第四章蛋白质与酶的化学修饰课件.pptx

第四章 蛋白质与酶的化学修饰,4.1、概述4.2、化学修饰的设计4.3、化学修饰的种类4.4、修饰酶的性质及特点4.5、化学修饰的应用4.6、化学修饰的局限性,第四章 蛋白质与酶的化学修饰4.1、概述,4.1、概述,目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种,为什么？,4.1、概述目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有,一、限制酶的应用的原因,1、稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2、作用的最适条件不符。3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶活性不够高,一、限制酶的应用的原因 1、稳定性不够，不能适应大量生产的,二、改变酶特性有两种主要的方法,1)通过化学修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。,二、改变酶特性有两种主要的方法1)通过化学修饰的方法来改变,三、酶化学修饰的概念,酶的化学修饰（chemical modification）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。,三、酶化学修饰的概念酶的化学修饰（chemical mod,四、酶化学修饰的目的,1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。,四、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50,五、酶化学修饰的原理,1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,五、酶化学修饰的原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性,3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶,4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除；“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合。,4、如何消除酶的抗原性,5、酶微环境稳定的维持pH值改变时：破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一 层“缓冲外壳”。,5、酶微环境稳定的维持,4.2、化学修饰的设计,一、酶性质的了解（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等（3）酶侧链基团的性质及其反应性巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等,4.2、化学修饰的设计一、酶性质的了解,二、修饰剂的要求 1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团；试剂的选择要根据修饰目的选择,二、修饰剂的要求,例如对氨基修饰可有几种情况 修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电荷量的试剂。,例如对氨基修饰可有几种情况,用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；修饰反应的程度能简单测定；,用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：,三、反应条件的选择 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例,三、反应条件的选择,四、化学修饰的影响因素,有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰);但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失)。影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。,四、化学修饰的影响因素有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质,一）、蛋白质功能基反应性的影响因素,蛋白质的修饰反应都是亲核反应。被修饰蛋白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。影响蛋白质侧链基团pK值的因素有：1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作用2、基团之间的障碍（位阻效应）3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等,一）、蛋白质功能基反应性的影响因素蛋白质的修饰反应都是亲核,二）、蛋白质功能基的超反应性,超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。,二）、蛋白质功能基的超反应性超反应性：指蛋白质的某个侧链基团,影响因素：1.改变蛋白质功能基的pKa值；2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向；4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5.试剂的结合。,影响因素：,三）、修饰剂反应性的决定因素,1.选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。2.静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用。,三）、修饰剂反应性的决定因素1.选择性吸附：化学修饰前，修,3.位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能提供蛋白质表面的有用信息。4.催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。5.局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水环境能阻止产物中电荷分离的反应。,3.位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、辅因子、抑制剂,4.3、化学修饰的种类,表面修饰内部修饰与辅因子相关的修饰物理修饰 亲和修饰,4.3、化学修饰的种类表面修饰,一、表面修饰,化学固定化小分子修饰大分子修饰肽链的交联,一、表面修饰化学固定化,1、化学固定化,通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，酶的性质也相应发生改变。例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适pH发生偏移。糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖浆生产工艺。载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km增加，反之，Km降低。增加酶分子构象稳定性。,1、化学固定化通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接,2.小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。,2.小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）,几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应,几种重要的修饰反应：,1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。,1)烷基化反应,烷基化反应,烷基化反应,2)酰基化反应试剂特点：含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）,2)酰基化反应,酰基化反应,酰基化反应,3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。,3)氧化和还原反应,连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。,连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。,4)芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：I2+HI 硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH,（四硝基甲烷）,4)芳香环取代反应（四硝基甲烷）,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰氨基修饰（Lys）羧基修饰（Asp、Glu）巯基修饰（Cys）胍基修饰（Arg）羟基修饰（Ser、Thr、Tyr）咪唑基修饰（His）吲哚基修饰（Trp）甲硫基修饰（Met）二硫键修饰亲和修饰,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,1）、氨基（NH2）修饰 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的-NH2 和肽链末端氨基非质子化的-NH2 亲核反应活性很高，易被选择性修饰一般情况下-NH2 的 pKa=10，其解离程度取决于微环境氨基的修饰反应主要有N-烷基化等,1）、氨基（NH2）修饰,乙酸酐,2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),2,4一二硝基氟苯(DNFB),碘代乙酸(IAA),还原烷基化,醛,丹磺酞氯(DNS),乙酰化,电荷消失,芳基化,电荷消失,芳基化,电荷消失,烷基化,引入负电荷,芳基化,电荷消失,引入正电荷,乙酸酐 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)2,4一二硝基氟,2）、羧基（COOH）修饰羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 COOH，以及肽链的末端羧基在水溶液中，COOH 通常解离成负离子，亲核性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、成酰胺反应,2）、羧基（COOH）修饰,修饰反应 羧基碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）,修饰反应 羧基R,R为烷基；X为卤素碳二亚胺,修饰反应 羧基酯化反应,硼氟化三甲洋盐,甲醇,胃蛋白酶与14C硼氟化三甲洋盐在pH 5时酶完全失活，研究表明两-COOH为该酶必需基团,修饰反应 羧基硼氟化三甲洋盐甲醇胃蛋白酶与14C,3）、巯基（SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的-SH巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性最高的基团巯基容易被氧化成 SS，在维持蛋白亚基之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的修饰产物,3）、巯基（SH）修饰,修饰反应 巯基二硫键置换反应,常用于定量测定蛋白质分子-SH数目、研究-SH的改变程度和-SH所处的环境。,4,4-二硫二吡啶（4-PDS）,5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)又称Ellman试剂,412 nm处有强吸收,324 nm处有吸收,TNB,修饰反应 巯基常用于定量测定蛋白质分子-SH数目、研,修饰反应 巯基与含汞有机物的反应（SH 对 Hg 的亲和力很强）,对氯汞苯甲酸(PMB),2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP),250 nm处有最大光吸收,可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析,修饰反应 巯基对氯汞苯甲酸(PMB)2-氯汞-4-,修饰反应 巯基S-烷基化反应,N一乙基马来酰亚胺(NEM),碘代乙酸(IAA),同时会使氨基乙酰化,300 nm处有最大光吸收,修饰反应 巯基N一乙基马来酰亚胺(NEM)碘代乙酸(,4）胍基（N=C(NH2)2）修饰胍基存在于酶蛋白的 Arg 残基侧链上在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用胍基碱性强，难以和大多数试剂反应，一般采用具有两个邻位羰基的化合物，在中性或弱碱性条件下反应，一般是可逆反应,4）胍基（N=C(NH2)2）修饰,修饰反应 胍基（与邻二酮的反应）,丁二酮,硼酸盐,1,2-环己二酮,硼酸盐,苯乙二醛,需在黑暗中进行,因其可作为光敏剂破坏TrpHisTyr等残基,修饰反应 胍基（与邻二酮的反应）丁二酮硼酸盐1,2-,5）、酚基和羟基（OH）修饰酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同时修饰羟基、氨基和巯基Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性，能发生亲电取代反应,5）、酚基和羟基（OH）修饰,修饰反应 酚基和酚羟基酚基亲电取代反应,碘化反应,四硝基甲烷(TNM),修饰反应 酚基和酚羟基碘化反应四硝基甲烷(TNM),修饰反应（酚）羟基O-酰基化反应,N-乙酰咪唑,二异丙基氟磷酸(DFP),修饰反应（酚）羟基N-乙酰咪唑二异丙基氟磷酸(DF,6）、咪唑基修饰 咪唑基存在于酶蛋白的 His 残基侧链上His 是多种酶的活性中心，是电荷中继网中的重要成员对 His 咪唑基的修饰，一般是通过 N-烷基化或 C-亲核取代来进行对咪唑进行修饰后，酶活性一般会受到显著影响,6）、咪唑基修饰,修饰反应 咪唑基N-取代反应,焦碳酸二乙醋（DPC）,碘乙酸,DPC是最常用的His残基的修饰试剂,，使His残基的咪唑基上1个N羧乙基化,并使得在240nm处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是可逆的。,修饰反应 咪唑基焦碳酸二乙醋（DPC）碘乙酸DPC,修饰反应 咪唑基杂环上的亲电取代反应,碘化反应,修饰反应 咪唑基碘化反应,7）、吲哚基修饰 吲哚基存在于酶蛋白的 Trp 残基侧链上Trp 残基疏水性较强，一般位于酶分子的内部，反应活性比氨基和巯基差，因此对其修饰较困难，很多能与吲哚基反应的试剂，一般优先与巯基或氨基反应。有时候 Tyr 会对吲哚基的修饰产生干扰,7）、吲哚基修饰,修饰反应 吲哚基与 Koshland 试剂的反应,水溶性差,使修饰反应较难进行,410nm有光吸收,可测定修饰程度或Trp残基定量,2-羟基-5-硝基苄基或Koshland试剂(HNBB),4一硝基苯硫氯,这些试剂也非常容易与巯基作用，因此修饰色氨酸残基时需要对巯基进行保护。,修饰反应 吲哚基水溶性差,使修饰反应较难进行410,8）、甲硫基修饰 酶蛋白中 Met 残基中的硫以硫醚的形式存在硫醚中的硫原子虽然具有亲核性，但反应活性较差，在温和的条件下一般不发生反应硫醚的主要反应主要是氧化反应，产物为砜和亚砜；另外，采用某些试剂也可以进行 S-烷基化反应,8）、甲硫基修饰,修饰反应 甲硫基,过氧化氢,过甲酸,碘乙酰胺,修饰反应 甲硫基 过氧化氢过甲酸碘乙酰胺,9）、二硫键的修饰同-SH类似,-S-S-具有其特有的特性,可用来进行特异的修饰,通常是通过还原的方法.这些方法通常与某些-SH修饰方法结合,以阻止再氧化成-S-S-或计算断裂开的-S-S-数目。常用的有:巯基乙醇(具高度选择性和长的半衰期.但要有变性剂,且使用大大过量的巯基乙醇)、Cleland 试剂包括二硫苏糖醇(DTT)及其差向异构体二硫赤藓糖醇(DTE)(勿需过量还原剂)。-S-S-经还原成为-SH，一般情况下很容易自动氧化，故需经过羧甲基处理防止重新氧化。,9）、二硫键的修饰,第四章蛋白质与酶的化学修饰课件,各种氨基酸侧链的修饰剂,氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟,解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。,解释修饰效果须十分小心，因为：,10）、亲和修饰,亲和修饰，酶的专一性修饰用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶不可逆失活，因此也称专一性不可逆抑制剂,10）、亲和修饰亲和修饰，酶的专一性修饰,亲和标记试剂的特点在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复合物亲和试剂的修饰程度是有限的竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻修饰产物应当稳定，应便于表征和定量,亲和标记试剂的特点,KS 型（竞争性标记试剂）根据底物的结构设计的，具有与底物结构相似的结合基团，同时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团特点底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具有保护作用修饰反应是定量定点进行的Kcat 型（自杀性标记试剂）根据酶催化过程设计，专一性很高具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶催化下活化，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合,KS 型（竞争性标记试剂）,3.大分子修饰（大分子结合修饰）,是目前应用最广的酶分子修饰方法。（1）定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。（2）修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修饰方法：非共价修饰、共价修饰。,3.大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广,非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。,非共价修饰,一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来 保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的,共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,共价修饰,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择修饰剂的活化修饰蛋白质将修饰剂与蛋白分离,大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择,1）聚乙二醇及其修饰反应,聚乙二醇的特点：线性分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；具有良好的生物相容性和水溶性；在体内无毒性、无残留、无免疫原性；末端活化后可与酶产生交联；覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变。,1）聚乙二醇及其修饰反应 聚乙二醇的特点：,聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：PEG分子量为7505000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好；修饰效果还与所用活化剂与酶的配比有关，PEG:E=1550:1 40%活力保持。应尽量选择对酶活性影响小的修饰方法。,聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：,修饰反应,叠氮法 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。琥珀酸酐法 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化，经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。,修饰反应叠氮法,三氯均嗪法 PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化PEG。羰二亚胺法 修饰酶分子上的羧基重氮法 将PEG末端羟基转换成重氮基团，再在弱碱性条件下修饰酶分子中的酚基、咪唑基。,三氯均嗪法,2）糖类的修饰反应,溴化氰法 右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶的游离氨基共价连接，生成修饰酶。高碘酸氧化法 高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合而生成修饰酶。,2）糖类的修饰反应 溴化氰法,4、肽链交联,采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对空间距离较近 的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联,4、肽链交联采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中,双功能试剂：指具有两个反应活性部位，分为同型双功能交联剂和异型双功能交联剂，可在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。双功能试剂还可将一蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质，可提供许多关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。,双功能试剂：指具有两个反应活性部位，分为同型双功能交联剂和异,侧链基团修饰分子内交联试剂同型、异型可裂解、不可裂解,侧链基团修饰,第四章蛋白质与酶的化学修饰课件,分子内交联 增加酶分子表面交联键的数目。分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂合酶。,分子内交联,二、内部修饰,酶蛋白主链修饰催化基团的修饰肽链伸展后的修饰,二、内部修饰酶蛋白主链修饰,1、酶蛋白主链修饰,酶法：酶原酶 酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。,1、酶蛋白主链修饰酶法：酶原酶,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1、引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2、仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3、有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：,2、催化基团的修饰,定点突变：转变氨基酸侧链 氨基酸的置换修饰可以采用化学修饰方法。例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的Ser转换为Cys，修饰后该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性，因此可用于肽的合成。缺点：化学修饰法 难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业 化生产。,2、催化基团的修饰 定点突变：转变氨基酸侧链,3、肽链伸展后的修饰,先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修饰，然后重新折叠成某种活性的构象。Saraswothi等，先让酶变性，然后加入竞争性抑制剂，待获得所希望酶的构象后，用戊二醛固定，然后透析除去抑制剂。他们以丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一种“酸性脂酶”，从而改变了酶的底物专一性、创造了新的酶活力。,3、肽链伸展后的修饰 先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修,三、与辅因子相关的修饰,1、对依赖辅因子的酶的修饰 1）、如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子共价结合到酶分子上。2）、引入新的具有强反应的辅因子。迄今最成功的例子是Kaiser将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，利用黄素的溴酰衍生物与木瓜蛋白酶的共价结合成为黄素木瓜蛋白酶，从而将蛋白酶转变成氧化还原酶。,三、与辅因子相关的修饰 1、对依赖辅因子的酶的修饰,3、金属离子置换修饰Metal ion substitute modification,2、金属酶的金属取代 可改变酶的专一性、稳定性、抑制作用等。把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制适用对象：金属酶（metalloenzyme）一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 辅因子金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用金属酶纯化时仍保留着定量 的功能金属离子,3、金属离子置换修饰Metal ion substitut,常见的金属酶及其离子种类-淀粉酶 Ca2+、Mg2+、Zn2+谷氨酸脱氢酶 Zn2+过氧化氢酶 Fe2+酰基氨基酸酶 Zn2+超氧化物歧化酶 Cu2+、Zn2+细胞色素 P450 单加氧酶 Fe2+固氮酶 Fe(II)、Mo(IV)谷胱甘肽过氧化物酶 Se(IV)主要的金属离子Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等,Cyt P450,常见的金属酶及其离子种类Cyt P450,金属离子置换修饰的方法酶的提纯除去原有金属离子加入金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物透析、超滤或层析除去螯合物加入置换的离子加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合用透析或层析等方法除去未结合的离子,金属离子置换修饰的方法,金属离子置换修饰的作用阐明金属离子对酶催化作用的影响一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶/辅基可逆结合，从而起到催化作用提高酶的催化效率将 Zn 型-淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高 20%30%增强酶的稳定性Fe-SOD 置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低改变酶的动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被 Co 置换后，酶的底物专一性（Km 值）和最适 pH 都显著改变,金属离子置换修饰的作用,四、物理修饰,酶分子的物理修饰通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法研究极端条件下酶结构和活性的变化物理修饰的特点不改变酶的组成单位及其基团酶分子中的共价键不发生改变 酶的一级结构不变副键发生某些改变和重排 酶的高级结构发生变化,四、物理修饰 酶分子的物理修饰,物理修饰的效果改变底物特异性例：羧肽酶 经高压处理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反应（逆反应）改变酶催化的最适温度例：纤维素酶经高压处理，最适温度下降，但在 3040 oC 条件下，活力提高了 10%提高酶的稳定性例：用盐酸胍破坏胰蛋白酶的空间构象，伸展肽链，再透析除去盐酸胍，在不同温度下重新构建/恢复酶的构象，50 oC 下重新构建的酶稳定性比天然酶提高 5 倍,物理修饰的效果,4.4、修饰酶性质的变化及原因,修饰酶的酶学性质变化,最适pH值,热稳定性,体内抗原性,半衰期,酶动力学性质,对组织的分布能力变化,4.4、修饰酶性质的变化及原因修饰酶的酶学性质变化最适pH值,1、增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂与酶形成多点交联，一般能增强酶的热稳定性，可能的原因是多点交联产生固定酶分子构象的效应PEG 修饰酶在热稳定性上没有明显提高，可能由于 PEG 和酶是单点交联酶分子内基团间相互作用在受热情况下发生了变化，向热力学上熵增加的方向变化，即从紧密有序趋于随机松散。通过修饰后，使酶天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，减小热振动，从而增强酶的热稳定性,1、增强酶天然构象的稳定性与耐热性,2、保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,2、保护酶活性部位与抗抑制剂,3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶,4、最适 pH 值范围扩大一般情况下，修饰酶的最适 pH 范围扩大猪肝尿酸酶的最适 pH 为10.5，在pH 7.4 的生理环境中酶活仅剩 510%，用白蛋白修饰后，最适 pH 范围扩大，在pH 7.4 时仍保留 60%酶活吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适 pH 从 3.5 增加到 5.5，在 pH 7左右时，修饰酶活力比天然酶增加 3 倍，在生理环境下抗肿瘤效果比天然酶大得多可能的原因修饰酶的微环境更稳定修饰酶被“固定”在一个更活泼的状态,4、最适 pH 值范围扩大,5、半衰期延长酶经修饰增强了抗蛋白水解、抗抑制剂和抗失活因子的能力及对热稳定性提高，半衰期一般都比天然酶延长6、减弱或消除体内抗原性有些修饰剂在消除酶抗原性上并无作用，如 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）修饰酶；糖类物质也不容易消除酶的抗原性现在比较公认的是 PEG 和人血清蛋白在消除酶抗原性上效果明显，原因可能是修饰剂破坏（共价结合）或“遮盖”了抗原决定簇，使之抗原性减弱或消除,5、半衰期延长,7、酶动力学性质绝大多数酶经修饰后最大反应速度 Vmax 没有变化有些酶在修饰后，米氏常数 Km 通常会增大，这可能是交联于酶上的大分子所产生的空间障碍影响了底物对酶的接近和结合修饰酶抵抗各种失活因子的能力增强和体内半衰期的延长，能够弥补 Km 增大的缺陷,7、酶动力学性质,8、对组织的分布能力变化某些酶经化学修饰后，所带电荷情况发生变化，改变其静电吸附能力，或修饰酶的分子本身具有靶向性，因此使修饰酶对组织的分布能力有所改变，能在血液中被一些器官选择性地吸收。,8、对组织的分布能力变化,4.5、化学修饰的应用,理论研究方面医药领域工业生产中的应用其他方面应用,4.5、化学修饰的应用理论研究方面,一、理论研究方面,可用于以下研究：氨基酸数量与顺序测定；氨基酸残基的存在状态；确定酶活性部位与作用机制；酶中特定基团之间距离等。,一、理论研究方面 可用于以下研究：,例1：由化学修饰而产生的静电效应改变常引起蛋白质和水的相互作用的变化，甚至可造成蛋白质分子之间的接触点断裂。因此不需加人尿素或胍，一些多聚体蛋白质即选择性地被解离成可溶性亚基。它们在水中很少发生聚集，并保持其生物活性，从而大大有利于这些蛋白质分子质量的精确测定。,例1：由化学修饰而产生的静电效应改变常引起蛋白质和水的相互作,例2：辣根过氧化物酶(horseradish eroxidase,HRP)用聚赖氨酸修饰后，细胞的摄入量增加，这种穿透细胞的能力增强被认为可能是聚赖氨酸增加了酶分子上正电荷，因为当聚赖氨酸上氨基被酰化后，修饰酶就不表现出细胞穿透力增强的现象。,例2：辣根过氧化物酶(horseradish eroxid,例3：在氨基酸顺序分析中，也常用到化学修饰。由于胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋白质，以制备肽段，这就提出了如何防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题。为此可利用选择性化学修饰剂修饰精氨酸或赖氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。,例3：在氨基酸顺序分析中，也常用到化学修饰。由于胰酶对精氨,二、医药领域的应用,降低或消除医用酶的抗原性增强医用酶的稳定性，延长半衰期靶向运输,二、医药领域的应用降低或消除医用酶的抗原性,例1、化学修饰的SOD,例1、化学修饰的SOD大分子修饰酶半衰期相对稳定性天然 SO,例2.PEG一腺苷脱氨酶(ADA),ADA可用于治疗免疫缺陷。从牛肠提取的未经修饰的ADA，进入血液后几分钟内就会被肝脏等清除，无法修复免疫缺陷。Hershfield等用PEG-ADA注射体内后可在血液中存留1-2周，抗原反应降低，活性可保留未修饰的ADA达40%左右，临床效果明显提高。1990年，PEG-ADA成为通过FDA认证的第一种修饰蛋白。,例2.PEG一腺苷脱氨酶(ADA)ADA可用于治疗免疫缺,例3.PEG-溶血类蛋白质,血栓类疾病发生率较高，危害性也较大，利用各种溶栓蛋白的药物治疗是当今研究的方向之一。目前有多种酶用于该领域的研究，如链激酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、弹性蛋白酶等都对溶剂有高效专一的作用。PEG修饰后，使这些异源蛋白质在体内的作用明显加强，在体内半衰期显著延长，降低了抗原性。,例3.PEG-溶血类蛋白质血栓类疾病发生率较高，危害性也,例4.改变组织分布,Pmepes病主要是由于糖原贮积于肝细胞的二级溶酶体所造成的。因此在用-葡萄糖苷酶(glucosidase)进行治疗时，希望酶在体内尽量避免受到吞噬细胞的破坏，尽快到达肝细胞。由于肝细胞上有特异性的白蛋白受体，因此用白蛋白修饰酶后，能有利于肝细胞对酶的摄入，使更多的酶到达靶位发挥作用。,例4.改变组织分布Pmepes病主要是由于糖原贮积于肝细胞,三、工业生产中的应用,提高工业酶的催化效率例1：右旋糖酐修饰过的胰蛋白酶(11:1)，催化效率提高至 5.1 倍例2：Zn 型-淀粉酶/蛋白酶改性成 Ca 型，催化效率均有提高增强工业酶的稳定性常用的几种淀粉酶和蛋白酶经大分子修饰后稳定性均得到提高胰蛋白酶经物理修饰后，50 oC 下稳定性比天然酶提高 5 倍改变酶的动力学特征例：葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，最适 pH 下降 0.5，稳定性增强,三、工业生产中的应用提高工业酶的催化效率,4.6、化学修饰的局限性,1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。,4.6、化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学,3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。,3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还,4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。,4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息,思考题,什么是酶的化学修饰？理想的化学修饰剂应具备哪些条件？选择修饰反应条件时，必须考虑哪些因素？最重要的是什么因素？为什么？常见的化学修饰有哪些种类？化学修饰对酶的酶学性质有何影响？为什么？化学修饰可以应用在哪些方面？化学修饰有哪些优缺点？,思考题什么是酶的化学修饰？,