紫外可见分光光度法课件.pptx

紫外可见分光光度法,紫外可见分光光度法,第一节 紫外可见吸收光谱,第一节 紫外可见吸收光谱,一、电磁辐射的基本性质 1.电磁辐射的定义：,电磁辐射是物质的一种运动形式，是物质分子、原子的内部运动以辐射能量的 形式在外部的 表现,一、电磁辐射的基本性质 电磁辐射是物质的一种运,（2）具有波粒二象性。对光波来说，产生感光作用与生理作用的是电场强度 E。,2.说明：,（1）电磁辐射又称电磁波,（3）能量 E 与频率（）、波长（）、速度（C）、周期（T）的关系：,E=h=hC/,=1/T,(4)单位是：E-J,eV h=6.626 10-34 J.s-m,nm,m-s-1(Hz)T-s,（2）具有波粒二象性。对光波来说，产生感光作用与生理作用,射线 X射线 远紫外区 近紫外区 可见光区 10-1 nm 10-1-10nm 10-200nm 200-400nm 400-760nm 近红外区 中红外区 远红外区 微波 无线电波0.76-2.5 m 2.5-50 m 50-300 m 0.3mm-1m 1-1000m,二、电磁波谱,（1）定义：电磁波谱按波长的长短顺序排列，简称电磁谱,（2）分类：,射线 X射线 远紫外,2.选择性吸收：分子或离子中的价电子的能级跃迁，要求光吸收的能量应与跃迁的能级差（E）相适应，即光子的频率有,三、光辐射的选择性吸收,1.光通过物质发生：透射、散射、折射、色散、吸收、光致发光等,E=h,2.选择性吸收：分子或离子中的价电子的能级跃迁，要,白光是复合光，两种相应颜色的 光按适当的比例混合可成为白光，这两种光互称为互补光。,3.光的互补性：,白光是复合光，两种相应颜色的 光按适当的比例,四、分子吸收光谱的产生,1.一个分子总能量 E 是由以下几部分组成：,四、分子吸收光谱的产生 1.一个分子总能量 E 是由以下,在一定的条件下（如温度、溶剂等确定），能量变化为：,E=E电子+E振动+E转动,其中：,E电子：120 eV,E振动：0.051 eV,E转动：0.05 eV,E电子 E振动 E转动,即：,在一定的条件下（如温度、溶剂等确定），E,2.电子能级跃迁在 200760 nm。,3.分子吸收光谱为一带状光谱,原因：分子发生电子能级之间的跃迁时，不可避免地也要发生振动和转动。振动波长间隔为 5nm，转动波长间隔为0.25nm由于彼此间隔太小，分光光度计分辨能力不够，谱线密集连在一起，呈现带状，故称为带状光谱。,2.电子能级跃迁在 200760 nm。3.分子吸,五、吸收曲线,吸光度 A 不同波长的光透过某一固定浓度的 有色溶液，可测得每一波长下对光 的吸收程度，即吸光度（A）,2.吸收曲线 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标 作图所得的曲线。如下图所示，或 称为吸收光谱。,五、吸收曲线 吸光度 A 不同波长的光透过某一固定浓,3.说明,（1）吸收强度最大处所对应的 波长称为最大吸收波长max。,（2）在一定溶剂下，对于某一物质有：max=const.,（3）溶液的浓度不同，A不同（在同一波长下）,（4）吸收曲线的高低取决于：,浓度（C）,分子内部结构（）,Amax3.说明（1）吸收强度最大处所对应的（,六、紫外-可见吸收光谱的产生,物质吸收的光线在紫外区或可见光区内，所得谱图称为紫外可见吸收光谱。,（一）基本概念,n 电子：未共享的电子，或称为非键电子。对于 二、三周期元素，n电子即为p电子。如 O、X、N、S、P等,键电子：形成单键的 电子,键电子：形成双键的电子,能量高低顺序：,E E En E*E*,六、紫外-可见吸收光谱的产生 物质吸收的光线在,（二）有机化合物常见跃迁类型,*、n*、n*、*,.,n,跃迁所需能量：,*n*n*,（二）有机化合物常见跃迁类型*、n*、n,（三）不同跃迁所需能量不同，所对应吸光 强度亦不相同,*吸收 电荷转移吸收光谱*吸收 n*吸收 n*吸收 配位体场吸收,（四）产生紫外-可见吸收光谱的条件,1、分子中价电子能发生n*、n*、*三种跃迁。,2、不同跃迁对应的摩尔吸收不同（系数为）,*n*n*,（三）不同跃迁所需能量不同，所对应吸光*吸收,七、有机化合物的紫外可见吸收光谱,化合物的结构（S）与、的关系,(s)=(、)=(energy),（一）基本概念,1.长移（红移）：,某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团（如：-NH2、-NR2、-OH、-OR、-Cl、-Br、-I、-SH、-SR等）之后，使原吸收峰的波长向长波方向移动，同时产生n*、n*吸收峰。,七、有机化合物的紫外可见吸收光谱化合物的结构（S）与、,CH3H,如：,*,吸收,波长(nm),125135,CH3 I:,*,150210,n*,259,2.助色团：,能使吸收峰长移的杂原子基团称为助色团,如：上例的-I,CH3H如：*吸收波长125135CH3 I,3.生色团（发色团）,有机化合物分子含有的不饱和基团，其跃迁为：,n*、*,（1）n*所需能量取决于 n 电子的性质,(CH3)2O,(CH3)2 S,max,184 nm,229 nm,能量:,E n*(O)E n*(S),3.生色团（发色团）有机化合物分子含有的不饱和基团，其跃迁,（2）*n*,一般：,*10 4,n*100,C=CC=O、C=CC=C,：10 4 210 4,：10 3 10 4,（3）共轭双键的有机化合物，由于大 键的形成，电子容易激发，吸收峰发生长移，此时：,、max,（2）*n*一般：,（二）有机化合物的吸收带,吸收峰在光谱中所处的位置称为吸收带,R 吸收带,n*助色团、100，易被强吸收峰掩盖,K 吸收带,*生色团、10 4、max 217-280 nm,共轭双键数目,max。,B 吸收带,芳香化合物特征吸收带（精细结构吸收带），102 103。苯环：max 254 nm，200,E 吸收带,芳香化合物特征吸收带，2103 2105 常有 E1 带和 E2 带,E1=5104,E2=7103,苯,（二）有机化合物的吸收带吸收峰在光谱中所处的位置称为吸收带R,（三）溶剂效应,产生光谱的原因,结构（内因）,溶剂（外因）,1.精细结构,物质处于气态时，其吸收光谱由孤立分子给出，因而转动、振动光谱也能表现出来，即为所谓的精细结构。,在溶液中,在气态,（三）溶剂效应产生光谱的原因结构（内因）溶剂（外因）1.精,2.溶剂化,物质溶解于溶剂后被溶剂分子包围，即为溶剂化。,3.溶剂效应对吸收光谱的影响,（1）溶剂极性增大，精细结构消失,（2）溶剂极性增大，由*跃迁谱带移向长波，即红移。原因：激发态*的极性 基态 极性,即：*易受溶剂极性影响，降低能量大,E非 E极,2.溶剂化物质溶解于溶剂后被溶剂分子包围，即为溶剂化。3,（3）溶剂极性增大，由n*跃迁谱带移向短波，即蓝移。原因：非键电子与极性溶剂（如水、乙醇等）形成氢键，能量降低大。,E极 E非,（4）溶剂本身有吸收，如物质吸收与其吸收重叠，将 妨碍物质吸收。因此选择溶剂应注意其波长限度。,（3）溶剂极性增大，由n*跃迁谱带移向短波，n*n,（四）紫外可见吸收光谱的应用,1.定量分析,2.有机化合物的鉴定（对照法）：根据吸收光谱的特征吸收峰的数目、位置、强度（）、光谱图的形状。,3.纯度检查,4.有机化合物的结构推断（配合红外、质谱、核磁共振谱）,（四）紫外可见吸收光谱的应用1.定量分析2.有机化合物,第二节 光吸收定律,第二节 光吸收定律,一、朗伯比尔（Lambert-beer）定律,（一）透光度和吸光度,I 0=I a+I t+I r,由于每次测量的反射光强度基本相同，影响抵消：,I 0=I a+I t,一、朗伯比尔（Lambert-beer）定律（一）透光度和,规定：透光度（或透光率）T 为,因此：T、吸收,定义：吸光度 A,规定：透光度（或透光率）T 为因此：T、吸收,（二）朗伯-比尔定律,在设定条件为：（1）单色、平行光，垂直照射（2）溶液透明均匀：C=const.,根据数学推导可得：,-朗伯-比尔定律,式中：b-比色池的厚度 c-溶液的浓度 k-吸光系数,适用条件：均匀、非散射介质,不适用于：非单色光、高浓度溶液,（二）朗伯-比尔定律在设定条件为：（1）单色、平行光，垂,二、吸光系数与灵敏度,k-吸光系数，与入射光波长、温度 t、吸光物质本性有关,1.摩尔吸光系数（cm-1mol-1L）,当单位为 b cm、c-mol L-1 时，k=,-稀溶液,影响 的因素：=f(、t、分子结构）,、灵敏度,提高灵敏度的方法：,，b,104,可测 10-6 10-5 mol L-1,104,可测 10-4 10-3 mol L-1,二、吸光系数与灵敏度k-吸光系数，与入射光波长,2.吸光系数 a（L g-1 cm-1）,b cm,c g L-1 时 k=a.A=a b c,=M a（M 吸光物质分子量）,3.百分吸光系数,b cm,c 百分浓度（W/V)%时,与、a 的关系,2.吸光系数 a（L g-1 cm-1）,例题：浓度为 0.5 g.ml-1的Cd2+溶液，经显色剂显色后，在518nm处用1cm 吸收池进行测定，测得透光率为T=44.5%,求、a 和（MCd=112.4）.,解：,C=0.5 g.ml-1=0.510-6 g100/100 mL=510-5 g/100mL,b=1 cm,例题：浓度为 0.5 g.ml-1的Cd2+溶液,三、吸光度的加和性和光强的加和性,1.吸光度的加和性,对于同一波长，照射多组分溶液,成立条件：与朗伯比尔定律相同 用于彼此不相互作用的多组分同一溶液,三、吸光度的加和性和光强的加和性1.吸光度的加和性对于同一,2.光强的加和性,不同波长1、2、n 的平行光照射同一组分,则：,I0=I01+I02+I0nIt=I1+I2+In,仪器响应：,2.光强的加和性不同波长1、2、n 的平行光照,四、比尔定律的基本限制,A=kc,A=kb,（b=常数）,（c=常数）,Beer定律,Lambert定律,必须在使用适当波长的单色光为入射光的条件下，吸收定律才成立。单色光越纯，吸收定律越准确。,2.比尔定律只有在稀溶液才能适用,高浓度时，粒子间作用力大，影响粒子电荷分布，因而改变它们对特定辐射的吸收能力，即 改变，偏离了Beers定律。=f(c).,当 C 0.01mol.L-1,认为吸光粒子的行为相互无关。,四、比尔定律的基本限制A=kcA=kb（b=常数,五、光度测定误差,测定过程误差：化学的、物理的和人为的误差。,（一）仪器误差（读数误差、杂散光引起的误差）,1.入射光的“非单色”性,五、光度测定误差测定过程误差：化学的、物理的和人为的误差。,讨论：,当1 2,3,n 时，A与c不存在线性关系。,当1 2,3,n 时，A=0，A=A1=1 bc,因此，光吸收定律只有在单色光时才严格遵守。,讨论：当1 2,3,n,2.杂散光的影响,杂散光通常是指仪器内部通过非预定途径照射到检测器上的额外光辐射（Is）。,即 入射光,I0+Is=I0,透过光,I+Is=It,仪器所测：,设杂散光占入射光的分数为 S：,2.杂散光的影响 杂散光通常是指仪器内部通过,实际工作中 I0 Is Is/I0 1,即 S 1 1+S 1,=A真+A,测,T T+S A 0,A 测 A 真,实际工作中 I0 Is Is,3.仪器的读数误差,分光光度计作为仪器，其误差可来源于光源、检测器、显示系统，但其总和体现在读数误差上。对于同一仪器，因T的读数标尺刻度均匀，即 T为定值，通常在 0.2%1%之间。,T 测定的误差直接体现于定量分析时的浓度测定误差。,3.仪器的读数误差 分光光度计作为仪器，其误,根据 Beers 定律：,近似有：,c/c-测量浓度的相对误差，取决于 T 和 透光率T的大小,根据 Beers 定律：近似有：c/c-,设 T=0.01,以T为横坐标，c/c 为纵坐标作图：,结论：,透光度太大或太小，浓度测量的相对误差均较大；,透光度在15%-65%，即吸光度在 0.20.8 时，浓度测量的相对误差较小；,误差最小点其透光度为 0.368,吸光度为 0.434，当 T=0.01时，c/c 为 2.7%。,设 T=0.01,以T为横坐标，c/c 为,（二）化学误差,被测物质在溶液中发生缔合、离解或溶剂化等化学反应造成的这类误差。,平衡效应,聚合平衡、酸碱平衡、氧化还原反应、配位平衡,溶剂效应,*，红移，max、改变,n*，蓝移，max、改变,试剂和溶剂中的杂质,试样中的干扰物质,（二）化学误差 被测物质在溶液中发生缔合、离,第三节 紫外可见分光光度计,第三节 紫外可见分光光度计,基本组成：,一、光源,1.钨灯和卤钨灯,发射波长：320，2500 nm，可见光区和近紫外区，属连续光源，,2.氢灯或氘灯,发射波长：180，375 nm，光强 I氘 I氢，紫外光区，石英材料，连续光源,基本组成：光源单色器吸收池检测器显示记录系统一、光源1.钨,二、单色器,组件：,准直镜,作用：变为平行光,1.光电比色计的滤光片,作用：让一定波长的光通过，而将其它波长的光滤掉,分类,吸收型,干涉型,二、单色器组件：入口狭缝透镜色散元件透镜出口狭缝准直镜作用：,2.色散元件,玻璃棱镜，340，1000 nm（30o Littrow）,石英棱镜，185，3500 nm,棱镜,光栅,平面反射光栅，几百纳米-几百微米（常泽尼特式）,自准式,2.色散元件玻璃棱镜，340，1000 nm,入口狭缝出口狭缝准直镜泽尼特式光,三、吸收池（比色皿）,1.分类,玻璃（可见）,石英（紫外可见）,2.用途 用于盛装空白液和待测液,3.规格 以光程为标志 0.5，1，2，3，5，10 cm,4.质量检查,三、吸收池（比色皿）1.分类玻璃（可见）石英（紫外可见）,四、检测器,常用的有：光电池、光电管、光电倍增管,（一）硒光电池,1.结构,+_光半透明电极半导体 Se金属板四、检测器常用的有：光,2.原理：,3.特点,感光波长 250750 nm,最敏感区 500600 nm,灵敏峰 530 nm,灵敏度显著下降,2.原理：光Se电子半透明金属膜电流计3.特点感光波长,（二）光电管,蓝敏光电管：阴极 Cs、Sb 200,625 nm,红敏光电管：阴极 Cs2O、Ag 625,1000 nm,（二）光电管蓝敏光电管：阴极 Cs、Sb,（三）光电倍增管,K-光敏阴极 14-倍增极 A-阳极 R，R1R5-电阻,光电倍增管原理基本上与光电管相同，只是多了几个倍增极。放大倍数 10 6-107。灵敏度高。,（三）光电倍增管K-光敏阴极 14-倍增极 A-,五、信号显示系统,检流计,电位调节指零装置,自动记录和数字显示装置,微处理机控制和数据处理系统,五、信号显示系统检流计电位调节指零装置自动记录和数字显示装置,六、分光光度计的类型与结构简介,1.分类,手动可见分光光度计：72、721、722手动紫外分光光度计：,2.单波长单光束分光光度计,光源：钨灯,色散系统：自准式棱镜,波长范围：360800 nm,2.单波长单光束分光光度计光源聚光透镜色散棱镜准直镜保护玻,3.单波长双光束分光光度计,M0光单反旋转装置光电倍增管样参比池单波长双光束分光光度计原,4.双波长分光光度计,优点：,在有背景干扰或共存组分的吸收干扰下，可以测定某一组分。,光 源单 色 器单 色 器检测器12切吸双波长分光光度计,第四节 分析条件的选择,第四节 分析条件的选择,一、选合适的入射光波长,（一）原理,无干扰时（或干扰最小时）,选,max,吸光度最大,偏离比尔定律最小,有干扰时,选,吸收最大干扰最小,最大吸收原则,一、选合适的入射光波长（一）原理无干扰时选max吸光度最大,（二）实验确定方法,1.用标准先分别作出 A 图,2.确定满足条件的,（二）实验确定方法1.用标准先分别作出 A 图2.,二、选择适当吸光度范围,T=const.，选 T=15%-65%,三、选择适当的空白溶液,利用空白溶液来调节仪器零点，消除比色皿及溶剂对入射光的反射及吸收带来的误差。,二、选择适当吸光度范围 T=const.，选 T=,第五节 定量分析,第五节 定量分析,一、单组分定量分析,A=bc,c=?,一般方法,绝对法：已知 或 a，求 c,标准曲线法,标准对照法：csAs，cx(?)Ax,吸光系数法,、max 已知，求 c,一、单组分定量分析A=bc c=?一般方法绝对法：已,二、多组分定量方法,不同的波长 j 有：,(j=1,2,3,l),1.对于两组分：l=2,j=1n(n 2),上述方程称为病态方程，未知物浓度与取点有关。（特别是在计算法）,（一）联立方程法,二、多组分定量方法 仪 器AA iA i=i b c,2.A i=i b ci 首要条件保持线性,选最大吸收 max,待测样品浓度小,3.消除测量误差，可采用多次测量，病态方程用最小二乘法或线性规划法求解。,4.此法仅适用于两组分体系。,例如含两组分a、b的混合物，在波长1、2处测得混合物的吸光度A1和A2，则有：,2.A i=i b ci 首要条,解得：,解得：,（二）双波长分光光度法,原 理,两束不同波长单色光1、2，以1为参比波长，以 2 为测定波长，在单位时间内交替照射同一溶液，测得吸光度分别为A1、A2，则有：,A1=1bc,A2=2bc,A=A2-A1=(2-1)bc,在同一条件下，b、2 和1 均为常数，故 A 与待测组分的浓度成正比。,（二）双波长分光光度法原 理 两束不同波长单,等吸收双波长法,A与组分b无关，与a的浓度成正比,由图可知：,实验应符合两个基本条件：,干扰组分b 在两波长有相同吸收 待测组分的A足够大,等吸收双波长法12abAA与组分b无关，由图可知：实,第六节 应用实例,第六节 应用实例,一、酸性磷酸酯酶的分析,酸性磷酸酯酶（ACP）存在于前列腺、红细胞、血小板、肝脏等脏器和组织中。植物种子如小麦胚芽中也大量存在。,本实验利用小麦胚芽为原料，对硝基苯磷酸脂为底物，测定产物对硝基酚的生成量来了解酶的活性。,一、酸性磷酸酯酶的分析 酸性磷酸酯酶（ACP）,黄色产物在波长405nm处有强吸收，其 为1.88104。,黄色产物在波长405nm处有强吸收，其 为1.8810,二、新生儿血清胆红素的测定,血清胆红素浓度在新生儿高胆红素血症治疗中 是不可缺少的指标。新生儿胆红素大都是游离胆红 素，其浓度正比于455nm处的吸光度。但血红蛋白 在此处亦有较大吸收。发现血红蛋白在 455nm 和 575nm处具有相同的吸收，故可采用双波长分光光 度法，选取455nm为测定波长，575nm为参比波长，吸光度差值正比于游离胆红素浓度，根据标准曲线 即可计算出血清中胆红素的浓度值。,二、新生儿血清胆红素的测定 血清胆红素浓度在,本 章 重 点 内 容,分子吸收光谱产生的原理。为何是带状光谱？,2.有机化合物常见的跃迁类型。产生紫外可见吸收光谱的条件。红移、蓝移，生色团、助色团。,3.有机化合物的吸收带。溶剂对吸收光谱的影响。,4.朗伯比尔定律及其适用条件。各种吸光系数及其相互间计算。光度测定误差与实际测定的关系。,5.分光光度计的基本构成。,6.定量分析方法-对照法、联立方程法、双波长法。,本 章 重 点 内 容分子吸收光谱产生的原理。为何是带状光谱,