目标蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。,4.3 蛋白质组研究的方法,B.蛋白质印迹法（Western杂交）,然后加入特异性抗体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，或用同位素或生物素标记）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。,Western blotting,电泳印迹,4.3 蛋白质组研究的方法,C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质,通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的重要数据。构建蛋白质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程的一个重要步骤。,4.3 蛋白质组研究的方法,C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质,a.噬菌体展示,该技术采用了一种基于噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。待测基因被插入载体后，它的蛋白质产物能与噬菌体外壳蛋白以融合形式表达。,噬菌体外壳蛋白基因,插入要展示的蛋白质的DNA,制备一种展示噬菌体,融合可读框,使用噬菌体展示库来寻找与待测蛋白质相互作用的蛋白质的噬菌体。,把待测蛋白质固定在微量滴定盘的孔中,b.酵母双杂交,4.3 蛋白质组研究的方法,C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质,激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域和转录激活结构域。双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不表达的。,转化酵母后产生融合蛋白,待测基因,一系列DNA片段混合物,使用酵母双杂交筛选相互作用的蛋白质,两套克隆混合，共转化酵母,4.3 蛋白质组研究的方法,D.蛋白质相互作用图谱,也叫蛋白质相互作用网络，能展现一个蛋白质组中各成员间发生的相互作用。,酿酒酵母蛋白质相互作用图谱（2001）,数据来自酵母双杂交试验,酿酒酵母蛋白质相互作用图谱（2002）,数据来自酵母双杂交试验,The genome tells you what could be happened theoretically in the cell.Transcriptome tells you what might be happened.And the proteome tells you what is happening.,Summary,本章学习要点理解 Genomes,Transcriptomes 和 Proteomes三个名词，并阐明它们在基因组表达过程中是如何联系在一起的；理解基因由DNA（或RNA）组成的三个实验；掌握双螺旋结构的关键特征；正确区分编码RNA和功能性RNA；描述蛋白质结构的不同层次；描述遗传密码的关键特征；掌握转录组学和蛋白质组学的一般研究方法，特别是SAGE技术、微阵列和基因芯片技术以及鉴定蛋白质相互作用的技术（噬菌体展示、酵母双杂交等）。,