第四章酶的提取与分离纯化ppt课件.ppt

第四章 酶的提取与分离纯化 The Extraction,Separation and Purification of Enzyme,酶的提取与分离纯化定义,将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。,酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取(粗提),酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crude protein):采样 均质打破细胞 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partially purified):初步的纯化，使用各种 柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。,酶分离纯化不同阶段,第一节 细胞破碎（Cell Disruption）,细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。,表4-1 细胞破碎方法及其原理,一、机械破碎法,通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法1、机械捣碎法：器械：捣碎机。常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞破碎，也可用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。,一、机械破碎法,2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常用于微生物和植物组织细胞的破碎。,一、机械破碎法,3、匀浆法 器械：匀浆器。通常用于破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞，细胞破碎程度较高，其机械切力对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。,二、物理破碎法,各种物理因素：温度、压力、声波等的作用，使组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎。,1、温度差破碎法,利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使细胞破碎。温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度下操作，以免酶失活。此法难以用于工业生产。,2、压力差破碎法,（1）高压冲击法（2）突然降压法 取决因素：a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最好使用对数生长期的细胞。,高压细胞破碎机,步骤：高渗平衡转入低渗溶液低渗溶胀破裂 适用范围：膜结合的酶、细胞间质酶等的提取无壁或壁破坏,（3）渗透压差法,3、超声波破碎法,超声波：通常人的耳朵可听到的声音频率范围为16-20kHz，频率高于20 kHz的波。其破碎机理可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。由于空化作用而使液体形成局部减压引起液体内部发生流动，旋涡生成与消失时，产生很大的压力使细胞膜破裂到达破碎细胞的效果。,JY92-II D超声波细胞粉碎机,超声波细胞粉碎机（液晶显示）,超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100150W；温度010；pH47；处理时间310 min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加12 mL缓冲液为宜。,3、超声波破碎法,超声波破碎法特点：处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失少、效果好；是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物细胞的破碎。超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。,4、反复冻融法,将待破碎的细胞放在低温下（-15-20）突然冷冻，然后在室温（或40）下缓慢地融解，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复多次。在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,5、干燥法,多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活性物质变性。,三、化学破碎法,应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破碎的方法。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物质有选择地渗透出来。,三、化学破碎法,化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作用的部位和方式有所不同。常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂,1、有机溶剂,能破坏细胞壁中的类脂。常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞外。,2、表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。表面活性剂处理法对膜结合酶特别有效。,在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂的原因：离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，引起酶的变性失活。如何除去表面活性剂？可采用凝胶层析，以免影响下一步分离纯化。,化学破碎法的优点：A、对产物释放具有一定选择性。B、细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度 低，易于固液分离和进一步提取。,化学破碎法的缺点：A、通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。B、时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50。C、有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。,四、酶促破碎法,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法。,1、自溶法（Autolysis）,将发酵液在一定pH值和适宜温度条件下保温一段时间，由于胞内自身酶系破坏细胞以释出胞内酶的方法。自溶条件：温度、pH值、离子强度等。自溶时间一般较长，不易控制，为防止其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂。还可以通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。,自溶法的缺点：易引起所需蛋白质的变性；自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降；易引起杂菌或噬菌体感染。,2、外加酶处理,根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。利用外加酶或细胞本身存在的酶也可使细胞破碎。,破坏微生物细胞壁的酶：溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶等；破坏植物细胞壁的酶：纤维素酶、半纤维素酶等。,酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶溶法的不足：1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件。,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,破碎细胞的不同分类方法,破碎细胞的不同分类方法,破碎细胞方法：动植物细胞：高速组织捣碎机 组织匀浆器 微生物细胞：机械破碎法 酶法 化学试剂法 物理破碎法等多种。,第二节 提取（Extraction）,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂：极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,第二节 提取（Extraction）,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,酶的主要提取方法,一、提取的方法,1、盐溶液提取盐溶现象：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。原因：盐浓度较低时，蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，使蛋白质与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。如：淀粉酶、蛋白酶等胞外酶可用0.14mol/L的氯化钠溶液提取注：但有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。,2、酸溶液提取,有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。如：从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可用0.12mol/L的H2SO4。提取时要注意溶液的pH值不能太低，以免使酶变性失活。胰蛋白酶：pI10.5 最适pH7.8-8.5,3、碱溶液提取,有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用碱溶液提取。注意事项:操作时要注意pH值不能过高，以免影响酶的活性。加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现局部过碱现象，引起酶的变性失活。,4、有机溶剂提取,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。,其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好。原因:丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中的溶解能力大大增加。,提示：一些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.53.0进行提取。,从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：6.8的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活 草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；选用pH2.53.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。还可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。而对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响。,二、影响酶提取的主要因素,影响因素：温度、pH、提取液体积等。影响方式：通过影响酶的溶解度及扩散速度，进而影响酶的提取速度和提取效果。,二、影响酶提取的主要因素,1、温度影响溶解度、扩散速度过高致酶失活有机溶剂提取时，控制在010,二、影响酶提取的主要因素,2、pH通过影响酶可解离基团的解离状态，影响酶溶解度注：避开等电点不宜过高或过低，以免失活,二、影响酶提取的主要因素,3、提取液的体积原料体积的35倍较好，可提取几次。4、其他影响因素颗粒体积搅拌提取时间保护剂、稳定剂（如底物）、抗氧化剂（如Vc）等。,例：甘薯叶过氧化物酶的提取及分离纯化,1、粗酶液的提取从茎尖起，摘取甘薯茎上第8至第14片叶，用蒸馏水洗净，擦干，称质量。按1：4（m/V）加入0.05mol/L pH 7.2预冷的磷酸盐缓冲液，捣碎，置4冰箱中抽提4h。在4下10000r/min离心两次，每次30min，收集上清液，即得粗酶液。,第三节 沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使溶液中某些溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离的技术过程。凡是能破坏蛋白质分子水化作用或减弱分子间同性相斥作用的因子，都有可能降低蛋白质在水中的溶解度而使它沉淀下来。,根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，沉淀分离法可分为：盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 选择性变性沉淀法 复合沉淀法 等,沉淀分离方法,沉淀分离方法,一、盐析沉淀法,定义：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。基本原理：中性盐的亲水性大于酶分子的亲水性，加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。,盐析与盐溶,盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。盐析：在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。,蛋白质和酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度有密切关系：log S=log S0 KsI 式中 S蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度（g/L）S0 酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中，无盐溶液中）的溶解度（g/L）I 离子强度 Ks盐析系数 Ks为盐析系数，它与溶质的结构，盐的价数有关。log S0是一个常数，如果用表示它，盐析方程可写为：log S Ks I Ks：盐析系数代表盐析效率，决定于盐的性质，与酶结构有关；大小与离子价数成正比，与离子半径和溶液的介电常数成反比。:主要决定于酶或蛋白的性质，在温度和pH值一定时，是常数。,与离子浓度mi、离子价数Zi有关。I1/2miZi2,离子强度I？,计算0.2 mol/L(NH4)2SO4的离子强度？,定义：由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。Ks分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法；分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下（Ks I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。,分段盐析(fractional salting out),常用的盐析剂:硫酸铵优点：盐析能力强在水中溶解度最大（25时为4.1mol/L）而温度系数最小（对温度不敏感）价格便宜浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。缺点：缓冲能力差，NH4的存在干扰蛋白质的测定，得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。,方法：固体硫酸铵加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。,注意：盐析时pH值应调节至待沉淀的酶蛋白的等电点附近，因为达到等电点pH时，蛋白质的的溶解度最小。硫酸铵浓度的表示方法：是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数。饱和度：指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。如：70ml酶液加入30ml饱和硫酸铵溶液，则混合溶液中硫酸铵的饱和度为30/(30+70)=0.3,盐析曲线的制作,用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确定。步骤：抽提液（调好pH值）离心得上清液 得到6-10个分级沉淀部分。,硫酸铵分级沉淀试验举例,批次 百分饱和 酶沉淀/%pr.沉淀/%纯化倍数 度范围/%(得率）第一次 040 4 25 4060 62 22 2.8 6080 32 32 1.0第二次 045 6 32 4570 90 38 2.4第三次 048 10 35 4865 75 25 3.0,酶在40%60%盐中沉淀比在60%80%的多；要改试45%70%。45%70%盐中收得率高，但纯度降低，要改试48%65%。从上表分析：若生物材料来源容易，主要考虑纯化倍数，选择48%65%。材料来源困难，则要考虑收得率，则选择45%70%。,二、等电点沉淀法,定义：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,三、有机溶剂沉淀法,基本原理：（1）有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。（2）由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。,分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀有机溶剂可回收、易除去，得到的沉淀易于离心分离或过滤，过滤比较容易（也可用透析袋脱有机溶剂），在生化制备中有广泛的应用。不含无机盐，不用脱盐。适用于食品工业中酶制剂的制备。,有机溶剂沉淀法的优点：,对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。,缺点：,注意事项：有机溶剂沉淀全过程必须在低温下操作，一般在0左右。因为温度越低，沉淀亦越完全。所用有机溶剂也要预冷，所得沉淀要尽快低温离心并立即用冷缓冲液溶解以降低有机溶剂浓度。pH值调至待分离酶的等电点附近有助于沉淀效果。,加入适量中性盐能增加pr.在有机溶剂中的溶解度，降低有机溶剂对pr.的变性作用，提高分级效果。但是过量加入，可引起pr.析出，影响有机溶剂的分级作用。所以有机溶剂沉淀pr.时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。,大致可认为沉淀的能力是：丙酮乙醇甲醇。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较贵，所以工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。,四、复合沉淀法（有机聚合物沉淀法）,在酶液中加入某些物质，使它与酶及其他相关蛋白形成复合物沉淀，再用适当方法使待分离酶溶解出来（选择性抽提），从而除去杂蛋白、除去沉淀剂，达到分离纯化目的。酶（蛋白质）沉淀剂（或称复合沉淀剂）：能与酶形成复合物沉淀的物质。如：聚丙烯酸、聚乙二醇、单宁等。,如：聚丙烯酸可沉淀带正电蛋白质。聚丙烯酸分子上有相当多的羧基，碱性蛋白质含较多的碱性基团，羧基和碱性基团形成盐键，则把聚丙烯酸和碱性蛋白质结合而形成很大颗粒沉淀下来。碱性蛋白质沉淀与溶液分开，在沉淀中加入钙离子后，聚丙烯酸成钙盐，蛋白质则游离出来，从而使蛋白质纯化。PAA（聚丙烯酸）E PAA-E PAA-E+Ca2 PAA-Ca E PAA-Ca H2SO4 PAA+CaSO4,五、选择性变性沉淀法,选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需酶的分离方法。热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。,表面活性剂和有机溶剂变性 不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。,选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。,第四节 离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。,运用：在酶的提取和分离过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等。,一、离心机的选择,分类：（1）按离心机转速的不同可分为：常速（低速）、高 速和超速3种（2）按用途分：工业或实验型，分析或制备型（有分析用、制备用及分析制备两用）（3）按使用温度分：常温或冷冻（4）按分离形式可分为：沉降法和过滤法两大类（5）按操作方式有间歇、连续和半连续之分（6）按结构特点则有管式、吊篮式、转鼓式和碟式等 多种。,1、常速离心机常速离心机又称低速离心机。最大转速在8000r/min以内，相对离心力(RCF)在1104g以下。在实验室和工业上广泛应用。主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，也用于粗结晶等较大颗粒的分离。,2、高速离心机转速从11042.5104r/min，相对离心力达1104105g。主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。高速冷冻离心机：为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子变性失活，有些高速离心机装设了冷冻装置。,3、超速离心机最大转速达2.51048104r/min，最大离心力达5105g。精密度相当高。为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽；为了防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统；还有一系列安全保护系统、制动系统及各种指示仪表等。,按其用途有：制备用超速离心机、分析用超速离心机以及分析制备两用离心机3种。制备用超速离心机：主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化。分析用超速离心机：可用于样品纯度的检测、沉降系数和分子量的测定。一般都装有光学检测系统、自动记录仪和数据处理系统等。,二、离心方法的选用,对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒的大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果，若样品中存在两种以上大小和密度不同的颗粒，则采用差速离心。在超速离心中，离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心等。,1、差速离心,采用不同的离心速度和离心时间，逐渐增加离心速率或低速与高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。用途：用于分离那些大小与密度相差较大的颗粒。根据沉降系数不同得以分离。,优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：（1）分离效果差，不能一次得到纯颗粒。（2）壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。（3）颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形，聚集而失活。,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀,2、密度梯度离心（速度区带离心）,是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降。离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm。,密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成，这种溶质称为梯度介质。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组分反应，而且不会引起分离组分的凝集、变性或失活（即惰性梯度介质）。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统。其梯度范围是：蔗糖浓度560，密度1.021.30 g/cm3。,密度梯度的制备：采用密度梯度混合器。密度梯度可分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。密度梯度离心常用的是：线性梯度。配制时将稀液置于贮存室B，浓液置于混合室A，两室的液面必需在同一水平上。,开动搅拌器后，同时打开阀门a和b，流出的梯度液经过导液管小心地收集在离心管中。也可把稀液置于A室，把浓液置于B室，但此时梯度液的导液管必须直插到离心管底，让后来流入的浓溶液将先流入的稀溶液顶浮起来，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。,a,b-阀门,优点：一次离心就能同时纯化不同大小的颗粒，而不必分开进行。注意事项：离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。,密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。离心时间越长，由于颗粒扩散而使区带越来越宽。适当增大离心力而缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽等现象。,A：等速度沉降,3、等密度梯度离心（平衡等密度离心）,当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。适用于分离大小相近而密度不同的样品.,B：等密度沉降,等密度梯度离心常用的铯盐，如氯化铯（CsCl）、硫酸铯（Cs2SO4）等。离心操作时，先把一定浓度的介质溶液与样品液混合物均匀，也可将一定重量的结晶铯盐加到一定量的样品液中使之溶解。然后在选用的离心力作用下，经过足够时间的离心分离，铯盐在离心场中沉降，自动形成密度梯度。,等密度离心的特点：（1）离心过程很长；（2）不需粘性介质；（3）颗粒的最终分布与其大小和质量无关，只受其浮力密度影响；（4）样品可以和整个梯度相混合；（5）样品装载容积比密度梯度离心大。,三、离心条件的确定,1、离心力 离心分离是借助于离心机产生的离心力。离心力的数据是指其平均值，即在离心溶液中点颗粒所受离心力。,Fc=m ac m：颗粒质量，ac离心加速度：转子角速度（rad/s）;r=旋转半径 n:转子每分钟转数(r/min)高速离心需用：相对离心力（RCF）,离心力：,相对离心力：指颗粒所受的离心力与地心引力（重力）之比。RCF=Fc/Fg=mac/mg=g:重力加速度；Fg：地心引力（重力）如：超速离心机的转速为60000 r/min（即1000 r/s），转轴中心至离心管中心的距离为6 cm。则：RCF为：2.4105g，比重力大24万倍。,只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。,三者关系列线图,2、离心时间：依据离心方法的不同概念有所差别对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间；对等密度梯度离心而言,是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间；对密度梯度离心所需的时间则是指形成界限分明的区带的时间。沉降时间决定于颗粒沉降速度和沉降距离。,沉降时间：,颗粒沉降时间：指颗粒从离心样品液面完全沉降到离心管底所需时间。决定因素：颗粒沉降速度、沉降距离t：沉降时间（s）S：颗粒沉降系数（s）：转子角速度（rad/s）r1：样品液面 旋转轴中心；r2：离心管底 旋转轴中心,转子效率因子K，K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。生产厂家已在转子出厂时标出最大转速时的K 值，可根据：算出其它转速的K 值。原则上，K系数愈小的，愈容易、愈快将粒子沉降。整理为：,1/S,当S、r1、r2确定后，2t是一常数，即在离心机及转子定下后，r1、r2不变，对某种物质颗粒S也是确定的，对颗粒沉降起决定作用的是转子的转速和沉降时间t。例1：在离心机及转子定下后，10000 r/min离心10 min，计算若用5000 r/min需离心的时间：？40 min,对不知其沉降系数的球形颗粒，可根据下式估算沉降时间：,T：沉降时间(S)；：介质溶液的粘度(P)；、0分别为颗粒和介质溶液的密度(g/cm);d：颗粒平均直径(cm);r2、r1：旋转轴中心到离心管底和液面的距离(cm),3、温度和pH值离心温度一般控制在4左右，对于某些热稳定性较好的酶等，离心也可在室温下进行。但在超速离心和高速离心时，转子高速旋转会发热，从而引起温度升高。故必须采用冷冻系统。离心介质溶液的pH值应该是处于酶稳定的pH范围，必要时可采用缓冲液。过酸或过碱还可能引起转子和离心机的其它部件的腐蚀，应尽量避免。,例：甘薯叶过氧化物酶的提取及分离纯化,2.硫酸铵分级沉淀往粗酶液中边搅拌边加入研磨后的硫酸铵至20%饱和度，25下盐析2h，离心除杂蛋白；再加硫酸铵至80%饱和度，25下盐析2h，离心，收集沉淀；加入提取缓冲液至沉淀充分溶解为止；将溶液进行超滤脱盐，得到初步纯化的POD酶液。,第六节 过滤和膜分离,过滤：借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。过滤介质：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。分类：膜过滤（膜分离技术）与非膜过滤,一、非膜过滤,采用高分子膜以外的材料，如：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术。包括粗滤和微滤。,（一）粗滤,粗滤：借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2 m的大颗粒，而使固液分离的技术。助滤剂：为了加快过滤速度，提高分离效果。如：硅藻土、活性炭等。根据推动力产生的条件不同，过滤可分为常压过滤、加压过滤和减压过滤。,1、常压过滤以液位差为推动力。过滤装置竖直安装，悬浮液置于过滤介质的上方，由于存在液位差，在重力的作用下，滤出液通过过滤介质流向下方，大颗粒物质被截留在介质表面。优点：常压过滤设备简单，操作方便易行。缺点：过滤速度较慢，分离效果较差，难以大规模连续使用。,吊袋离心机,2、加压过滤以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。在生产中常用的各种压滤机；还可采用添加助滤剂，降低悬浮液粘度和适当提高温度等措施。特点：设备比较简单，过滤速度较快，效果较好，在生产中广泛使用。,压滤机,3、减压过滤又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。需要配备有抽真空系统，而且压力差最高不超过0.1Mpa，故多用于粘性不大的物料的过滤分离。,真空抽滤机,（二）微滤,截留物质颗粒直径为0.22 m。主要用于分离细菌、灰尘等光学显微镜可看到的物质颗粒。在无菌水、软饮料、矿泉水等的生产中广泛运用。,二、膜分离技术,借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离分为3大类：加压膜分离、电场膜分离、扩散膜分离,1、加压膜分离,以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差的作用下，小于孔径的物质颗粒穿过膜孔，而大于孔径的颗粒被截留。根据所截留的颗粒大小的不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透。,（1）微滤：是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。截留物质颗粒直径为0.22m。主要用于分离细菌、灰尘等光学显微镜可看到的物质颗粒。在无菌水、软饮料、矿泉水等的生产中广泛运用。,微滤膜,（2）超滤是借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。截留的颗粒直径从202000（0.0020.2m），相当于分子量10005105 Da。主要用于分离病毒和各种生物大分子。,超滤膜,超滤膜剖面及工作原理,超滤膜净水原理流程图,杯式超滤器（内置悬挂搅拌子）,超滤过程中，小分子物质与溶剂（一般是水）分子一同透过膜孔渗出。不同孔径的膜有不同的透过性。膜的透过性一般以流率表示。流率是指每平方厘米的膜每分钟透过的流体的量，以mL/(cm2min)表示。,影响超滤流率的因素：主要因素是膜孔径的大小；溶液中颗粒的形状与大小不同，其超滤流率也不同，一般说来，相对密度小的分子透过性较好，球状分子比相同分子量的纤维状分子透过性好，小分子比大分子的透过性好；溶液浓度越高，超滤流率越小；,操作压力对超滤流率的影响比较复杂。一般情况下，压力增加时，超滤的流率增加，但对于一些胶体溶液，当压力高到一定程度后，再增加压力，超滤流率不再增加；对于一般溶质分子而言，压力增加时，其透过性降低。但某些溶质分子可随着压力增加而提高其透过性。超滤时的操作压力一般控制在50700KPa。适当提高温度，增加搅拌速度等都有利于提高超滤流率。但温度和搅拌速度不能过高，以免引起酶和其它活性大分子变性失活。,（3）反渗透在渗透实验装置的膜两侧造成一个压力差，并使其大于渗透压，就会发生溶剂倒流，使得浓度较高的溶液进一步浓缩。反渗透孔径小于20，被截留物质分子量小于1000Da，操作压力为0.7-13 MPa。主要用于分离各种离子和小分子物质。,渗透：是一种物理现象，当两种含有不同盐类浓度的溶液用一张半透膜隔开时会发现，含盐量少的一边的溶剂会自发地向含盐量高的一侧流动的过程。渗透压：渗透直到两侧的液位差（即压力差）达到一个定值时，渗透停止，此时的压力差即为渗透压。渗透压只与溶液的种类、盐浓度和温度有关，而与半透膜无关。,过滤的分类及其特性,2、电场膜分离,电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。,（1）电渗析用两块半透膜将渗析槽分隔成3个室，两块膜之间的中心室通入待分离的溶液，在两侧的室中装入水或缓冲液，并分别装上正、负电极。接通直流电源后，中心室溶液中的阳离子向阴极移动，透过半透膜到达阴极槽，而阴离子则移向阳极槽，从而达到分离。电渗析主要用于酶液或其它溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备及其他带电荷的小分子的分离。,（2）离子交换膜电渗析以离子交换膜代替一般的半透膜。在电场中交替装配的阴离子和阳离子交换膜，在电场中形成一个个隔室，使溶液中的离子有选择地分离或富集，这就是离子交换电渗析。离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强，（1）由于膜的孔径大小不同，只让小于孔径的颗粒透过，而把大于孔径的物质截留；（2）由于膜上带有某种基团，根据同性电荷相斥，异性电荷相吸的原理，只让带异性电荷的颗粒透过，而把同性电荷的物质截留。,在直流电场的作用下，由于离子交换的阻隔作用，实现溶液的淡化和浓缩，分离推动力是静电引力。,电渗析器：利用离子交换膜的选择透过性进行工作，主要组成部分是离子交换膜。分为阳膜、阴膜。阳膜只允许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只允许阴离子通过而阳离子被阻挡。,3、扩散膜分离,利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外，而大分子被截留，从而达到分离的效果（透析）。膜材：动物膜、羊皮纸、火棉胶等制成常见：透析袋、透析管、透析槽主要用途：用于酶等生物大分子的分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。,透析袋,例：甘薯叶过氧化物酶的提取及分离纯化,2.硫酸铵分级沉淀往粗酶液中边搅拌边加入研磨后的硫酸铵至20%饱和度，25下盐析2h，离心除杂蛋白；再加硫酸铵至80%饱和度，25下盐析2h，离心，收集沉淀；加入提取缓冲液至沉淀充分溶解为止；将溶液进行超滤脱盐，得到初步纯化的POD酶液。,第六节 层析分离（chromatography）,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,层析分离方法,上海沪西 MC99-2 自动液相色谱分离层析仪,组合式含：核酸蛋白检测仪；恒流泵；自动部份收集器；梯度混合器。系统配置：XWT-S台式记录仪1台；层 析 柱：1.040，1.650，2.560各一支 波 长：254，280nm；定时范围：1秒-100分流 量：1-80ml/m；收集容量：12ml100给出梯度：1000ml，梯度形状可直线,AKTATM prime蛋白质纯化系统,专为实验室规模的蛋白质简易纯化而设计的采用简易模板编程，操作容易自动系统清洗，缓冲液和样品选择自动上样在线紫外电导检测自动