分子标记辅助育种ppt课件.ppt

第十六章 分子标记辅助选择育种,第一节 分子标记的类型和作用原理 第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 第三节 作物MAS育种,育种工作的关键：如何提高选择效率传统育种一般是首先通过各种途径创造遗传变异，然后从分离群体的后代中进行优化选择和评价，这种选择是建立在植株的表现型基础之上的，这就要求育种家必须具有丰富的实践经验，而且费时、费力。作物的许多重要农艺性状为数量性状，或为多基因控制的质量性状为表型难以准确鉴定的性状。此时根据表现型来对性状进行评价是不确切的，因而选择是低效的。,遗传标记：可以稳定遗传的，易于识别的特殊的遗传多态性形式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变（差）异；在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。,形态标记(morphological markers)：指植物的外部形态特征，如矮秆、白化、黄化、变态叶、雄性不育等。,不足,（1）数量有限，而人工培育形态标记材料的周期长；（2）一些形态标记的多态性差，易受环境因素的影响；（3）一些形态标记对植株的表型影响太大，与不良性状连锁,细胞学标记(cytological markers)细胞内染色体的变化，包括染色体数目或结构的变异可通过染色体核型（染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C、N、G带等）分析来测定基因所在的染色体及相对位置，或通过染色体代换等遗传操作来进行基因定位。,Cytogenetic Mapping（1）,采用染色体染色的方法区分染色体异染色质和常染色质、染色体长短、臂比、中心粒位置等等进行染色体分型。为了显示染色体的结构改变，从60年代起建立了一系列染色体显带技术，包括Q、G、C、R、T带分析等。其中应用最广的是G显带技术。为了进一步提高分辨率，后来又建立了高分辨G显带技术，可把染色体的细微变化精确地定位到某一特定染色体的某一区带上。,CytogeneticMapping（2）,细胞遗传学基因定位示意图，从图中可以看出，不同基因定位于染色体不同位置上。这种结果仅仅是粗略的定位，显示的是基因在染色体上的物理定位。,Cytogenetic Mapping（3）,采用荧光染色体原位杂交的方法进行细胞学遗传学定位图示：不同的探针采用不同的荧光标记，从而可以进行荧光定位分析。,不足,（1）细胞学标记材料的选育需要花费大量的人力和较长的时间；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感或适应变异的能力差而难以获得这类标记；（3）一些不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状则难以用细胞学方法检测；,生化标记(biochemical markers)利用基因的表达产物，主要包括贮藏蛋白、同工酶（具有同一底物专一性的不同分子形式的酶）和等位酶（由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同）等，可以直接反映基因表达产物的差异，受环境的影响较小。不足：标记数量远远不能满足实际的需要;存在组织和器官特异性。,特点（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定。（2）数量多（理论上遍及整个基因组）（3）多态性高（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。（6）成本不太高,目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用。,显性标记(dominant markers)：指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD、AFLP、ISSR等。共显性标记(co-dominant markers)：指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。如RFLP、SSR、SCAR等。,F1 P1 P2,F1 P1 P2,一、分子标记的类型和特点,分子标记,以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记）,以PCR技术为核心的DNA标记技术（RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、AFLP标记、STS标记）,以测序为基础的新型的分子标记（SNP标记、EST标记）,第一节分子标记的类型和作用原理,二、分子标记的原理和遗传特性,(一)RFLP（限制性片断长度多态性）标记,特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。,1、RFLP标记原理,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针结合部位,限制性内切酶酶切后；电泳分离DNA片段；转移至硝酸纤维素薄膜；与放射性探针Southern杂交放射性自显影或酶学检测分析阳性条带。可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。,1、RFLP标记原理,（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,2、RFLP标记的特点,第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR反应）为基础的各种DNA指纹技术。,PCR技术的原理,1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。,二、分子标记的原理和遗传特性,(二)RAPD（随机扩增多态性DNA）标记,Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。,1、RAPD标记原理,（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性）不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。,2、RAPD标记的特点,二、分子标记的原理和遗传特性,(三)AFLP（扩增片断长度多态性）标记,AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由Marc 和Pieter 发明创造的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。,1、AFLP标记原理,对基因组DNA进行双酶切，在使用的两种限制性酶中，一种为酶切识别位点为4碱基的酶，另一种为识别位点为6碱基的酶。进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加13个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。,2、AFLP标记的特点,（1）结合了PFLP稳定性和PCR技术高效性的特点，不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。（2）多态性丰富（3）标记多数具有共显性表达，无复等位效应，表现孟德尔方式遗传。（4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的质量要求也较高。,二、分子标记的原理和遗传特性,(四)SSR（简单重复序列）标记,又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记；它是一类由1-6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置。如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。,1、SSR标记的原理,微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果,2、SSR标记的特点,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；数量几乎无限，（2）SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,DNA分子标记在植物生物技术中的应用,DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：,构建高密度的遗传连锁图：在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。,进行基因定位：基因定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。,遗传多样性和物种亲缘关系：分子图谱的构建和基因定位更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。,表1 96份参试材料的编号及名称,表 多态性的SSR引物,图 96份大麦材料的SSR标记聚类图,图3 当K=4时基于模型的Strcture分析,种质鉴定和遗传背景分析：利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺性状基因，分离和鉴别遗传材料，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结构畸变的检测。,育种中的分子标记辅助选择：长期以来，植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。,第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术,目标基因的标记筛选是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。,分子标记与目标基因紧密连锁标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。不同遗传背景选择有效。,用于MAS育种的分子标记须具备三个条件：,一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记,第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术,1、构建遗传图谱的意义：确定不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定等提供理论依据。但是，由于分子标记数目的限制，目前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少。,2、遗传作图的原理 与经典连锁检测一致，即基于染色体的交换与重组。用重组率来表示基因间的遗传距离。,第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术,3、遗传图谱构建的主要环节,第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术,构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。而亲本间适度的差异范围因不同物种而异。,第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术,4、用于分子标记的遗传作图群体,1）暂时性分离群体：包括F2群体、BC1等。这类群体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用，由于每个单株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了该群体的作图能力；2）永久性分离群体：包括重组自交系群体（RIL）（由F2经多代自交一粒传后使后代基因组相对纯合的群体）、加倍单倍体群体（DHL）等。这类群体中分离单位为株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体之间的基因型是相同且纯合的，自交后不会发生分离，因此可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用。,不同作图群体的特点,（一）质量性状的分子标记,二、分子标记与基因定位,寻找与质量性状紧密连锁的DNA标记主要有两个目的：在育种中对质量性状进行标记辅助选择，对质量性状基因进行图位克隆。,主要途径：,近等基因系分析法（Near Isogenic Lines Analysis，NIL）群体分离分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）,1、NIL（近等基因系）分析法,NIL分析法的原理：如果一对近等基因系在目标性状上表现差异，那么凡是能在这对近等基因系之间揭示多态性的分子标记就可能位于目标基因的附近。因此利用NIL材料，可以寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。,基本步骤：1）筛选与目标基因连锁的分子标记：利用分子标记技术分析一对近等基因系，筛选在两者间表现出多态性的引物或探针。2）进行标记与目的基因连锁的验证：利用多态性标记/探针对近等基因系间杂交分离群体中的单株进行筛选，确定每个单株的标记基因型。同步对分离群体中单株的目标性状进行调查。3）基因定位：利用Mapmaker等软件确定目标性状与标记之间的连锁关系，并计算遗传距离和绘制连锁图。,1、NIL分析法,2、BSA（群体分离）分析法,BSA法是从近等基因系分析法演化而来的，它克服了许多作物没有或难以创建相应的NIL的限制，对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较底的植物，利用BSA法也是快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。,2、BSA分析法,BSA分析法的原理,在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病、可育与不育等），将个体或株系分成两组，分别将两组中的个体或株系的DNA等量混合，形成相对的DNA池（DNA pool）。这两个DNA池之间除了在目标基因座所在染色体区域的DNA组成上存在差异外，来自基因组其它部分的DNA组成应该是完全相同或基本相同的，即两DNA池间差异相当于两近等基因系基因组之间的差异，或者说构成了一对近等基因DNA池。因此在这两个DNA池之间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基因连锁。,基本步骤,1）根据目标性状表型或基因型的相对差异构建两个近等DNA池或代表群，寻找在两者之间表现多态性的标记。2）利用分离群体验证候选标记是否与目标基因紧密连锁。3）根据标记基因型的分离比例和单株目标性状分离比例进行遗传作图。,2、BSA分析法,（二）数量性状的分子标记,数量性状的遗传是受多基因控制的，遗传基础复杂，易受环境因素影响，表现为连续变异，表现型与基因型之间没有明确的对应关系。因此长期以来对数量性状的遗传研究只能借助于数理统计的手段，将控制数量性状的多基因系统作为一个整体来研究，使人们无法了解单个基因在基因组中的位置和效应，制约了人们在育种中对数量性状的遗传操纵能力。而分子标记的出现为深入研究数量性状的遗传基础提供了可能。,（二）数量性状的分子标记,控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。借助与QTL连锁的分子标记，在育种中人们就能够对有关QTL的遗传进行追踪，提高对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。,主要途径：,基于性状的分析法（trait-based analysis，TB）以数量性状表型为依据进行分组。基于标记的分析法（marker-based analysis，MB）以标记基因型为依据进行分组,（三）QTL定位的主要方法,常用的主要有区间作图法、复合区间作图法、多元回归法、已知完整连锁图作图法等，并开发出一些功能很强的软件包，如Map Manager、Mapmaker/QTL、Linkage、WinQTLCart等。这些程序包都可以从因特网上免费下载（www.stat.wisc.edu/biosci/linkage.html）。利用这些方法，可将控制某一数量性状的多个QTL进行分解，像研究质量性状一样，将它们分别定位于染色体上，并分析各个QTL的单个效应及互作效应。,第三节 作物MAS育种,一、作物MAS育种须具备的条件,分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。,（一）回交育种,二、MAS育种方法,由单基因或寡基因等质量性状基因控制的主要农艺性状，若利用分子标记辅助选择，针对每一回交世代结合分子标记辅助选择，筛选出含目标基因的优异品系，进一步培育成新品种。,受体亲本 供体亲本(不含优质基因)(含优质基因),F1 受体亲本,BC1,目标基因定位,标记辅助选择,中选BC1 受体亲本(含优质基因),BC2,BC3,标记辅助选择,标记辅助选择,中选BC3(含优质基因),新育成的优质品种(受体亲本遗传本背景+优质基因),自交,目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图,中选BC1 受体亲本(含优质基因),（二）大范围群体内的单目标基因（SLS-MAS）分析方法,基本原理在一个随机杂交的混合群体中，首先在一个很大群体中利用分子标记辅助选择目标性状，尽可能使选择群体足够大，使中选的植株就目标位点纯合，而在目标位点以外的其它基因位点上保持有大的遗传多样性，最好仍呈孟德尔分离，这样，分子标记筛选后，仍有很大遗传多样性供育种家通过传统育种方法选择，产生新的品种和杂交种。这种方法对于分子标记辅助选择质量性状或数量性状均适用。,1）利用传统育种方法结合DNA指纹图谱选择用于MAS的优异亲本，特别对于数量性状而言，不同亲本针对同一目标性状要具有不同的重要的QTL。即具有更多的等位多样性。2）确定某重要农艺性状QTL标记。利用中选亲本与测验系杂交，将F1自交产生分离群体，一般200-300株，结合F2-3株行田间调查结果，以确定主要QTL的分子标记。3）结合筛选的QTL标记，对上述分离群体中单株进行SLS-MAS。4）根据标记有无选择目标材料。由于连锁累赘，除中选QTL标记外，使其附近其它位点保持最大的遗传多样性。通过中选单株自交，根据本地生态需要进行系统选择，育成新的优异品系。或将中选单株与测验系杂交产生新杂种。,基本步骤,（三）MAS聚合育种,在实际育种工作中，通过聚合杂交将多个有利目标基因聚集到同一品种材料中，培育成一个具多种有利性状的品种，如多个抗性基因的品种，在作物抗病虫育种中保证品种对病虫害的持久抗性将有十分重要的作用。,但是，由于导入的新基因表现常被预先存在的基因所掩盖或者许多基因的表型相似难以区分、隐性基因需要测交检测、或接种条件要求很高等，导致许多抗性基因不一定在特定环境下表现出抗性，造成基于表型的抗性选择将无法进行。,MAS可利用分子标记跟踪新的有利基因导入，将超过观测阈值外的有利基因高效地累积起来，为培育含有多抗、优质基因的品种提供了重要的途径。,受体亲本 供体亲本A(无优质基因)(含优质基因A),受体亲本 供体亲本B(无优质基因)(含优质基因B),F1(含优质基因A)F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C(无优质基因)(含优质基因C),中选杂种个体 F1(含优质基因A和B)(含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本(含优质基因A、B和C),新育成的优质品种(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标记辅助选择,自交,标记辅助选择,标记辅助选择,标记辅助基因聚合,与品质改良相结合程序图,进行MAS选择的限制因素,作物基因作图速度还相当缓慢，一些重要性状的分子标记与目标性状间的遗传距离仍较大，不符合MAS的要求。已筛选出的分子标记在不同遗传背景中表现不稳定，甚至同样的目标基因同样的标记在不同群体中其重组率会有差异。特别是呈数量性状遗传的性状的分子标记更易受遗传背景影响。基于PCR技术的标记数量有限。特别是已筛选到一些与重要农艺性状基因的分子标记大都不是PCR标记，因此不易应用于MAS中。,利用分子标记技术进行MAS的成本较高，不能满足大规模育种选择的需要。生物技术手段与常规育种严重脱节。作物育种学家与分子遗传学家之间的有机结合、沟通不够。,三、提高分子标记的筛选效率,（一）多重PCR方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低MAS育种的成本,三、提高分子标记的筛选效率,（一）多重PCR方法 为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应。,三、提高分子标记的筛选效率,（二）用相斥相分子标记进行育种选择 所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。通过相斥标记（特别是显性标记）的选择，可将群体中含标记而不含目标性状基因的纯合体、含目标性状基因的杂合体全部剔除，仅剩下无标记而含目标性状基因的植株。,三、提高分子标记的筛选效率,（三）克服连锁累赘 回交育种是作物育种常用的育种方法，但回交育种中长期以来存在的问题是在回交过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导入受体，导致改良的品种与预期的目标不一致，这种现象称为连锁累赘(Linkage drag)。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以显著地减轻连锁累赘的程度。如利用目标性状基因左右两侧1cM之内的标记只需2个世代即可从分离群体中筛选出供体DNA片段最小但携带目标基因的个体，而传统的选育方法可能平均需要100代。,（四）降低MAS成本的策略,样品DNA提取。采用微量提取法如利用小量组织或半粒种子且不需液氮处理的DNA提取技术。且不采用特殊化学药品，降低成本。减少PCR反应时的体积。如将反应体积从25l降低到1015l。琼脂糖凝胶。实验表明同一琼脂糖凝胶可以多次电泳载样，而不会造成样品间互相干扰，因此可以多次重复使用。扩增产物检测。通过改造染色系统，利用亚甲蓝、甲烯蓝染琼脂糖凝胶，可直接在可见光下检测。,分子标记辅助选择与常规育种结合,分子标记辅助育种加速了常规育种进程 分子标记辅助育种手段与常规育种是相辅相成的。尽管常规育种可以把高产，优质，抗病基因综合到一个品种，但其间需通过大量的基因重组、筛选过程，还掺杂有筛选遗漏问题。其周期长，工作量大。而利用分子标记辅助选择技术大大减少了其连锁累赘现象，增加了目标性，在回交低世代即可找到其目标材料。,常规育种方法是所有新品种选育的必经之路 目前看来，分子标记辅助育种技术还不成熟、不完善。利用分子标记辅助选择技术能作为一种快速、准确、有效的选择手段。但是，分子标记辅助育种技术只有与常规育种相结合，才能更快地并且定向地同步改良农作物的产量、品质、抗逆性。因此，利用分子标记辅助选择技术得到的优异种质仍要通过常规育种方法选择培育，才可真正用到育种中去，尽快在生产上产生经济效益。总之，分子标记辅助育种的优越性只有通过常规育种才可表现出来。,思考题,1、几种主要分子标记的类型及遗传特点?2、举例说明重要农艺性状基因定位的原理和方法。3、如何理解分子标记技术的发展为作物育种工作注入了新的活力?,