第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件.ppt

Chapter9:High-level expression of foreign genes,1.gene silence2.expression systems of foreign gene3.Isolating and purifying the product of foreign genes,Chapter9:High-level expressio,1.gene silence(基因沉默),Gene Silencing外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。.Gene silencing can occur at either transcriptional level(TGS,Transcriptional Gene Silencing),or post-transcriptional level(PTGS,Post-Transcriptional Gene Silencing).,1.gene silence(基因沉默)Gene Sile,TGS:Methylation Induced Repeat-Induced Gene Silencing(RIGC),position effect,and so onPTGS:cosuppression,and so on,TGS:Methylation Induced,Methylation Induced,Methylation Induced,Histone:组蛋白deacetylase去乙酰化酶,基因表达系统,原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。,真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。,2.expression systems of foreign gene,基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,一、外源基因在原核细胞中的表达,欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白；外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；,一、外源基因在原核细胞中的表达欲将外源基因在原核细胞中表达，,必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame，ORF)；利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源,（一）基因表达的调控序列,对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。1.启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。-35 Box 和-10 Box,（一）基因表达的调控序列对原核生物来讲，基因表达的调控序列,TTGACATATAATTranscriptional st,原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。,原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基,最佳启动子必须具备的条件,必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。,最佳启动子必须具备的条件 必须是一种强启动子,（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-35box,-10box（Pribnow Box）,（2）-35区与-10区之间的距离5-TTGACA-3,P tac=3 P trp=11 P lac,启动子,tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子),P tac=3 P trp=11 P lac启动子-,在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。,在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(,2S-D序列 mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。,2S-D序列,S-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。,S-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基：,AUG左侧的三个碱基也有影响。-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,AUG左侧的三个碱基也有影响。,3终止子 在一个基因的3端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含GC的区域，GC富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。,3终止子,在构建表达载体时，为防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。,在构建表达载体时，为防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系,4、密码子的选择性,起始密码子：GUG 为 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。主密码子：使用的频率高罕用密码子：基因组中使用的频率较低。如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之则低。构建表达载体时，要对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主细胞。,4、密码子的选择性起始密码子：GUG 为 AUG 的 50%,（二）外源基因在大肠杆菌表达的形式,在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中在细胞内表现为可溶性的蛋白质,（二）外源基因在大肠杆菌表达的形式在细胞内表现为不溶性的包,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积,包涵体的组成,蛋白质,非蛋白质,外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。,受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。,：包括DNA、RNA和脂多糖等。,包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：,折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。,包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有,优点:使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 缺点:回收的蛋白生物活性差。分子伴侣共表达（一类能促使其他蛋白质按正确的方式组装或折叠，本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成部分的多功能蛋白质）硫氧还蛋白还原酶基因缺陷的寄主菌株降低蛋白质的合成速率,优点:使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,融合蛋白与非融合蛋白,不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。非融合蛋白(no-fusion protein)的优点在于表达产物的生物学功能更接近于生物体内天然蛋白质。非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶所破坏。,融合蛋白与非融合蛋白不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达,融合蛋白(fusion protein)是将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达产物。含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。而含另外一些多肽的融合蛋白则为表达产物的分离纯化等提供了极大的方便。,融合蛋白(fusion protein)是将两个或多个基因的,（三）外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质中表达周质中表达优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,（三）外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,（2）信号肽（signal peptide）：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（3）常用的原核信号肽大肠杆菌的信号肽：phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,（2）信号肽（signal peptide）：能带领蛋白穿过,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（endoglucanase）。胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。（2）真核信号肽鼠源RNase、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,3.胞外表达表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,3.胞外表达,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,1.非融合型表达蛋白载体pKK223-3,（四）几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达蛋白载体pKK223-3（四）几种类型的原,2分泌型克隆表达载体pin系统 作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因)。,2分泌型克隆表达载体pin系统 作为分泌,3融合型蛋白表达载体pGEX系统,这类载体与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体。,3融合型蛋白表达载体pGEX系统 这类载,GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione Sepharose)亲和层析柱分离纯化。,GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione S,产物分离,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,产物分离柱（column）GST外源蛋白凝血酶 外源蛋白柱（,原核细胞高效表达目标基因的战略,表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性优化发酵过程,原核细胞高效表达目标基因的战略表达质粒的优化和设计,（五）原核细胞表达真核基因的缺陷,没有真核转录后加工的功能，只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子 产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解,（五）原核细胞表达真核基因的缺陷 没有真核转录后加工的功能,避免外源基因表达蛋白降解的对策：,构建融合蛋白表达系统,构建分泌蛋白表达系统,构建包涵体表达系统,选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌,芽孢杆菌表达系统,芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌和短小芽孢杆菌等。,利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：,许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。,芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素,1 芽孢杆菌表达载体,复制子,金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等,短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等,含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。,短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。,1 芽孢杆菌表达载体复制子金色葡萄球菌的复制子：如pUB1,表达载体,自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢杆菌中进行自主复制。,整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。,噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。,表达载体自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同,1.2 宿主菌,常用的宿主菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,1.2 宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌地衣芽孢,外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达,芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。,在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略,提高表达质粒在细胞中的稳定性,灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶,外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌,链霉菌表达系统,链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质。,链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的特点：,为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。,链霉菌表达系统链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤,3.1 链霉菌基因表达载体,启动子,结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：,与大肠杆菌基因-10区和-35区类似的启动子,仅与大肠杆菌基因-10区类似的启动子,与大肠杆菌基因-10区和-35区序列均不相同的启动子,终止子,具有较长的不完全互补反向重复序列。,3.1 链霉菌基因表达载体启动子结构多样，至少存在三类链霉,核糖体结合位点,密码子,链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱性。编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达66、53和93，而该现象不存在于非编码区。在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2。密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高于G的频率。,类似于其它原核生物的SD序列：5(A/G)GGAGG3。,核糖体结合位点密码子链霉菌对编码蛋白质的密码子具有明显的偏爱,3.2 宿主菌,变铅青链霉菌,天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。,变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源DNA无明显的修饰作用；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。,主要有,3.2 宿主菌变铅青链霉菌天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中,二、外源基因在真核细胞中的表达,（一）真核生物基因表达的特点及优势1、转录和翻译分开进行 2、有相当大的非编码区（调控序列）3、有三种不同RNA聚合酶参与转录4、初级转录产物能进行剪接加工修饰5、不存在操纵子结构6、基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录,二、外源基因在真核细胞中的表达（一）真核生物基因表达的特点及,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,（二）提高外源基因在植物中表达的策略1、启动子优化2、转译序列的修饰3、构建含 的表达载体4、降低外源基因的拷贝数5、利用引导肽进行表达产物的定位,（二）提高外源基因在植物中表达的策略,1、启动子优化,（1）、组成型启动子结构基因的表达水平恒定在一定水平，在不同组织部位表达水平也没有明显差异。烟草花叶病毒(CaMV)的35S启动子，根癌农杆菌Ti质粒T-DNA的胭脂碱合成酶nos基因的启动子，和章鱼碱合成酶OCS基因的启动子。而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act 启动子,玉米泛素Ubi启动子,1、启动子优化,（2）、诱导型启动子在某些特定的物理或化学条件下，诱导基因转录水平大幅度地提高。菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子,激素诱导序列以及RuBp 羧化酶小亚基的光诱导启动子.（3）、组织特异性启动子：基因的表达只发生在某些特定的器官和组织部位。如韧皮部特异表达的玉米蔗糖合成酶基因1启动子,谷氨酰胺合成酶基因34启动子,（2）、诱导型启动子,提高外源基因的表达水平，选择强组成型启动子。对于双子叶植物来说，常用的强组成型启动子是35S启动子，如35S启动子能使nptII基因的表达水平比nos启动子提高11O倍。也可以利用串联的35S启动子增强外源基因的表达。采用复合式启动子是一条十分重要的途径.Ni 等人(2019)将章鱼碱合成酶基因(Ocs)启动子的转录激活区(-116-333)与甘露碱合成酶基因启动子(Pmas,+68-318)构成了复合式启动子,提高外源基因的表达水平，选择强组成型启动子。对于双子叶植物来,2、转译序列的修饰,(1)5-UTR(5-UntranslatedRegion)能影响40S核糖体亚基的在mRNA上的移动及其识别翻译起始位点的效率。来自烟草花叶病毒(TMV)RNA 5端非翻译序列(序列)在真核和原核系统中有明显增强作用,2、转译序列的修饰(1)5-UTR(5-Untran,(2)应用内含子提高基因的表达(3)改造编码区密码子提高外源基因的表达充分考察受体植物密码子的使用频率,(2)应用内含子提高基因的表达(3)改造编码区密码子提高,核基质结合区(Matrix attachment regions)也称核骨架结合区(Scaffold attachment regions)，是存在于真核细胞染色体中的一段与核基质特异结合的DNA序列。,3、构建含 的表达载体,核基质结合区(Matrix attachment re,大多数M A R s 位于基因两侧非编码区，富含A T 和保守的结构域，其最小活性序列为300 bp，常与增强子、启动子(复制起始点等重要元件相邻。构建成-,借助边界序列的作用可使相邻的转录单元保持相对的独立性，并免受周围染色体结构的影响。,大多数M A R s 位于基因两侧非编码区，富含A T 和保,4、降低外源基因的拷贝数,可以在转基因再生植株的当代选择，也可以从多拷贝整合植株的有性繁殖分离后代中选择。切实可行的途径是选择适宜的转基因方法，提高单拷贝转基因植株的比例。,4、降低外源基因的拷贝数 可以在转基因再生植株的当代选,5、利用引导肽进行表达产物的定位,外源基因在植物组织细胞中表达时,其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解,造成外源蛋白积累量的减少。因此,采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要一环。Rubisco 小亚基的转运肽序列,5、利用引导肽进行表达产物的定位外源基因在植物组织细胞中表,（三）提高外源基因在动物中表达的策略,1、导入大片段保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整性。因此目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的位置效应而引起缓冲区域的作用，从而提高外源基因的表达水平。,（三）提高外源基因在动物中表达的策略1、导入大片段,2、添加基质附着区3、利用具有组织与发育特异性调控作用的启动子和增强子.启动子是RNA聚合酶进行精确有效转录必需的。4、添加内含子 5、利用基困打靶系统实现染色体定位整合.,2、添加基质附着区,酵母表达系统,酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。,酵母菌的特点：,基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于2019年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。,酵母表达系统酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性,1 酵母基因表达载体,酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。,DNA复制起始区,酵母表达载体包含两类复制起始序列：,在大肠杆菌中复制的复制起始序列,在酵母菌中引导进行自主复制的序列,1 酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、,选择标记,营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。,显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。,有丝分裂稳定区,酵母菌表达载体相当于微型染色体。表达载体上的有丝分裂稳定区，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。,选择标记营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。显性选择标,表达盒,表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达载体的重要元件。,启动子的长度一般在12kb，其上游含各种调控序列（如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等），下游存在转录的起始位点和TATA序列（TATA序列可被质转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物）。一般在构建表达载体时须组入强启动子，如酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子等。分泌信号序列是前体蛋白N端一段长为1730个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。常用的分泌信号序列有：因子前导肽序列、蔗糖酶信号肽序列、酸性磷酸酯酶信号肽序列等。终止子序列相对较短，是决定酵母中mRNA3端稳定性的重要结构。与高等真核生物类似，mRNA的3 端需经过前体mRNA的加工和多聚腺苷化反应。,表达盒表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表达,2 酵母基因表达载体的种类,自主复制型质粒载体（yeast replicating plasmid，YRP）,该载体含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达200个，但经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。,整合型质粒载体（yeast integration plasmid，YIP）,整合型质粒载体不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体DNA的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种方式。,2 酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体（yeast,着丝粒型质粒载体（yeast centromeric plasmid，YCP）,该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有12个拷贝。,该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有单拷贝，包含酵母染色体自主复制序列、着丝粒序列、端粒序列、酵母菌选择标记基因、大肠杆菌复制子和选择标记基因等。,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,着丝粒型质粒载体（yeast centromeric pla,3 酵母基因表达系统宿主菌,主要包括,酿酒酵母*,巴斯德毕赤酵母,乳酸克努维酵母,多型汉森酵母,酿酒酵母,它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。,3 酵母基因表达系统宿主菌主要包括酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母,巴斯德毕赤酵母,它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可在细胞中高水平积累。AOX1的启动子是一种可诱导的强启动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为受体细胞，可高效表达外源基因。目前也可选择组胺醇脱氢酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时，可对载体上携带his标记基因的转化子进行筛选。在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。,巴斯德毕赤酵母它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶,乳酸克努维酵母,该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产-半乳糖苷酶。某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水平和效果高于酿酒酵母。在分泌表达过程中，能形成正确的蛋白构象，因而利用其表达高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性。目前已有多种外源蛋白在该酵母系统中得到表达，如人白细胞介素-1和-牛凝乳酶等。,乳酸克努维酵母该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产,4 在酵母中高效表达外源基因的策略,选择合适的受体细胞系统提高表达载体在细胞中的拷贝数提高外源基因的转录水平,4 在酵母中高效表达外源基因的策略选择合适的受体细胞系统,6 哺乳动物细胞基因表达系统*,6.1 哺乳动物基因表达载体的组成特征,哺乳动物基因表达载体,质粒载体,病毒载体,哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。,6 哺乳动物细胞基因表达系统*6.1 哺乳动物基因表达载,哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：,基因的转录元件，即转录的启动子、增强子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；,用于筛选转化子的选择标记；,在细菌中进行复制和筛选的元件；,基因表达的调控元件。,哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：基因的转录元件，即转录,复制子,表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体能以附加体的形式进行复制。通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。,启动子和增强子,表达载体的启动子长为100200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动子和上游启动子两部分组成。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。,复制子表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带有这些复,终止信号和加poly(A)信号,RNA聚合酶的转录终止和加poly(A)信号依赖于DNA模板上两种特异的序列，一是位于poly(A)位点上游1130个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA，二是poly(A)位点下游的GU丰富区或U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。,终止信号和加poly(A)信号RNA聚合酶的转录终止和加po,剪接信号,外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信号后，内含子被剪除并形成成熟的mRNA。mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 和3 边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。若外源基因为cDNA，表达载体中不含内含子剪接信号，也不会影响其表达。,选择标记基因,为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：,剪接信号外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信号后，,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,6.3.6.2 哺乳动物基因表达载体,不带真核复制起始序列的质粒型载体带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体牛乳头瘤表达（BPV）衍生载体人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体反转录表达（retrovirus）衍生的表达载体,6.3.6.2 哺乳动物基因表达载体不带真核复制起始序列的,6.3.6.3 哺乳动物基因表达宿主细胞,哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。,在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。,6.3.6.3 哺乳动物基因表达宿主细胞 哺乳动物基因表达,CHO-K1细胞,CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml以上。,外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。,该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素、干扰素、凝血因子等在CHO细胞中得到表达。,CHO-K1细胞特点,CHO-K1细胞CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一,COS细胞,它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。,COS细胞的特点：,细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。,由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。,COS细胞它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达,鼠骨髓瘤细胞,鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。,鼠骨髓瘤细胞的特点：,细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。,鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已,6.4 提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略*,（1）设法提高外源基因的表达水平和产量,表达载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达的关键因素之一，选择外源性强启动子可获得高效表达。外源基因的表达水平还与细胞中基因的拷贝数有关，拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑将载体构建为一种自主复制型载体。将外源基因与选择标记基因的表达结合在一起，使细胞在选择压力下培养时，两种基因产物都能获得高表达。,（2）改造宿主细胞的特性,宿主细胞的特性对外源基因的表达至关重要。以一种或几种宿主细胞表达不同特性和要求的外源蛋白是不够的。因此，根据表达载体和外源蛋白的特性，对宿主细胞进行改造，或采用一些新的宿主细胞系统，对提高外源基因的表达水平有重要作用。,方法,6.4 提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略*（1）设法,（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期,方法,为细胞生长提供足够的营养和充分的氧源；加入抗氧化剂延缓细胞凋亡；将抗细胞调亡基因导入宿主细胞中。,（4）提高表达蛋白糖基化水平,哺乳动物蛋白的一个重要特点就是糖基化，而糖基化的方式决定蛋白质的特性。蛋白质糖基化的方式有两种（N-糖基化和O-糖基化）。决定蛋白质糖基化的主要因素包括宿主细胞内糖基化酶和细胞的培养环境等。,方法,寻找不同类型的哺乳动物宿主细胞（包括人类细胞），使其表达的蛋白质尽可能和人类天然蛋白的糖基化相同或相似；通过基因工程方法改造现有的宿主系统，将某些糖基化酶引入宿主细胞中，使其对表达蛋白进行有效糖基化；对哺乳动物细胞表达条件进行改进，使有利于表达蛋白的糖基化。,（3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期方法为细胞生长提供足够的营,3.Isolating and purifying the product of foreign genes,基因表达产物分离纯化的步骤：,细胞破碎,离心分离,柱层析,电泳,3.Isolating and purifying the,第九章外源基因在宿主细胞中的精选课件,