第七章酶化学课件.ppt

酶动力学及其作用机制,生物资源与环境科学学院胡 疆,酶动力学及其作用机制生物资源与环境科学学院,第一节 酶引论,酶的概述,1,酶的化学本质,2,酶的命名和分类,3,酶活力的测定,4,核酶,5,酶分子工程,6,第一节 酶引论酶的概述1酶的化学本质2酶的命名和分类3酶活力,酶促反应的特点：,a.具有极高的催化效率：酶的催化效率可比一般化学催化剂高1071013倍，比没有催化剂时高出1081020倍,如：在0度时：,1mol Fe2+每秒催化10-5 mol,1mol 过氧化氢酶 每秒催化10 5 mol,1.3.酶促反应的特点,b.酶促反应的作用条件温和,酶是由活细胞产生的，对周围环境的变化很敏感，不耐高温，高压，遇到强酸，强碱，重金属或紫外线等因素很容易失去活性。一般是在生物体温度范围内和接近中性的环境中起反应，即在常温，常压，酸碱度在接近中性环境条件下发挥作用。,酶促反应的特点：a.具有极高的催化效率：如：在0度时：2,c.酶促反应的可调控性,酶的催化活性在体内受到多种因素的调节，这是酶区别于一般催化剂的重要特征。,如：共价修饰 酶原激活 反馈抑制调节等,酶活性的调节,酶含量的调节,如：操纵子学说理论,连续反应链条：一个酶反应的产物是另一酶反应的底物限速步骤：活化自由能做最高的一步反应反馈抑制：链的最终产物积累过多，它对限速步骤的酶产生的抑制作用,c.酶促反应的可调控性酶的催化活性在体内受到多种因素的调节,d.具有高度的底物专一性（specificity）,一种酶只作用于一种或一类化合物，以促进一定的化学变化，生成一定的产物，这种现象称为酶作用的特异性或专一性。H+可以催化多糖、脂质和蛋白质的水解。,如：蔗糖酶催化蔗糖的水解 蛋白酶催化蛋白质的水解,d.具有高度的底物专一性（specificity）一种酶只,结构专一性,绝对专一性：脲酶、麦芽糖酶,相对专一性,立体专一性,基团专一性：己糖激酶、蛋白水解酶,键专一性：脂肪酶,光学专一性：胰蛋白酶（L-氨基酸）,几何专一性：琥珀酸脱氢酶,底物专一性：,结构专一性绝对专一性：脲酶、麦芽糖酶相对专一性立体专一性基团,（1）绝对专一性,酶对催化反应的底物有严格的要求，仅仅对一种底物产生作用并且要求键和键两端的基团特异性很强。,如：脲酶只能催化尿素的水解,H2O,2NH3+CO2,脲酶,如果尿素分子上的一个氨被氯或甲基取代，形成结构相似的衍生物，则脲酶却不发生反应。,Cl,-CH3,氯代尿素,甲基代尿素,（1）绝对专一性酶对催化反应的底物有严格的要求，仅仅对一种,（2）相对专一性,酶对底物的要求不是特别严格，只要键或键两端的基团相似即可催化反应。,基团专一性：酶只需要底物分子反应键一端的基团与之适应,键专一性：酶只要求底物中有适应的化学键即可，对键两端的 基团没有要求,基团专一性 例如：-葡萄糖苷酶,要求必须有糖苷键，并且一端必须是葡萄糖，另一端没有要求。,（2）相对专一性酶对底物的要求不是特别严格，只要键或键两端,键专一性 例如：脂肪酶 糖苷酶 蛋白酶,只要求键适合即可，对键两端的基团没有要求,脂肪酶,糖苷酶,蛋白酶,键专一性 例如：脂肪酶 糖苷酶 蛋白酶只要求键适,（3）立体专一性,几乎所有的酶对底物的立体结构都有高度的选择性，即只能作用于底物的立体异构中的一种,如：氨基酸除甘氨酸外都有 D/L两种旋光异构体 糖类也有D/L两种异构体 双键化合物存在顺/反异构现象,L-精氨酸氧化酶只能催化L-精氨酸氧化脱氨基，对D-精氨酸酶作用,延胡索酸酶只能催化 反-丁烯二酸（延胡索酸）水合生成苹果酸，而对顺丁烯二酸（富马酸）没有作用,（3）立体专一性几乎所有的酶对底物的立体结构都有高度的选择,酶的立体专一性包括旋光异构专一性、顺反异构专一性和区分对称分子中的两个相同的基团。,+H2O,延胡索酸酶,H-C-COOHHOOC-C-H,反丁烯二酸（延胡索酸）,COOHHO-C-H CH2 COOH,L-苹果酸,酶的立体专一性包括旋光异构专一性、顺反异构专一,（a）锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,(刚性模式)（E.Fisher）,1.4.酶催化化学反应的原理学说（决定酶专一性的机制）,（a）锁钥学说 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶,第七章酶化学课件,(b)“三点结合”的催化理论（A.Ogster）,认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。用于解释立体催化的机理,(b)“三点结合”的催化理论（A.Ogster）认为酶与底物,H,HO-CH2,CH2-OH,OH,A,B,C,甘油分子的三个立体基团都同时附着于甘油激酶的分子表面的特异结合位点AB C上，这三个部位有一个是催化部位两外两个是结合部位，即甘油分子与甘油激酶只有一种结合方式。,结合部位,催化部位,HHO-CH2CH2-OHOHABC甘油分子的三个立体基团都,HO,COOH,CH3,OH,HOOC,CH3,乳酸脱氢酶,L-(+)-乳酸,d-(-)-乳酸,结合发生反应,不能结合，不能发生反应,HOCOOHCH3OHHOOCCH3乳酸脱氢酶L-(+)-乳,（c）诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,(柔性学说)(D.E.Koshland),（c）诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定,酶蛋白(apoenzyme)：多肽；决定特异性、高效性,辅因子(cofactor)：非蛋白组分；递氢、电子、基团；决定反应类型、性质,全酶(缀合蛋白),2.1.酶的化学本质,辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合牢固，不能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子,辅酶(coenzyme):：与酶蛋白结合不牢固，能用透析等简单方法与酶蛋白分离的有机小分子。,简单蛋白质：有氨酸酸残基：溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶,酶蛋白(apoenzyme)：多肽；决定特异性、高效性辅,辅酶辅基与维生素及核苷酸的关系,辅酶辅基与维生素及核苷酸的关系,1.稳定构象：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；2.构成酶的活性中心：作为酶的活性中心的组成成分，参与构成酶的活性中心，如辅酶或辅基；3.连接作用：作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。,酶辅基中金属离子的作用,如：醛缩酶 需要 Mn 2+,如：唾液淀粉酶 需要 Cl-,如：磷酸酶 需要 Mg 2+,如：抗坏血酸氧化酶 需要 Cu 2+,1.稳定构象：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；酶辅基中,2.2 酶的四级缔合,单体酶：只有一条多肽链，催化水解反应的酶，核糖核酸酶A，溶菌酶；胰凝乳蛋白酶（3条肽链）寡聚酶：具有多条多肽链，同多聚酶（丙酮酸激酶）、杂多聚酶（乳酸脱氢酶）多功能酶（串联酶）：多种酶缔合而成的结构、功能实体，催化细胞代谢中的连续反应序列。一个酶分子具有多种生物催化活性，由多酶体系在进化中基因融合形成，丙酮酸脱氢酶复合物,2.2 酶的四级缔合 单体酶：只有一条多肽链，催化水解反应的,多功能酶,多功能酶（Multifunctional Enzyme ME）:结构上仅有一条肽链，但却有两种或两种以上的功能的酶蛋白。,如：大肠杆菌（E.coil）的 天冬氨酸激酶I高丝氨酸脱氢酶I,这个酶有四个亚基组成，但两催化作用的活性中心在一条多肽链上，其中链的N端部分具有天冬氨酸激酶活性，链的C端具有高丝氨酸脱氢酶的活性。,如：动物体中 脂肪酸合成酶，7种功能集中在一条多肽链上。,多功能酶多功能酶（Multifunctional Enzym,如：大肠杆菌 色氨酸合成酶,寡聚酶有不同亚基组成，每个亚基表现出不同的催化功能，也称为多功能酶。,该酶含有两种亚基，,亚基I A蛋白 M29500,亚基IIB蛋白 M450002,A2B=2,色氨酸合成酶,吲哚甘油磷酸 吲哚 3-磷酸甘油醛,吲哚 L-丝氨酸 L-色氨酸,吲哚甘油磷酸 L-色氨酸 3-磷酸甘油醛,A蛋白,B蛋白,色氨酸合成酶,如：大肠杆菌 色氨酸合成酶寡聚酶有不同,1.酶活力:指酶催化一定化学反应的能力，酶活力与酶催化的化学反应速度成正比2.反应速度：用单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示（单位：浓度/时间）3.酶的活力单位1个酶活力单位（IU）:规定的条件下,在1分钟内催化1mol底物转化为产物的酶量（1961年)。1个Katal:规定的条件下,每秒钟内催化1mol底物转化为产物的酶量（1972年)。条件：温度25摄氏度,其它条件(PH及底物浓度)均采用最适条件。,4.2 酶活力的测定,1.酶活力:指酶催化一定化学反应的能力，酶活力与酶催化的化,反应速率为A对时间的导数反应速率在曲线上某一点的斜率酶活力测定采用初速度v0,反应速率为A对时间的导数,一般以测定产物为好-底物浓度为量，测定不准确；产物从无到有，准确。酶反应速度在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。原因：A.底物浓度下降B.酶在一定PH及温度下失活C.产物对酶的抑制，产物上升而加速逆反应。测定浓度的方法：分光光度测定法、荧光测定法其他方法：化学分析法、电化学法、放射性同位素测定法,所以研究酶的反应速度以酶促反应的初速度为准。,一般以测定产物为好-底物浓度为量，测定不准确；产物从无到有,4酶的比活力 酶含量大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位/毫克蛋白（/mg蛋白质)每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示（单位/克 or 单位/ml）对同一种酶来说，比活力越高，表示酶越纯。5酶的转换数kcat 每分钟1mol酶分子转换底物的微摩尔数（mol）,4酶的比活力,6酶活力的测定反应时间尽量短，5min之内温度、pH等条件保持恒定为了让酶的催化潜能重复表现出来，底物和酶的辅助因子必须过量反应初速度与底物浓度是零级反应，与酶浓度是一级反应酶反应进程曲线酶浓度曲线对照和空白,6酶活力的测定,典型例题,称取25mg蛋白酶粉配置成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，用Folin酚法测定酶活力，得知每小时产生1500g的酪氨酸；另取2ml酶液，用凯氏定氮法测的蛋白氮为0.2mg，若以每分钟产生1g酪氨酸为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：（1）1ml酶液中所含的蛋白质的量及活力单位数？（2）比活力？（3）1g酶制剂的总蛋白含量及总活力？,典型例题称取25mg蛋白酶粉配置成25ml酶溶液，从中取出0,解：（1）由题意，已知2ml酶液中含0.2mg蛋白氮，则1ml酶液中含0.1mg蛋白氮 因为，蛋白质中平均含N量16%所以，0.1mg氮相当于蛋白质的量为：0.1/16%=0.625mg 即：1ml酶液中蛋白质含量为0.625mg 又已知：0.1ml酶液中每小时产生1500 g酪氨酸 则：1ml酶液中每小时产生1500 10g酪氨酸 据定义：每分钟产生1 g酪氨酸的酶量为1个活力单位 所以：1ml酶液中所含酶单位为：,解：（1）由题意，已知2ml酶液中含0.2mg蛋白氮，150,（2）比活力是指酶活力单位/mg酶蛋白 由前计算可知：0.625mg酶蛋白含250酶单位 则：1mg酶蛋白含x个酶单位,（3）总活力=比活力酶蛋白总量=400625=2.5105酶单位,（2）比活力是指酶活力单位/mg酶蛋白（3）总活力=比,一、酶促反应的速度和影响因素,在低底物浓度时,反应初速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度较高时，增加底物浓度，反应初速度增加的较慢，反应速度与底物浓度不再呈正比，表现为混合级反应。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应初速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应初速度不再增加，表现为零级反应。,（一）底物浓度对酶促反应速度的影响,一、酶促反应的速度和影响因素在低底物浓度时,反应初速度与底,底物对酶促反应的饱和现象,饱和效应，非催化反应无此效应中间复合体学说,底物对酶促反应的饱和现象饱和效应，非催化反应无此效应,稳态模型的4个假设：E与S形成ES复合物的反应是可逆反应，快速平衡反应，ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于限速步骤S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt游离酶浓度=E-ES不考虑 P+E ES 这个逆反应,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,稳态模型的4个假设：中间产物 酶促反应模式中间产物学说E,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数(Michaelis constant),0,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物,推导过程:游离酶浓度=Et-ES ES生成速度=k1(Et-ES)*S ES分解速度=k2ES+k-1ES 当稳态时：ES生成速度=ES分解速度 k1(Et-ES)*S=k2ES+k-1ES,推导过程:E+S k1k-1k2ESE+P,(Et-ES)*S k-1+k2 ES k1 ES=因v=k2ES，当所有E被S饱和时，即达到最大速度，此时ES=Et，Vmax=k2 Et 代入上式：,=,=Km,v0=,k2EtS,Km+S,Vmax S,Km+S,=,k1(Et-ES)*S=k2ES+k-1ES,(Et-ES)*S k-1,米-曼氏方程解释：当SKm时，v=(Vmax/Km)S,即v 与S成正比当SKm时，v0 Vmax，即S而v不变当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2 Vmax,Km=S,0,米-曼氏方程解释：0,1.当0=1/2Vmax时，Km=S。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。,米氏方程的意义,1.当0=1/2Vmax时，Km=S。因此，Km,2.Km的应用是有条件的,Km值作为常数是在特定的底物、一定的温度、pH等条件下才成立的，所以，Km值可以作为鉴定酶的手段，但必须在指定的实验条件下进行才有意义。,3.Km可以反映酶与底物亲和力的大小K2k-1时，Kmk-1/k1,Km越小，酶与底物的亲和力越大,0,2.Km的应用是有条件的Km值作为常数是在特定的底物、一定,0,4.可用于判断反应级数：当S100Km时，=Vmax，反应为零级反应 当0.01KmS100Km时，为混合级反应。,E+S k1k-1k2ESE+P0 4.可用于判断,Km值在试剂应用中的意义,1.鉴定酶,测定Km值可以鉴别不同来源或相同来源的不同发育期下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。,2.Km可用来判断酶的最适底物（天然底物）当酶有几种不同的底物存在时，每个底物对酶都有一个Km值，通过测定酶在不同底物存在时的Km值，Km值最小者，即为该酶的最适底物。,3.可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度 当S=10Km时，=91%Vmax，此时即为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。,0,Km值在试剂应用中的意义1.鉴定酶测定Km值可以鉴别不同,4.了解酶的底物在体内具有的浓度水平,一般说来，作为酶的最适底物，在体内的浓度水平是接近它的Km值的，,如果：S体内 Km 则，v Vmax,大部分酶处于无用状态,如果：S体内 Km 则，v 始终接近于 Vmax,这种底物浓度也失去其生理意义，不符合实际情况,4.了解酶的底物在体内具有的浓度水平一般说来，作为酶的最,5.判断反应方向与趋势,酶催化可逆反应，正逆反应的Km值一般不同，测定正逆反应的Km值可以大致推测该酶催化的正逆反应的方向，这对了解细胞内酶的催化方向是非常重要的。,6.推测代谢途径,丙酮酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶,丙酮酸脱氢酶系,丙酮酸脱羧酶,乳酸,1.710-5,1.010-3,1.310-3,0,5.判断反应方向与趋势酶催化可逆反应，正逆反应的Km值一般,Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vmax=K2 Et，当酶的总浓度和最大速度已知时，如可从Vmax计算酶的转换数，即动力学常数K2。酶的转换数(turnover number):当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。酶的转换数可用来比较每单位酶的催化能力,Vm的意义,Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vm的意,斜率=Km/Vmax,-1/Km,1/Vmax,Km和Vmax的测定:Lineweaver-Burk方程(双倒数作图法),当1/S=0时，1/v=1/Vm 直线纵轴上的截距即为1/Vmax,从方程可看出当1/v=0时，则1/S=-1/Km直线外推至与横轴相交，其横轴截距既为-1/Km,斜率=Km/Vmax-1/Km1/VmaxKm和Vmax的测,1.pH 的影响在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,通常称为最适pH,唾液淀粉酶,精氨酸酶9.8,胃蛋白酶1.5,植物和微生物 最适pH4.5-6.5,动物 最适pH6.5-8.0,最适pH不是酶的特征常数该值随着底物性质及浓度、介质的离子强度、温度与作用时间不同而不同,（二）影响酶促反应速率的其他因素,1.pH 的影响在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,pH对酶促反应速度的影响原因：,1.导致蛋白质变性2.影响酶分子的构象过高过低的pH会改变酶的活性中心的空间构象，甚至改变整个酶分子的构象3.影响酶和底物的互相解离酶和底物的结合的前体是基团处于解离状态，而其解离受到外界pH值影响很大，即受到酸碱度的影响,pH对酶促反应速度的影响原因：1.导致蛋白质变性,另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。,2.温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。温度每上升10度所增加的化学反应速率，称为温度系数（Q10）,另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性,就整个生物界，植物和微生物 最适温度32度-60度 动物 最适温度35度-40度,少数特殊酶，如液化淀粉酶 的最适温度为85度,最适温度不是酶的特征常数，该值随着底物性质及浓度、介质的离子强度、温度与作用时间不同而不同。,意义：,临床上，低温麻醉，减慢细胞的代谢速度，以利于治疗,低温保藏种子，降低酶的活性,医学上，实验室中高温消毒，高温是酶蛋白变性,就整个生物界，少数特殊酶，如液化淀粉酶 的最适温度为85度最,4.4 激活剂对反应速度的影响,能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。1.酶的激活剂大多数是无机离子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。,如：醛缩酶 需要 Mn 2+,如：唾液淀粉酶 需要 Cl-,如：磷酸酶 需要 Mg 2+,如：抗坏血酸氧化酶 需要 Cu 2+,2.有些酶的激活剂中等大小的分子：半胱氨酸 巯基乙醇 谷胱甘肽 维生素,4.4 激活剂对反应速度的影响 能够促使酶促反应速度加快的物,3.大分子物质 如激活酶原的物质：激酶效用：提高酶的活性：使已有活性的酶的活性进一步提高 酶原的激活：使本来没有活性的酶原变成有活性的酶酶原的激活有些酶，当肽链合成后，即可自身折叠形成一定的三维结构，即表现出活性，如：溶菌酶有些酶，合成肽链后，是没有活性的前体：称为酶原酶原经激活活性中心暴露，才成为有活性的酶，这是生物自我保护的一种方式；它可保护其产生及运输部位的组织不被水解。,去掉部分肽段,3.大分子物质 如激活酶原的物质：激酶没有活性的酶原有,肠激酶或肠蛋白酶,胰蛋白酶原的激活,肠激酶或肠蛋白酶,胰蛋白酶原,肠激酶或肠蛋白酶Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Ly,激活剂作用特点：酶对激活剂有一定选择性，Mg2+对脱羧酶有激活作用，对肌球蛋白的ATP酶抑制某些离子有拮抗作用，Na+抑制K+的激活作用有些金属离子激活剂可以相互替代，Mg2+可被Mn2+替代激活剂的作用与浓度有关，NADP+合成酶，Mg2+在510*10-3mol/L有激活作用，到30*10-3mol/L活性降低激活剂作用机制多种多样，作为辅酶、辅基，或者活性中心的构成部位,激活剂作用特点：,4.抑制剂对酶活性的影响,抑制剂:与酶分子的某些必需集团结合，使酶的活性降低或丧失，这个现象，称为酶的抑制作用。抑制剂对酶具有选择性，他涉及酶的局部结构变性剂：对酶无选择性，影响酶的整个三维结构。在变性剂的作用下引起酶活力降低或丧失的现象叫失活酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,4.抑制剂对酶活性的影响抑制剂:与酶分子的某些必需集团结合,按照抑制机理分类：,失活作用：在外界物理或化学因素作用下，破坏了价键，使酶分子的构象发生改变，即蛋白质变性，变性剂对酶没有选择性,抑制作用：酶的必须基团受到外界的抑制剂的影响，而发生改变从而导致酶活性的降低或丧失。抑制剂对酶有一定的选择性,去激活作用：金属酶（必须要金属离子存在下才有活性或高活性）如果用螯合剂取出金属离子，从而使酶的活性降低或丧失，常见的EDTA去除二价阳离子（Mg2+、Mn2+）可降低许多酶的活性。,按照抑制机理分类：失活作用：在外界物理或化学因素作用下，破坏,(1).可逆抑制抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析、超过滤等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。I、E、ES之间存在平衡，抑制程度由E与I的亲和力、I和S的浓度决定。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为:竞争性抑制、反竞争性抑制、非竞争性抑制几种类型。,抑制剂的作用方式,(1).可逆抑制 抑制剂的作用方式,竞争性抑制:最常见、I与S有相似结构，争夺E活性部位，I与E的活性部位结合，但不转化为产物，竞争性抑制可借助增加底物浓度而消除。例：琥珀酸脱氢酶（丙二酸与丁二酸相似）,竞争性抑制:最常见、I与S有相似结构，争夺E活性部位，I与E,反竞争性抑制：不与游离E结合，只与ES结合。结合在E活性部位以外的结合部位，不影响E与S的结合。阻止IES形成产物，增加底物，反应速率增加，但比无抑制剂时要小，与竞争性抑制不同。,反竞争性抑制：不与游离E结合，只与ES结合。结合在E活性部位,非竞争性抑制：结合在E活性部位以外的结合部位，可以与E（非活性部位）和ES结合。S和I与E结合互不干扰的为纯非竞争性抑制。有影响的为混合型非竞争性抑制。,非竞争性抑制：结合在E活性部位以外的结合部位，可以与E（非活,抑制剂的作用方式,a.不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。随I的浓度和作用时间增加而增强，不能用米-曼方程处理。引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂对乙酰胆碱酯酶。,抑制剂的作用方式a.不可逆抑制,酶的不可逆抑制作用包括:,专一性不可逆抑制：抑制剂只作用于一种氨基酸侧链或一类酶,非专一性不可逆抑制：抑制剂作用于酶分子上的不同基团或作 用于几类不同的酶,如：路易士气对巯基酶的抑制、烷化剂（碘乙酸，DNFB）酰化剂（酸酐，碘酰氯）,如：有机磷农药对胆碱酯酶的丝氨酸羟基抑制 有机汞专一抑制巯基、二异丙基氟磷酸（DFP）,酶的不可逆抑制作用包括:专一性不可逆抑制：抑制剂只作用于一种,Ev1.无抑制剂2.不可逆抑制剂3.可逆抑制剂,可逆抑制的动力学,写出可逆抑制的动力学模型根据模型，写出酶守恒公式总的各项速率表达式写出如下根据稳态假设写出各种酶形式Ei的代数式，代入上式，消去实验不易测定的变数项动力学实验设计：I保持不变，S逐步增加，每一S测定v0，然后做双倒数曲线做几个不同I浓度的抑制实验曲线,可逆抑制的动力学写出可逆抑制的动力学模型,(1)竞争性抑制动力学曲线,无抑制剂,竞争性抑制剂,1/Vmax,加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应速度减小。,E+S,ES,I,+,EI,ki,k1,k2,K-1,E+P,(1)竞争性抑制动力学曲线无抑制剂竞争性抑制剂1/Vmax加,竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；动力学参数：Km值增大，Vm值不变。,竞争性抑制的特点,竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；竞争性抑制的,抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。反竞争性抑制的特点：反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；动力学参数：Km减小，Vm降低。,(2)反竞争性抑制,抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，,(2)反竞争性抑制,(2)反竞争性抑制,(3)非竟争性抑制,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；动力学参数：Km值不变，Vm值降低。,(3)非竟争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构,非竞争性抑制的动力学曲线,加入非竞争性抑制剂后，Km 虽然不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降,无抑制剂,非竞争性抑制剂,-1/km,非竞争性抑制的动力学曲线加入非竞争性抑制剂后，Km 虽然不,酶的活性中心,一、酶的活性中心,酶分子上具有一定空间构象的部位，该部位必须化学基团集中，直接参与将底物转变为产物的反应过程，这一部位就称为酶的活性中心,第三节 酶的作用机制和酶活性的调节,酶的活性中心一、酶的活性中心酶分子上具有一定空间构象的部位，,活性中心,结合中心：直接与底物结合的部位,催化中心：促进底物发生化学变化的部位,酶的专一性,酶催化反应性质,活性中心内必需基团活性中心外必需基团 结合基团 催化基团活性,a.结合部位(Binding site)酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,酶分子的结构特点,a.结合部位(Binding site)酶分子的结构特点,第七章酶化学课件,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。,b.催化部位(catalytic site),酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。b.催化部位,酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,c.调控部位(Regulatory site),酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从,主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基,酶活性中心的必需基团,Ser,Cys,His,酶分子中有多种基团，但并不是所有的基团都参加底物的催化反应只有少数几个官能团参与底物的催化作用。这种与酶催化底物反应有关的少数几个官能团称为 必须基团,主要包括：酶活性中心的必需基团SerCysHis酶分子中有多,酸碱性基团：天门冬氨酸和谷氨酸的羧基赖氨酸的氨基酪氨酸的酚羟基组氨酸的咪唑基半胱氨酸的巯基,Asp,Glu,Cys,必须基团一般位于活性中心，直接参与底物的结合作用或催化反应少数位于活性中心之外，起稳定酶构象，对酶活性中心的催化起间接帮助作用。,酸碱性基团：AspGluCys必须基团一般位于活性中心，直接,D.E.Koshland的酶氨基酸残基的分类,1.接触残基(contact residue)：直接与底物接触的基团,2.辅助残基(auxiliary residue)：不直接与底物接触的基团，但能促进接触基团与底物的结合或催化反应。,3.结构残基(structure residue)：活性中心外的必须基团，主要作用是稳定酶的构象，特别是活性中心的构象。,4.非贡献残基(non-contribution redidue)：对酶的结合和催化没有直接作用的基团,结合基团：直接与底物结合的基团,催化基团：直接催化底物化学键转变的基团,D.E.Koshland的酶氨基酸残基的分类1.接触残基(c,非贡献残基一般在体内起着帮助蛋白质合成、蛋白质运输、蛋白质加工，防止蛋白质降解等方面起作用,R169,R162,R10,R9,R8,R7,R6,R5,R4,R3,R2,R1,R164,R165,R163,非贡献残基一般在体内起着帮助蛋白质合成、蛋白质运输、蛋白底物,酶活性中心的特点：,酶活性中心的特点：由少数基团决定，占酶整体很小一部分,酶促反应：E+SESEXEPE+P反应方向,即化学平衡方向,主要取决于反应自由能变化G。而反应速度快慢,则主要取决于反应的活化能Ea。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,起到提高反应速度的作用,从初态转化为过渡态需要能量，即为活化能（Energy of activation EACT），活化能越大，中间产物越难形成，反应越难进行。,二、酶作用高效率的机制：活化能降低,酶促反应：E+SESEXEPE+P从初态转化为过渡,反应过程中能的变化,能阈,反应过程中能的变化能阈,降低活化能的因素：,(1)邻近效应依据化学反应速率原理：化学反应速率与底物浓度成正比，增加底物浓度，可以使化学反应速率向正方向进行。分子间反应变成类似分子内反应。底物在酶活性部位的“有效浓度”比溶液中高。咪唑催化乙酸-p-硝基苯酯，有效浓度相当于24倍35mol/L，839mol/L,降低活化能的因素：(1)邻近效应,降低活化能的因素：,(2)定向效应有效浓度为103108反应基团在游离的反应系统中只能凭碰撞时的概率。分子内反应是，两个相互靠近的反应基团电子轨道的定向排列，排列要求严格，轨道导向内酯化速度B：A2.5*1011倍,降低活化能的因素：(2)定向效应,降低活化能的因素：,(3)诱导契合和底物变性诱导契合：很多酶必须在底物诱导下发生构象变化才能与底物贴切结合，底物变性：电子的重新分配，产生“电子张力”，从而使底物中敏感键更容易破裂。酶和底物发生形变和张力，涉及到敏感键发生拉伸、扭转和催化基团的适当定位形变向ES复合体提供能量，去稳定化，使底物反应性增加，有利进入过渡态，加速反应的进行。去溶剂化、静电去稳定化+熵丢失（内在自由能）,降低活化能的因素：(3)诱导契合和底物变性,(5)微环境的影响（静电催化）,指酶活性中心的催化基团所处的微小环境。1、位于酶的凹穴处的活性中心，是非极性的，2、在低介电环境中，电荷间的吸引力与排斥力比在水中强的多，所以在非极性环境中有利于敏感键的产生与中间产物的形成。3.水溶液中不可能的同时高浓度酸碱，这可实现,水减弱了极性基团间的相互作用,降低活化能的因素：,(4)电荷极化、多元催化电荷极化为基元反应提供催化基团，广义酸碱、亲核剂、亲电剂、金属离子多元催化提供降低活化能的途径,(5)微环境的影响（静电催化）指酶活性中心的催化基团所,五.酶活性的别构调节,生物体内的各种生理活动均以一定的物质代谢为基础。为了适应某种生理活动的变化，需要对一定的代谢活动进行调节。通过对酶的催化活性的调节，就可以达到调节代谢活动的目的。可以通过改变其催化活性而使整个代谢反应的速度或方向发生改变的酶就称为限速酶或关键酶。酶结构的调节是通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性的调节方式。酶结构的调节是一种快速调节方式。,五.酶活性的别构调节 生物体内的各种生理活动均以一定的物质代,1.别构调节（变构调节）,别构效应：寡聚酶上亚基的配体结合部位与配体非共价结合时，酶发生构象变化并影响同一酶分子的其他亚基上的空的活性部位的亲和力。同促效应：酶与底物结合时催化部位与催化部位之间的相互作用异促效应：酶与调节物结合时调节部位与催化部位之间的相互作用底物结合部位和别构部位可以位于同一亚基的不同部位上，也可以处于不同的亚基上。脱敏作用：热处理或化学修饰，别构酶的亚基解离，失去对调节物的敏感性，催化活性保留。正效应物：活性增加的配体负效应物：活性价低的配体,1.别构调节（变构调节）别构效应：寡聚酶上亚基的配体结合,同促别构酶观察变构酶的底物浓度对酶促反应速度影响时，可发现-S为“S”形曲线。这是由于底物对变构酶存在同促正协同效应。不遵循米氏方程,S形曲线别构酶,双曲线 米氏酶,同促别构酶S形曲线双曲线,异促别构酶K系统：适合体内S常处于K0.5附近K0.5增大或减小，当Vmax不变。A使S形曲线向双曲线方向转变，任一S，v0都比无激活剂高V系统：适合体内S常处于饱和浓度饱和曲线都是双曲线A使曲线方向的Vmax升高，I 使曲线方向的Vmax降低,异促别构酶,（2）序变模型,（1）齐变模型,KNF模型,MWC模型,协同性配体结合的模型,（2）序变模型（1）齐变模型KNF模型MWC模型协同性配体结,协同性配体结合的模型,两模型的不同点：别构酶每个亚基的两种构象态（T态、R态）MWC模型两种构象态都存在，并处于平衡中KNF模型无配体时只能以T态存在别构物与酶的一个亚基结合后MWC：所有亚基的构象同时变化，不允T态、R态同时出现在一个寡聚酶分子中KNF模型：只引起该亚基的构象变化，T态R态，不能改变其邻近空位亚基的构象，才去渐变的方式,协同性配体结合的模型两模型的不同点：,1.酶的可逆共价修饰酶分子中的某些基团，在其它酶的催化下，可以共价结合或脱去某些小分子基团，从而引起酶分子构象的改变，使其活性得到调节，这种方式称为酶的共价修饰目前已知有六种修饰方式：磷酸化/去磷酸化 腺苷酰化/去腺苷酰化 乙酰化/去乙酰化 尿苷酰化/去尿苷酰化 甲基化/去甲基化 氧化（S-S）/还原(2SH),六、酶活性的共价调节,1.酶的可逆共价修饰六、酶活性的共价调节,蛋白激酶,ATP,ADP,磷酸化酶 b,（无活性）,磷酸化酶a,（有活性）,蛋白磷酸酶,-OH,H2O,例：糖原磷酸化酶的共价修饰（磷酸化/去磷酸化）,糖原(n)Pi 1-P-G+糖原(n-1),糖原磷酸化酶a,糖原磷酸化酶有两种状态：失活态（b）和活化态（a）,Ser Thr,蛋白激酶ATPADP磷酸化酶 b（无活性）磷酸化酶a P,糖原合成酶和糖原磷酸化酶的调控,糖原磷酸化酶 a(有活性),糖原合成酶和糖原磷酸化酶的调控糖原磷酸化酶 a(,例：谷氨酰胺合成酶（GS）的共价修饰(腺苷酸化/去腺苷酸化),谷氨酸 NH3 谷氨酰胺,谷氨酰胺合成酶（GS）,ATP ADP,Mg2+,谷氨酰胺合成酶含有12个相同的亚基，每个亚基得到ATP中的一个腺苷酸基,腺苷酸化的谷氨酰胺合成酶（GSn-）,谷氨酰胺合成酶转腺苷酸酶,ATPPPi,ADP Pi,脱腺苷酸酶,例：谷氨酰胺合成酶（GS）的共价修饰(腺苷酸化/去腺苷酸化),2.酶原激活不可逆共价调节消化道中的消化酶在胰脏中以酶原存在,2.酶原激活不可逆共价调节消化道中的消化酶在胰脏中以酶原,酶蛋白合成的调节,酶蛋白的合成速度通常通过一些诱导剂或阻遏剂来进行调节。凡能促使基因转录增强，从而使酶蛋白合成增加的物质就称为诱导剂；反之，则称为阻遏剂。酶的底物对酶蛋白的合成具有诱导作用；代谢终产物对酶的合成有阻遏作用。激素可以诱导关键酶的合成，也可阻遏关键酶的合成。,酶蛋白降解的调节,通过调节酶的降解速度以控制酶的活性。,3.酶含量的调节,酶蛋白合成的调节 酶蛋白的合成速度通常通过一些诱导剂或阻遏,4.同工酶的调节,具有同一底物专一性，并能催化同一种化学反应，但酶蛋白的分子结构，理化性质及免疫学性质不同的一组酶称为同工酶(isoenzyme)同工酶在体内的生理意义