第三讲基因工建制药(中)课件.ppt

三、酵母中的基因表达,三、酵母中的基因表达,1.载体：（1）根据载体的复制序列可分为4类：YEp（酵母附加体质粒）、YRp（酵母复制型质粒）、YCp（酵母着丝粒质粒）、Yip（酵母整合质粒）。,YEp：此类载体以酵母的天然2质粒为基础，带有2质粒复制区序列，拷贝数高，转化频率高、稳定性好，应用较广。,YRp：复制序列为非2来源的自主复制序列，稳定性差，拷贝数少,YCp：有ARS、端粒、着丝粒等，类似于染色体的行为，稳定性好，但拷贝数只有1个。,YIp：可完全整合到酵母染色体中，稳定性好，但拷贝数只有1个。,1.载体：YEp：此类载体以酵母的天然2质粒为基础，带有2,（2）酵母克隆载体：含有大肠杆菌的复制原点和抗性基因，可在大肠杆菌中克隆增殖也可在酵母中进行复制和表型选择。酵母表型选择为营养缺陷型（合成氨基酸或核苷酸的酶系突变缺失）或抗性筛选。,（3）表达载体：将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。普通表达载体：只能方便引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增加并无严格要求。精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于插入外源基因，并使其在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同。如在构建-因子精确表达载体时，在其Arg85后引入酶切位点，同时Arg也为酵母蛋白酶断裂位点。,（2）酵母克隆载体：（3）表达载体：将酵母菌的启动子和终止子,第三讲_基因工建制药(中)课件,2.影响目的基因在酵母菌中表达的因素,（1）外源基因的拷贝数：有些酵母质粒导入细胞后在传代培养中丢失；整合质粒很稳定，但拷贝数低，不能高效表达；高度稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数常会引起细胞生长量的降低。,（2）外源基因的表达效率：主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。,启动子：由上游激活序列和保留的近端启动子组成。近端启动子含有转录必须的TATA序列和mRNA起始转录位点ATG。终止子区含有终止转录所需信号。组成型启动子：如果外源基因表达产物对酵母细胞不利，会使细胞生长不良，达不到所需的细胞密度。诱导型启动子：,2.影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数：,第三讲_基因工建制药(中)课件,分泌信号的效率：分泌信号包括信号肽部分及前导肽部分的编码序列，可帮助表达产物分泌出酵母细胞并在适当部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。,分泌信号的效率：分泌信号包括信号肽部分及前导肽部分的编码序,终止序列的影响：终止序列保证了转录产物在适当部位终止和加上polyA尾巴，这样形成的mRNA才能比较稳定并被高效翻译。,（3）外源蛋白的糖基化：N-糖苷键、O-糖苷键,（4）宿主菌株的影响：菌体生长能力强菌体内源蛋白酶较弱菌株性能稳定分泌能力强,终止序列的影响：终止序列保证了转录产物在适当部位终止和加上,第三讲_基因工建制药(中)课件,第三讲_基因工建制药(中)课件,酵母系统表达的优点：,（3）某些酵母表达系统具有外分泌信号序列,能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外,因此很容易纯化。,（1）酵母生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本。,（2）酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。,酵母系统表达的优点：（3）某些酵母表达系统具有外分泌信号序列,解决内部降解的方法：（1）在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物,通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用（2）将培养基的pH 值调成酸性(酵母可在pH 3.0 8.0 的范围内生长),以抑制中性蛋白酶的活性;（3）利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。,酵母表达系统的不足之处：（1）产物蛋白质的不均一（2）信号肽加工不完全（3）内部降解（4）多聚体形成等,造成表达蛋白质在结构上的不一致。（5）还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。,解决内部降解的方法：酵母表达系统的不足之处：,利用酵母菌表达外源基因的策略,（1）增加整合在酵母染色体上的目的基因剂量（2）控制外源基因中的AT 含量（3）选择最为合适的信号肽（4）外源基因在酵母菌表达的影响因素还有很多,如整合位点、mRNA 5和3非翻译区(U TR)、宿主菌的Mut 表型、蛋白酶、表达蛋白质自身的特点、培养基及培养的环境条件等,有效控制各种影响表达的因素,对于外源基因的高效表达都必不可少。,利用酵母菌表达外源基因的策略（1）增加整合在酵母染色体上的,用酵母表达系统(宿主-载体系统),（1）酿酒酵母(S accharomyces cerevisiae)：难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30 kD 的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C 端往往被截短。,（2）甲醇营养型酵母表达系统：包括汉森酵母属(Hansenula),毕赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长,甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶,如醇氧化酶(AOX1)等。,（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系统：具有许多与高等真核细胞相似的特性,它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性，但目前研究较少。,用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(S ac,（1）将目的基因克隆入酵母表达载体（2）用适当的限制性内切酶消化重组质粒,使之线性化（3）将线性化的重组质粒转化入酵母菌株(如GS115,KM71)（4）将转化物接种HIS4 缺陷平板进行第一轮筛选（5）用不同浓度的G418 平板进行第二轮筛选（6）挑选1020 个克隆进行小规模诱导培养,鉴定外源基因的表达量（7）挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养,以制备外源基因的表达蛋白质。,用酵母菌表达外源基因的步骤,（1）将目的基因克隆入酵母表达载体用酵母菌表达外源基因的步骤,一、酿酒酵母：单细胞真核微生物，被称为真核生物中的“大肠杆菌”，最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。1981年用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白。,一、酿酒酵母：单细胞真核微生物，被称为真核生物中的“大肠杆菌,（一）酿酒酵母表达系统组成,（1）YIp型载体：整合型载体，不含酵母DNA 复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，含有整合介导区，此载体整合到染色体上，稳定性高，缺点为拷贝数低。解决措施：用酵母转座子以产生多个插入拷贝；将re-DNA插入到核糖体rDNA中，在宿主染色体上以150 串联重复序列存在。,1、载体,（2）YEp型载体：附加型载体，含有酿酒酵母2 质粒DNA 复制有关的部分或全部序列,常以30 或更多拷贝存在，但不稳定,能独立于酵母染色体之外复制，为穿梭质粒。不稳定解决措施：以脆弱的srbl-1 突变的宿主株为基础建立自然选择系统,这个菌株要求渗透压稳定，否则会裂解，转化后带野生型SRB 的自主复制YEp 型质粒与此菌株进行互补，可在培养基上保持选择性。,（一）酿酒酵母表达系统组成（1）YIp型载体：整合型载体，不,第三讲_基因工建制药(中)课件,2、宿主菌酿酒酵母,酿酒酵母基因组序列早在1996 年就完成，它有16 条染色体，约6000 个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。,（二）酿酒酵母基因表达系统研究现状,目前利用酿酒酵母为宿主系统表达了多种外源基因产物，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等。,外源基因可在酿酒酵母中分泌表达，通常为将重组蛋白的成熟蛋白形式与结合信息素的pre-pro 序列融合，pro 序列可用Kex2 酶的蛋白水解作用切去，这个步骤是广泛存在于真核生物中的，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响。第一个商品化的重组疫苗来自酿酒酵母。,2、宿主菌酿酒酵母酿酒酵母基因组序列早在1996 年就完成,（三）酿酒酵母表达系统高效表达的策略,（1）转录水平（2）表达载体的拷贝数和稳定性（3）胞内表达产物的加工和修饰（4）分泌表达产物的加工和修饰等等。,（三）酿酒酵母表达系统高效表达的策略（1）转录水平,（四）酿酒酵母表达系统的应用及前景,利用酿酒酵母表达系统生产制备外源基因的表达产物已有20 余年的历史，但实践中仍然发现有很多的外源基因不能在酵母表达系统中表达，具体原因目前还没有明确。另外，还没有彻底克服酵母表达系统制备外源蛋白质时发生的不均一现象。,（四）酿酒酵母表达系统的应用及前景利用酿酒酵母表达系统生产制,第三讲_基因工建制药(中)课件,二、甲醇营养型酵母,（1）能利用甲醇作唯一碳源的一类酵母,其代谢甲醇的第一步是在醇氧化酶的作用下甲醇被氧化成甲醛，调节这种酶的启动子是强启动子并严格受甲醇诱导,因此可用于调控外源蛋白表达。（2）甲醇酵母能在无机盐培养基中快速生长,易进行工业化大生产,高密度培养干细胞量可达100g/L以上，外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加10-100 倍。,二、甲醇营养型酵母（1）能利用甲醇作唯一碳源的一类酵母,其代,（3）能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰,糖基化也更接近高等真核生物甚至人类。（4）Pichia pastoris、Pichia methanolical、Hansenula polymorpha、Candida biodinii 等甲醇酵母已发展成为高效的表达系统,已成功表达了多种重组蛋白并显示出巨大的优越性，成为目前基因表达优先考虑的表达系统。,（3）能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰,糖,具有强有力的、易控制的AOX启动子,可严格调控外源蛋白的表达;可对表达蛋白进行翻译后加工和修饰,即二硫键的形成、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N-糖基化、O-糖基化,从而使表达出的蛋白具有生物活性;对营养要求低,生长快,培养基廉价,便于工业化生产;可高密度发酵培养,蛋白产量高;表达量高,如破伤风毒素C 片段表达量高达12 g/L;甲醇酵母自身分泌的背景蛋白少,表达产物较易纯化,表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌至胞外,如表达的重组水蛭素(HIR)仅经过两步层析纯化,纯度就高达97%以上;糖基化程度低,和酿酒酵母相比,甲醇酵母中加到翻译蛋白的糖链每条长度为814 个甘露糖残基,较之酿酒酵母(50150 甘露糖残基)短得多。此外,酿酒酵母核心多糖末端存在-1,3 糖苷键,使这些蛋白具有高度的抗原性,因而不适宜作治疗制剂,而甲醇酵母没有。,甲醇酵母表达系统的优点,具有强有力的、易控制的AOX启动子,可严格调控外源蛋白的表,（1）缺乏葡萄糖、甘油时,利用甲醇为惟一碳源。（2）甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,在过氧化物酶体中氧化成H2O2。（3）乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱,因此代偿性地大量产生该酶,调控这种酶的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达。两种乙醇氧化酶(即AOX1 和AOX2),细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。,（一）巴斯德毕赤酵母,1、生物学特性,（1）缺乏葡萄糖、甘油时,利用甲醇为惟一碳源。（一）巴斯德,（4）当aox1 基因缺失只存在aox2 时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为Muts(Methanol utilization slow);aox1 基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut+。（5）aox1 基因的表达为转录水平调控。aox1 基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达。（6)甲醇酵母生长适宜温度一般为2830。诱导期间如果温度超过32,不利于蛋白表达,甚至会导致细胞死亡。,（4）当aox1 基因缺失只存在aox2 时,大部分的乙醇氧,第三讲_基因工建制药(中)课件,2、载体：主要是可以整合到酵母基因组中的整合型质粒,其主要元件包括启动子,信号肽,多克隆位点,终止子,选择标志,以及可以诱导基因发生重组的同源序列和在大肠杆菌中的复制起点及抗药性基因。,2、载体：主要是可以整合到酵母基因组中的整合型质粒,其主要元,含有AOX1 基因序列的表达载体既可以在酵母基因组AOXl 或HIS4 位点发生单交换,插入到酵母基因组中;也可以发生双交换而取代AOX1 基因,相应的表现型分别为Mut+和Muts。,AOX1区的整合包括同源双交换引起的基因置换和位点特异性单交换引起的基因插入。前者使染色体AOX1基因被外源基因表达盒替换,Mut+表型菌株会转变为MutS 或Mut-,而MutS 和Mut-菌株表型不变;后者不改变宿主原有的AOX1 基因,故各种菌株的Mut 表型不变。HIS4 区的整合方式为位点特异性单交换。表达载体向HIS4 区或AOX1 区的整合赋予宿主菌野生型组氨醇脱氢酶基因,使其表型由HIS-变为HIS+,可以此筛选转化子。,含有AOX1 基因序列的表达载体既可以在酵母基因组AOXl,（1）启动子,AOXl 启动子(PAOX1)和甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP)启动子。,PAOX1：受甲醇的严格调控,在碳源为非甲醇的条件下,AOX1 基因转录的mRNA 检测不到,但在甲醇为唯一碳源的培养基中,AOX1 基因编码的mRNA 可达到总RNA 的5%。在PAOX1调控下表达外源基因时可通过调节甲醇而适时地控制表达过程,这样可以有效地减轻选择压力,保证外源基因的稳定存在。,PGAP：发酵过程操作简便,可以连续表达,无需诱导。利用PGAP表达外源基因主要的限制是目的蛋白不能对宿主菌有毒性,否则在长期的发酵过程中将限制其生长。,（1）启动子AOXl 启动子(PAOX1)和甘油醛三磷酸脱氢,（2）信号肽,酿酒酵母的交配因子(-mating factor,-MF)的信号肽pre-pro或前导部分pre：可以介导蛋白质沿分泌通路分泌到细胞外,在分泌过程中可以被自身的膜蛋白酶Kex-2 自动切割去除,Kex-2 的切割位点是其C 末端连续两个碱性氨基酸的氨基端。,可使用外源蛋白自身信号肽,如不能利用自身信号肽,可选择酵母因子的前导序列，该序列可非常有效地引导体积稍小的产物出胞。,两种产物形式：在因子信号的引导下,通过高尔基体,分泌到胞外的可溶性蛋白或以包涵体形式存在。,（2）信号肽酿酒酵母的交配因子(-mating fact,真核生物内许多细胞因子、淋巴因子、酶、激素等在翻译后加工过程中,蛋白前体经酶切变为成熟蛋白时的切割位点也是在连续两个碱性氨基酸的C末端,因此用毕赤酵母表达系统可以对真核蛋白进行正确的翻译后酶切加工。,Kex-2：位于细胞膜上，专一性水解因子前体中羧基端的肽键，位点为连续两个碱性氨基酸残基,如因子的Glu-Lys Arg*Glu-Ala-Glu-Ala(*表示水解位点)。,STE13：识别和水解的是因子的Glu Ala*Glu-Ala重复序列,从而保证了蛋白加工过程中的信号肽的切除。,真核生物内许多细胞因子、淋巴因子、酶、激素等在翻译后加工过程,解决方法：采用氨基末端间隔序列解决,在-因子的前导肽序列和产物之间加1 个间隔序列,这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。,缺点：信号肽加工、切割不完全,酵母表达基因工程产物时,往往是Kex-2蛋白酶除去-因子的前导肽序列常不够完全,导致分泌蛋白有一个过长的氨基酸末端。,在采用pGAPZ作为表达载体时,由于信号肽加工不完全,可使表达的外源蛋白的分子量大小增加9KDa,但一般不影响其生物活性。,解决方法：采用氨基末端间隔序列解决,在-因子的前导肽序列,（3）选择标记,营养缺陷型标记：通常所用的酵母菌是组氨酸脱氢酶缺陷型的(HIS4)菌株,如GS115、KM71,只有转化了含HIS4 载体的菌株才可以在组氨酸缺陷的选择性培养基上生长注意：能在选择性培养基中生长的菌株并不一定含有目的基因,HIS4+的转化子中约10%50%根本不含有其它表达载体成分,这主要是因为载体上的HIS4 基因与基因组中的his4 位点发生重组导致回复突变所致,利用电转化时该比例更高。,抗性基因：含有细菌卡那霉素耐药基因的载体对抗生素G418 产生抗性。含有Shble 基因表达产物可以对抗生素Zeocin 产生抗性,而且在大肠杆菌与毕赤酵母中均可用作选择标记。,（3）选择标记营养缺陷型标记：通常所用的酵母菌是组氨酸脱氢酶,第三讲_基因工建制药(中)课件,第三讲_基因工建制药(中)课件,3、菌株,GS115：含有AOX1 和AOX2 基因,在含有甲醇的培养基中生长迅速(Mut+);KM71：AOX1基因被酿酒酵母的SARG4 取代,在甲醇中只能使用AOX2 来代谢甲醇,因此生长缓慢(Muts);MC10023：AOX1 和AOX2 基因均被取代,因而在甲醇为碳源的培养基中不能生长,其表型为Mut-,蛋白酶基因缺陷的菌株：SMD1163、SMD1165、SMD1168。蛋白酶缺陷型菌株的活力较差,转化率低且生长缓慢,所获外源目的蛋白产量较低。因此,只有在其他降低蛋白酶解方法均不理想时,才使用蛋白酶缺陷型菌株。,3、菌株GS115：含有AOX1 和AOX2 基因,在含有甲,4、转化,转化巴斯德毕赤酵母的常见方法有四种:原生质体转化法、电转化法、聚乙二醇(PEG)法和氯化锂(LiCl)法。原生质球和电转化法效率较高(约103 104 转化子/gDNA)。电转化简单,原生质球方法复杂。PEG 方法和LiCl 方法很简单,但这两种方法转化效率较低,且不易形成多拷贝。,4、转化转化巴斯德毕赤酵母的常见方法有四种:原生质体转化法,(1)目的基因的克隆(2)重组载体线性化(3)转化(4)筛选：利用载体和营养缺陷型菌株的互补性或对抗生素的抗性来进行初筛,复筛可用PCR。(5)外源蛋白的表达：组成型启动子,醇诱导型启动子。(6)放大：表达的条件(如通气状况,pH 值,培养基的组成等),经优化以后就可以按比例放大,从摇瓶培养转至大规模发酵。,5、巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤,(1)目的基因的克隆5、巴斯德毕赤酵母中表达蛋白的步骤,6、外源蛋白的糖基化,（1）N 糖基化：寡糖链与外源蛋白肽链糖基化识别位点(Asn-X Ser/Thr)天冬酰胺上的氮原子(N)共价结合;（2）O 糖基化：寡糖链与外源蛋白肽链丝氨酸/苏氨酸上的羟基(OH)共价结合。（3）高等真核细胞糖基化寡糖链含N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸;而低等真核细胞如巴斯德毕赤酵母在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖链只含甘露糖。（4）有些天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化。如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用。（5）巴斯德毕赤酵母为其外源蛋白添加寡糖链时,所选择的丝氨酸和苏氨酸有时也与天然宿主细胞不一致。,6、外源蛋白的糖基化（1）N 糖基化：寡糖链与外源蛋白肽,（6）巴斯德酵母表达的糖蛋白多为814 个甘露糖,产物稳定,蛋白质分子量较接近;而酿酒酵母表达的糖蛋白甘露糖残基多达50150 个,蛋白质分子量差异较大。（7）虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响,但却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。（8）从药物应用的观点来看,不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,并且会明显影响纯化过程中产率的提高。N-糖基化对于很多蛋白的正确折叠、药物动力学的稳定性和功效非常重要。,（6）巴斯德酵母表达的糖蛋白多为814 个甘露糖,产物稳,7、分泌表达,（3）分泌信号肽：包括异源蛋白自身的信号肽序列，酿酒酵母 的-MF分泌信号肽序列，毕赤酵母 的PHO I(酸性磷酸酶)分泌信号肽等。,（2）优点：利于外源蛋白的纯化。,（1）意义：分泌蛋白可进行翻译后加工,例如蛋白裂解成熟、糖基化、二硫键的形成。,7、分泌表达（3）分泌信号肽：包括异源蛋白自身的信号肽序列，,8、影响外源蛋白表达的因素及提高蛋白表达量的策略,密码子的使用频率：密码子的偏爱性,（1）外源基因的内在特性,mRNA 5端非翻译区(5UTR)：酵母中AOX1的表达量极高,可使外源基因mRNA 5UTR 和AOX1 相似或一致。,A+T含量：含量高，偶尔会造成转录提前终止，对AT 含量丰富的基因重新设计序列,使其A+T 含量在30%55%范围内。,起始密码子AUG的旁侧序列：起始密码子不可处于其周围序列形成的RNA 二级结构中。必要的Kozak 共有序列(ACCAUGG)也有助于翻译的正确起始。,8、影响外源蛋白表达的因素及提高蛋白表达量的策略密码子的使用,在不改变表达载体及宿主菌的前提下,通过从Muts 中分离Mut+自发突变体来使外源蛋白的表达量增加。,（2）载体和宿主菌,宿主菌蛋白酶对外源蛋白的影响。,转化子的表型对外源蛋白的表达有影响：蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型;对于分泌表达,Mut+和Muts 都可使用。,在高生物量发酵中,Mut+生长更快,较之Muts对于提高外源蛋白的表达量更有效。有时Muts菌株虽然在诱导阶段生长缓慢,但外源蛋白的表达反而更高,更有利于蛋白的正确折叠。,在不改变表达载体及宿主菌的前提下,通过从Muts 中分离Mu,在极少数情况下拷贝数的增加反而会导致蛋白产量的下降。,（3）基因拷贝数,一般来说，外源基因整合的拷贝数愈高,蛋白表达量愈大。,并非所有高拷贝的转化子都能产生高的表达量,特别在分泌表达时,这可能是由于高水平表达阻断分泌途径所致。,有时有意增加拷贝数对表达量并没有什么效果,在极少数情况下拷贝数的增加反而会导致蛋白产量的下降。（3）,甲醇：利用甲醇诱导外源蛋白表达,在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇,以弥补甲醇的消耗和蒸发，一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基体积0.5%。,（4）培养条件,通气：充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要。,培养基：主要对生物量和诱导表达有影响。,培养时间：培养时间长,也会产生比较大的生物量,在表达某些蛋白时发现,培养时间过长会发生蛋白质的过量水解。,甲醇：利用甲醇诱导外源蛋白表达,在诱导期间每天应往培养基,（3）连续灌注培养：,9、发酵培养的工艺,（1）两步发酵：生物量扩增阶段,加少量抑制物(通常为甘油)就能满足细胞快速生长,AOX 的表达被抑制;在表达阶段,只需让细胞耗尽剩余的甘油,然后加入甲醇,外源蛋白就能得到诱导表达,这时酵母生长及其缓慢。甲醇诱导后长达150200h 外源蛋白的表达达到高峰值，可获得高产量的重组蛋白。,（2）混合发酵：在扩增与表达阶段加入一个过渡阶段,在过渡期内按生长限制的比例添加甘油,并在甲醇诱导阶段加入甘油。这种甲醇-甘油共存的方法可使有些表达菌株更活跃,合成蛋白更迅速，缩短表达时间。,（3）连续灌注培养：9、发酵培养的工艺（1）两步发酵：生物量,10、局限性,（1）发酵周期较长,易污染,且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达;（2）利用易燃的甲醇,表达产物的卫生安全性需要考虑;（3）筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限;（4）低表达或不表达的例子也在增多。（5）分泌表达的蛋白在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解,由于甲醇酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会随着细胞密度的增高而增高。（6）有些蛋白在毕赤酵母中分泌表达时会发生过度糖基化,过度糖基化会带来一系列问题。,10、局限性,利用基因工程去掉N-糖基化位点。,如何解决酵母过度糖基化的问题？,将分泌性表达改变为细胞内表达;,用N-糖苷酶 或其它酶去掉糖基;,利用基因工程去掉N-糖基化位点。如何解决酵母过度糖基化的问,第三讲_基因工建制药(中)课件,为什么纯化后的结果是质量相近的两条带而非一条带？,为什么纯化后的结果是质量相近的两条带而非一条带？,1、生物学特性：（1）甲醇代谢与Pichia pastoris 相似，有两个乙醇氧化酶基因AUG1 和AUG2,在甲醇代谢中的作用与毕赤酵母相似。AUG1的启动子受甲醇专一诱导且高水平表达,用作调控外源基因的表达。（2）AUG1 基因的表达被葡萄糖抑制,但能被甲醇作唯一碳源诱导迅速表达,与Pichia pastoris 不同,葡萄糖对AUX1 启动子的阻遏,转换为甲醇为唯一碳源的培养基不能迅速解除抑制,因此,可以让Pichia methanolica 在葡萄糖培养基上良好生长,待葡萄糖消耗完后再用甲醇进行诱导。,（二）甲醇毕赤酵母 Pichia methanolical,1、生物学特性：（二）甲醇毕赤酵母 Pichia meth,2、表达载体：美国的Invitrogen 公司推出了两种表达质粒pMET、pMET。（1）pMET 用于胞内表达（2）pMET用于分泌表达,与Pichia pastoris 一样利用酿酒酵母 的-MF 信号肽序将表达产物分泌到胞外（3）与Pichia pastoris 不同的是,在转化子中以可产生1-10%的多拷贝重组子,表达质粒没有卡那霉素基因用于筛选多拷贝重组子,可以通过southern 杂交来检测重组子的拷贝数。（4）在转化子中筛选高产表达菌株,因为不是拷贝数越多表达量就越高,特别对分泌表达来说,有时单拷贝能获得最高表达。,2、表达载体：美国的Invitrogen 公司推出了两种表达,3、宿主菌（1）两种宿主菌，为PMAD11 和PMAD16，都是ADE2(磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶)缺陷型。（2）PMAD16 是由PMAD11 进一步突变而来,缺失了蛋白酶基因,因此MAD16 适合于表达对蛋白酶敏感的外源蛋白质,但在基本培养基上PMAD16 慢于PMAD11。（3）PMAD11和PMAD16 原始菌株是粉红色菌落,而转化子为白色,可以通过颜色的改变筛选转化子。（4）表达载体通过同源重组以AUG1 作为整合位点将表达质粒的外源基因整合到染色体上,转化子的表型可能是Mut+也可能是Muts,与Pichia pastoris 一样需要鉴定转化子表型。,3、宿主菌,（3）汉逊酵母和其它酵母一样可以分泌表达,利用高效分泌表达载体,将水蛭素基因(hirudin)与MF-的信号肽进行融合，表达后能高效分泌且先导肽能被正确切除,在10L 发酵罐中的分泌量可以达到1g/L 以上。,（三）多形汉逊酵母 Hansenula polymorpha,（1）耐高温甲醇酵母,只有一个编码甲醇氧化酶的基因(MOX),其启动子是强诱导启动子,与其它醇氧化酶启动子不同,该启动子对葡萄糖的阻遏不敏感,在葡萄糖限制或缺乏的条件下,能够被甲醇诱导,因此从培养向诱导的转换非常容易,在实际应用中有很大的优越性,其表达量高于其它的酵母表达系统。,（2）表达系统的整合方式与毕赤酵母不同,毕赤酵母通过同源重组进行整合,得到的重组子90%以上是单拷贝,通过筛选可以得到多拷贝重组菌,但拷贝数也不是很高。汉逊酵母的表达载体含有宿主菌的HARS（tRNA合成酶）序列,通过自我复制引导外源基因非同源性整合到染色体,50%以上的重组子是多拷贝,可以获得拷贝数为100 以上的重组菌株。表达载体也可以利用rDNA 的重复序列引导外源基因整合到染色体上,从而获得高拷贝数的重组菌。,（3）汉逊酵母和其它酵母一样可以分泌表达,利用高效分泌表达,（4）要使多个基因同时在同一个宿主中表达,可以把多个基因的表达盒串联在一个表达载体转化到宿主表达,这不仅会增加表达载体的构建难度,而且基因的表达剂量多为11,难以广泛应用。由于Hansenula polymorpha 能够形成高拷贝数的重组子,就可以把多个基因分别整合到染色体上共同表达,并筛选到各基因拷贝数合适比例的重组菌,使各基因在重组子中按预期的剂量表达,形成甲醇酵母代谢工程菌,使甲醇酵母细胞变成一个生物反应器,从而使甲醇酵母能够高效合成需要多种酶才能合成的药物等物质。,（4）要使多个基因同时在同一个宿主中表达,可以把多个基因的表,（1）Candida 是酵母菌中最大的一个属,有200 多个种。（2）Candida biodini为多倍体,碳源同化能力强,能利用多种碳源。由于多倍体难于获得营养缺陷型构建转化系统,限制Candida biodini 作为表达系统的应用。（3）Candida biodinii 中分离到受甲醇调控的乙醇氧化酶基因(AOD1),随后利用URA3 作选择标记构建了高效的转化系统,为Candida biodinii 表达系统的应用创造了很好的条件。（4）Candida biodinii 表达系统是利用乙醇氧化酶(AOD1)的启动子对外源基因的表达进行调控,葡萄糖抑制AOD1 的表达,用甘油作碳源时不抑制AOD1 的表达。（5）以AOD1 为启动子构建酿酒酵母 的腺苷酸激酶的表达质粒,并转化Candida biodinoii 得到的重组菌株中腺苷酸激酶表达量占细胞可溶性总蛋白的22-28%;用甲醇-甘油培养基在1.5L 的摇瓶中培养60h,其表达的产量达到2g/L 以上。,三、博伊丁假丝酵母 Candida biodinii,（1）Candida 是酵母菌中最大的一个属,有200 多个,