第二章5基因工程重组DNA导入受体细胞ppt课件.ppt

第三部分,重组,DNA,导入受体细胞,?,一、受体细胞,?,二、选择受体细胞的基本原则,?,三、重组,DNA,导入受体细胞的方法,1,、转化概念,转化,：,DNA,重组分子在体外构建完成后，必须导入,特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因,或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为,重组,DNA,分子的转化（,Transformation,）。,重组,DNA,人工导入受体细胞有许多方法，包括,转化、,转染、接合,以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔,和显微注射等，这些导入方法在,DNA,重组技术中统,称为转化操作。,一、重组,DNA,转化,感受态：,受体细胞最易接受外源,DNA,片段而实现转,化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其,吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，,而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的,遗传特性、,菌龄、生理培养条件,等诸多因素的影响。,2,、细菌转化的步骤：,?,感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋,白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。,感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感,受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某,些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）,的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞,膜上的,DNA,结合蛋白和核酸酶等。,?,转化因子的结合。受体菌细胞膜上的,DNA,结合蛋,白可与转化因子的双链,DNA,结构特异性结合，单链,DNA,或,RNA,双链,RNA,以及,DNA/RNA,杂合双链都不能结,合在膜上。,?,转化因子的吸收。双链,DNA,分子与结合蛋白,作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而,另一条链则被吸收到受体菌中。,?,整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链,DNA,与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复,合物前体结构，它能有效地保护单链,DNA,免受各,种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色,体,DNA,处。,?,转化因子单链,DNA,的整合。供体单链,DNA,片段通,过同源重组，置换受体染色体,DNA,的同源区域，,形成异源杂合双链,DNA,结构。,二、受体细胞,?,受体细胞,(receptor cell),：,又称为宿主细胞,(host,cell),，是指能摄取外源,DNA,并使其稳定维持的细胞,?,感受态,(competence),：,是指细菌吸收外源,DNA,的,生理状态。,?,感受态细胞,(competence cell),：,是指具有接受外,源,DNA,能力的细胞。,1,、原核生物细胞的优点,?,大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细,胞壁，便于外源,DNA,的进入。,?,没有核膜，染色体,DNA,没有固定结合的蛋白质，,这为外源,DNA,与裸露的染色体,DNA,重组减少了麻烦,?,基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于,对引入的外源基因进行遗传分析。,?,原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性,的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周,期短，重复实验快。,?,原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性,系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也,多是无特异性空间结构的多肽链。,?,原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，,而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧,链的糖基化或磷酸化等修饰作用。,?,原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正,确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。,2,、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：,3,、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆,菌、蓝细菌等。,大肠杆菌受体细胞,?,大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得,最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也,是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载,体受体系统。,?,优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。,?,缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素,可导致人体热原反应。,枯草杆菌受体细胞,枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。,优点：,?,枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产,物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和,加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋,白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。,?,枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工,程菌。,?,枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。,?,枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子,遗传学背景清楚等优点。,?,应用：已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素乙型,肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒,VPI,抗原等。,蓝细菌（蓝藻）,蓝藻,又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素,a(,缺乏叶绿素,b),和藻胆素，具有光合系统(PS),和光合系统(PS)、能进行光合作用，但它又,具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞,器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。,蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植,物的优点，具体表现在：,?,基因组为原核型，除了裸露的染色体,DNA,外，不,含叶绿体,DNA,和线粒体,DNA,，遗传背景简单，便于,基因操作和外源,DNA,的检测。,?,细胞壁属,G,-,，主要由肽聚糖组成，便于外源,DNA,的转化。,?,营光合自养生长，培养条件简单，只需光、,CO2,、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需,要。,?,多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提,供了极好的条件。,?,蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用,作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，,把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到,锦上添花的效果。,4,、真核生物细胞,真菌受体细胞,真菌是低等的真核生物，其基因结构、表,达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具,有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表,达高等动植物基因具有原核生物细胞无法,比拟的优点。,酵母菌,酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点,?,酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达,调控机理比较清楚,遗传操作相对较为简单。,?,具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。,?,不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属,(,如酿酒酵母,),在仪器工业中有着几百年的应用历史，,属于安全型基因工程受体系统。,?,培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。,?,能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物,的提取和加工等。,动物细胞,?,常用的动物受体细胞有,Hela,细胞、猴肾细胞和,中国仓鼠巢细胞,(CHO),等。,?,哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：,?,能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接,加工成成熟的,RNA,。,?,真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修,饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细,胞,16-20,倍。,?,易被重组,DNA,质粒转染,具有遗传稳定性和可重,复性。,?,经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基,中，便于提纯和加工，成本低。,?,缺点是,:,组织培养技术要求高，如培养和筛选,一个高度扩增的转化子,CHO,细胞，通常需要数月,之久,难度较大。,?,目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、,牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用,途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或,动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基,因治疗等。,?,常用的动物受体细胞有小鼠,L,细胞、,Hele,细胞,猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞,(CHO),等。以动物,细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点,植物受体细胞,?,优点：全能性，,即一个分离的活细胞在合适,的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味,着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳,定遗传的植株或品系。,?,缺点：,植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细,胞壁，不利于摄取重组,DNA,分子。,?,现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、,玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模,式植物。,5,、选择受体细胞的基本原则,?,便于重组,DNA,分子的导入。,?,便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的,选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易,于对重组体进行筛选。,?,遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高,密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物,细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应,性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清,培养基中进行培养。,?,受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋,白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细,胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。,?,安全性高，无致病性，不会对外界环境造,成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞,或营养缺陷型细胞作为受体细胞。,?,能使重组,DNA,分子稳定存在于细胞中。从受体细,胞的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰,改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受,体细胞就可以避免其对重组,DNA,分子的降解破坏,作用。,?,受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。,?,具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基,因的高效表达。,?,在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。,6,、受体细胞应具备的条件,野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具,有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性,因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行,遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株,通常应从以下几个方面加以考虑：,从安全性考虑，应具备以下条件：,?,不适合在人体内生存,?,不适合在非培养条件下生存,?,在非培养条件下，其,DNA,容易解体,?,它的,DNA,不易转移,?,它的质粒只在这一宿主由复制,?,便于检测,从遗传性考虑：,?,重组缺陷型,recA,，,用于基因扩增或高效表达的,受体细胞（,recA,-,）,?,限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免,对外源,DNA,的除解。外切酶和内切酶活性缺陷,（,recB,-,，,recC,-,，,hsdR,-,）,?,与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与,载体选择标记互补的表型）,?,具有较高的转化效率,限制缺陷型,?,这是导致外源重组,DNA,转化或转导效率低下的主要,原因之一。,?,应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞,，以提高外源,DNA,分子的转化或转导效率。,?,进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既,不能修饰，也不能限制外源,DNA,分子，更便于重组,DNA,分子的多种基因操作。,?,大肠杆菌的限制系统主要由,hsdR,基因编码，因,此具有,hsdR,-,遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了,降解外源,DNA,的能力，同时大大增加了外源,DNA,的,可转化性。,重组缺陷型,?,进入野生型细胞的外源,DNA,分子能自发地与染色体,DNA,发生的体内同源重组反应由,rec,基因家族的编码产物所控,制。,RecA,蛋白能促进,DNA,分子之间的同源联会和,DNA,单链,交换，,recA,基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频,率降低至,10,6,。,?,大肠杆菌的,recB,、,recC,和,recD,基因分别编码不同,分子量的多肽链，三者构成一个在同源重组中的统一功,能单位,RecBCD,蛋白（核酸酶,V,），它具有依赖于,ATP,的双链,DNA,外切酶和单链,DNA,内切酶双重活性。,recB,、,recC,和,recD,基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率,?,因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型,基因型为,recA,-,、,recB,-,或,recC,-,等，有些大肠杆菌突变体,菌株则将三个基因同时失活。,转化亲和型,?,可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞,壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从,而提高其转化效率。还可以选择能够诱,导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细,胞。,遗传互补型,?,遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是,使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的,遗传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。,?,如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有,AMP,抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这,种抗生素敏感。当重组,DNA,分子转入受体细胞后,载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特,征，据此可以区分转化子与非转化子。,?,如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补,的遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转,化细胞。,感染寄生缺陷型,?,相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有,感染和寄生效应，重组,DNA,分子导入这些细,菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生,作用，进入生物体内，并广泛围传播，,?,如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一,场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞,不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手,段制造生物武器不在此例。,三、重组,DNA,导入受体细胞的方法,?,转化,(transformation):,指感受态的大肠杆菌细胞捕,获质粒,DNA,或以它为载体构建的重组质粒,DNA,分,子的过程。,?,转化子,(transformant),：,经转化获得外源遗传物质,的细胞。,?,转染,(transfection):,指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬,菌体或以它为载体构建的重组,DNA,分子的过程,?,转导,(transduction):,指病毒转移真核细胞,DNA,的过,程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。,?,基因导入受体细胞方法,?,根据转移基因方法特性可分为：,?,转化,(transformation),?,转导,(transduction),?,转染,(transfection),?,微注射技术,(microinjection),?,电转化法,(electroporation),?,基因枪技术,(geneblaster),?,脂质体介导法,(liposome mediated transfer),根据转移基因载体与受体的特性可分为：,?,质粒载体导入受体细胞的方法：,CaCl,2,、电转化,法等。,?,噬菌体转染细胞的方法：,体外包装感染法等。,?,DNA,导入酵母菌的方法：,原生质体转化、电穿孔,转化法等。,?,DNA,导入植物细胞的方法：,Ti,质粒叶盘法、电穿,孔转化法、基因枪法等。,?,DNA,导入昆虫细胞的方法：,杆状病毒感染法等。,?,DNA,导入哺乳动物细胞的方法：,磷酸钙共沉淀法、,电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等,1,、氯化钙转化法,?,大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难,进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困,难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞,的正是根据人们需要构建的外源重组质粒,DNA,分子,而非来自供体菌的游离,DNA,片段,(,转化因子,),。,?,因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转,化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制,备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性,的方法之一是,Ca,2+,诱导的大肠杆菌转化法。,?,1970,年,M.Mandel,和,A.Hige,发现,大肠杆菌,经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收噬菌体,DNA,。,1972,年美国斯坦,福大学,S.Cohen,报道,经氯化钙处理大肠,杆菌细胞也能摄取质粒,DNA,。,Ca,2+,诱导转化原理：,?,在,0,的,Cacl,2,低渗溶液中，细菌细胞发生膨,胀，同时,Cacl,2,使细胞膜磷脂层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离,开来，诱导大肠杆菌形成感受态。,?,Ca,2+,能与加入的,DNA,分子结合，形成抗,DNA,酶,(DNase),的羟基,-,磷酸钙复合物，并黏附在细菌,细胞膜的外表面上。当,42,热刺激短暂处理细,菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，,并随之出现许多间隙，为,DNA,分子提供了进入,细胞的通道。,?,Mg,2+,对,DNA,分子有很大的稳定性作用，因此利用,Mgcl,2,与,Cacl,2,共同处理大肠杆菌细胞，可以提高,DNA,的转化效率。如利用二甲基亚砜,(DMSO),和二,硫苏糖醇,(DDT),等进一步处理细胞，能诱导高频,感受态细胞的形成，转化效率可提高,100,1000,倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。,?,但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，,通常很少采用。,?,该法重复性好。操作简便快捷，适用于成,批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行,转化如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋,质粒,DNA,可得,5,10,7,1,10,9,个转化子。,大肠杆菌感受态细胞的制备：,?,100ml,菌体培养至,OD,600,=0.5,，离心收集菌体。,?,用,10 ml,冰冷的,75 mM CaCl,2,溶液悬浮菌体，离,心收集菌体。,?,用,1 ml,冰冷的,75 mM CaCl,2,溶液悬浮菌体。,?,冰浴放置,12-24,小时，备用,。,?,取,100,ml,感受态细胞，加入相当于,50,ng,载体的,重组,DNA,连接液，混匀。,?,冰浴放置半小时。,?,在42保温,1.5,分钟（热脉冲）。,?,快速将转化细胞转移至冰浴中放置,1,2,分钟。,?,加入,1 ml,新鲜培养基，于,37,培养,1,小,时（扩增）。,?,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。,?,获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：,?,用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，,一般在,A600,为,0.4,左右为好。,?,制备受体细胞的整个过程要在,0,4进行，并尽,量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照,的受体菌应该在此培养基上不生长。,?,为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如,FSB,溶液。,CaCl2,法制备感受态细胞转化,DNA,时，低温的主要,目的是,:,（,1,）抑制细胞的旺盛生理代谢。,（,2,）有助于,DNA-Ca2+,吸附于细胞表面。,（,3,）防止,DNAase,降解,DNA,。,热休克温度是42。目的是使细胞摄入吸附于其,表面的,DNA,。,转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转,化子的出现，因此须设以下几种对照处理：,?,DNA,对照处理。转化处理液中用,0.2ml,无菌水代替,0.2m1,感受态细胞，检验,DNA,溶液是否染菌。,?,感受态细胞对照处理。转化处理液中用,0.1mlNTE,缓冲液,(500mM NaCl,，,10mM Tris-HCl,，,1mMEDTA,pH8.0),代替,0.1m1DNA,溶液，检验感受态细胞是否染,菌。,?,感受态细胞有效性对照处理。在,0.2ml,感受态细,胞中加入,0.1ml,已知容易转化这种感受态细胞的质,粒,DNA,。,2,、,PEG,介导的细菌原生质体转化,?,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外,源,DNA,的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采,用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移,质粒或重组,DNA,分子,。,?,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转,化。,?,PEG,是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部,位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互,接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之,间发生融合。,细菌原生质体的制备：,?,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌,为例：细菌需生长在,高渗培养基,中（如,34%,的蔗糖,溶液），并加入,甘氨酸,以增加细菌细胞壁对溶菌酶,的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在,10.3%,的蔗糖等渗溶液,中。与原生质体接触的所有,器皿应保持,无水无去污剂,。,细菌原生质体的转化：,?,取,0.2-1ml,的原生质体悬浮液（,10,8,-10,9,个原生质,体），加入,10-20,m,l DNA,重组连接液，同时加,入含有,PEG1000,和,Ca,2+,的等渗溶液，混匀。,细菌原生质体的再生：,?,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞,壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨,酸和微量元素。,3,、电转化,电转化又称电穿孔法,(electroporation):,?,是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜,上形成纳米大小的微孔，,DNA,直接通过这些微孔或,者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通,过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。,?,最早用于将,DNA,导入真核细胞,1988,年,Dower,等人成,功应用于大肠杆菌的转化。,基本原理是利用高压电,脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成,可逆的瞬间通道,从而促进外源,DNA,的有效吸收。,?,将待转化的质粒或,DNA,重组连接液加在电穿孔转,化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场,的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或,DNA,重组分子便可进入细胞内。,?,电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁,结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。,?,电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时,间和外源,DNA,浓度等参数的影响，通过优化,这些参数，每,g DNA,可以得到,10,9,10,10,转,化子。,?,电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将,会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的,降低，转化效率的提高也因此被抵消。,?,用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞,的制备容易得多当细菌生长到对数中期后予,以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降,低细胞悬浮液的离子强度，并用,10,甘油重悬,细胞，使其细胞浓度为,3,l0,10,个,m1,。分装，,在干冰上速冻后置于,-,70 贮存。这样，每,小份细胞融解后即可用于转化，有效期达,6,个,月以上。,?,电穿孔转化须在低温下,(0-,4)进行，转化效,率要比在室温下操作提高约,100,倍。,4,、接合转化：,?,接合（,Conjugation,）：,指通过细菌细胞之间,的直接接触导致,DNA,从一个细胞转移至另一,个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成,的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效,接触的接合功能以及诱导,DNA,分子传递的转移,功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码,?,是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种,DNA,转化方式适用于那些难以采用,Ca,2+,诱导转化,法或电穿孔法转化的受体菌。,?,非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体,系所须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿,主细胞间自我转移。但如果宿主细胞中存在另外,一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒）非接合,型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质,粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用,?,接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，,转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频,转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前,常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了,接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，,故重组质粒,DNA,分子也不能直接接进行接合转,化。而只能通过其迁移作用来完成。,?,首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至,含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供,体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生,接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。,?,整个接合转化过程涉及到,3,种有关的细菌菌株,即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒,DNA,的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅,助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。,5,、重组噬菌体,DNA,分子转导大肠杆菌,?,转染：,将重组噬菌体,DNA,分子直接导入受体,细胞中的过程，称为转染。,?,将重组噬菌体,DNA,分子导入大肠杆菌受体细,胞的常规方法是转导操作。,?,转导,(transduction),：,指通过噬菌体,(,病毒,),颗粒感染宿主细胞的途径把外源,DNA,分子转移,到受体细胞内的过程。,?,具有感染能力的噬菌体颗粒除含有噬菌,体,DNA,分子外，还包括外被蛋白。,?,以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重,组噬菌体,DNA,分子进行体外包装,。,?,体外包装，是指在体外模拟噬菌体,DNA,分子,在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应,过程，将重组噬菌体,DNA,分子包装为成熟的,具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。,?,基本原理：,根据噬菌体,DNA,体内包装的途径,分别获得缺失,D,包装蛋白的噬菌体突变株和,缺失,E,包装蛋白的噬菌体突变株。这两种突,变株均不能单独地包装噬菌体,DNA,，但将它,们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失,D,蛋白的,包装物（含,E,蛋白,),和缺失,E,蛋白的包装物,(,含,D,蛋白,),，两者混合后就能包装噬菌体,DNA,。,噬菌体,DNA,体外包装的主要过程,?,制备包装物。,?,须培养两种溶原菌,?,诱导溶菌生长,?,收集和贮存包装物。,?,体外包装。,?,制备噬菌体,DNA,混合液。,?,第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出,包装物可立即用于包装。,?,第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率,2,5,倍,，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应,的进行。,?,去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入,SM,溶液,（,噬,菌,体,稀,释,缓,冲,液,：,100,mmol/L,NaCl,10,mmol/L,MgSO,4,50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)0.2%,明胶和氯仿，混,匀后离心去除碎屑。上清液中含活的噬菌体颗粒。,?,经过体外包装的噬菌体颗粒可以感染适当的受,体菌细胞，并将重组噬菌体,DNA,分子高效导,入细胞中。,?,在良好的体外包装反应条件下，每,g,野生型,的噬菌体,DNA,可形成,10,8,10,9,的,pfu,。对于重,组的噬菌体,DNA,，包装后的成斑率要比野生,型的有所下降，但仍可达到,10,6,10,7,pfu,，完全,可以满足构建真核基因组基因文库的要求。,6,、转化率的计算及其影响因素,?,转化率：指,DNA,分子转化受体菌获得转化子的,效率。转化率是衡量转化效率的重要指标，有,两种表示方式：,?,一是在待转化,DNA,分子数大于受体细胞数的,条件下，转化细胞与细胞总数之比。,?,二是在受体细胞数相对于待转化,DNA,分子,数大大过量时，每微克,DNA,转化所产生的,克隆数。也可表征为每微克,DNA,进入受体,细胞的分子数,影响转化率的因素,载体及重组,DNA,方面,?,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其,转化率不同。分子质量较小的重组质粒,DNA,分子转化率较,高，分子质量较大的重组质粒,DNA,分子转化率较低，对于,大于,30kb,的重组质粒则很难进行转化。,?,载体的空间构象：,与受体细胞亲和性较强的质粒载体转,化率要高于亲和性较弱的质粒载体。质粒的超螺旋构象转,化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢,复，一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。,?,插入片段大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化,效率越低。,?,重组,DNA,分子的浓度和纯度：,在,10ng,100u1,以下的,DNA,浓,度范围内，转化效率与,DNA,分子数成正比关系。,受体细胞方面：,?,受体细胞必须与载体相匹配，如：,pBR322,转化大肠杆菌,JM83,株，转化率很低；但对大肠杆菌,ED8767,株的转化率则,较高。,转化操作方面：,?,受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大,对于,Ca,2+,诱导的完整细胞转化而言，菌龄、,CaCl,2,处理时间,感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，,其中感受态细胞通常在,12-24,小时内转化率最高，之后转,化率急剧下降。对于原生质体转化而言，再生率的高低直,接影响转化率，而原生质体的再生率又受诸多因素的制约,在一次转化实验中，,DNA,分子数与受体细胞数的比例对转化,率也有影响。,?,电穿孔转化法中，对受体细胞进行冰冻甘油预处理后的转,化率，要比不经此预处理的转化率高,10-100,倍。,?,同一重组质粒,DNA,分子转化不同的受体菌细胞，转化率,不同,受体细胞的选择对于重组,DNA,分子的转化也是,极为重要。,?,受体细胞的预处理：影响最大,?,供受体的比例：,?,Ca,2+,诱导转化,0.1 ml,感受态细胞,50 ng DNA,?,原生质体转化,10,9,个原生质体,50 ng DNA,提高转化效率的几个重要因素：,细胞生长状态和密度,?,不要用经过多次转接或储于的培养菌，最,好从,-70,或,-20,甘油保存的菌种中直接转接用,于制备感受态细胞的菌液。,?,细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可,通过监测培养液的,OD,600,来控制。,DH5,菌株的,OD,600,为,0.5,时，细胞密度在,5,10,7,个,/ml,左右,(,不同的菌,株情况有所不同,),，这时比较合适。密度过高或不,足均会影响转化效率。,质粒的质量和浓度,:,?,用于转化的质粒,DNA,应主要是超螺旋,DNA(cccDNA),?,转化效率与外源,DNA,浓度在一定范围内成正比，,但当加入的外源,DNA,量过多或体积过大时，转化效,率就会降低。,?,1ng,的,cccDNA,即可使,50,l的感受态细胞达到饱,和。一般情况下，,DNA,溶液的体积不应超过感受态,细胞体积的,5,。,试剂的质量,所用的试剂，如,CaCl,2,等均需是最高纯度的，并,用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好,分装保存于干燥的冷暗处（冰箱,4,）。,防止杂菌和杂,DNA,的污染,整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，,如离心管,枪头等最好是新的，并经高压灭菌处,理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试,剂、,DNA,酶或杂,DNA,所污染，否则均会影响转化效,率或杂,DNA,的转入，为以后的筛选和鉴定带来不,必要的麻烦。,扩增操作,转化细胞的扩增操作：,指转化完成之后细胞的短时,间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联,在一起，如：,?,Ca,2+,诱导转化后的,37,培养一个小时,?,原生质体转化后的再生过程,?,噬菌体转染后的,30,培养等，均属扩增操作,扩增操作的目的,?,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于,筛选程序。,?,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。,?,表达外源基因，便于筛选和鉴定。,四、转化细胞的扩增,五、外源基因导入真核细胞的方法,1,重组,DNA,分子导入酵母细胞：,利用酵母的原生质球进行转化,?,首先，酶解酵母细胞壁，产生原生质球，再将原,生质球置于,DNA,、,CaCl,2,和多聚醇,(,如聚乙二醇,),中,多聚醇可使细胞壁具有穿透性，并允许,DNA,进入,然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使其再生新的,细胞壁。,2,、重组,DNA,分子导入哺乳动物细胞,病毒颗粒转导法,?,病毒种类多样及病毒,DNA,或,RNA,构建的载体性质的各异，,所以转导的过程各不相同，主要有三种类型：,?,一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目,的基因随同病毒,DNA,分子整合到受体细胞染色体,DNA,上,这样以后不需要再包装成病毒颗粒。,?,二，带有目的基因的毒病是缺陷性的，须同另一辅助,病毒一起感染受体细胞在受体细胞内包装成新的病,毒颗粒。,?,三，虽然带目的基因的,SV40,病毒是早期转录缺陷型的,但被感染的,COS,细胞系的基因组中整合有,SV40,早期转,录区段,DNA,，所以没有必要用辅助病毒作混合感染。,磷酸钙,-DNA,共沉淀法,?,是指外源基因与磷酸钙混合形成磷酸钙,-DNA,共,沉淀物，可使,DNA,附在细胞表面，通过细胞吞,入摄取或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进,入细胞内，这种转染方法称为磷酸钙,-DNA,共,沉淀法。,?,其依据是哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面,的,DNA-,磷酸钙沉淀物，使,DNA,转入细胞。,?,进入细胞的,DNA,仅有,1%,5%,可以进入细胞核中，其,中仅有不到,1%,的,DNA,可以与细胞,DNA,整合，在细胞中,进行稳定表达，基因转导频率大约为,10,-4,，这项技,术能用于任何,DNA,导入哺乳类动物进行暂时性表达,或长期转化的研究。,?,DNA,磷酸钙共沉淀复合物中,DNA,的数量、共沉淀物,与细胞接触的保温时间、以及,DMSO,和甘油等促进因,子作用的持续时间均会影响,DNA,的转染效率。,?,此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法,DEAE-,葡聚糖转染法,?,二乙胺乙基葡聚糖,(DEAE),是一种高分子质量的,多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外,源,DNA,，实现短时间的有效表达。,?,目前有关,DEAE-,葡聚糖的作用机制一般认为,DEAE-,葡聚糖能与外源,DNA,形成复合物，保护,DNA,免受核酸酶的降解；其次是,DEAE-,葡聚糖可,作用于受体细胞膜，增加其通透性，便于,DNA,进入。,?,此方法简单、重复性高，并且转染效率高于磷,酸钙法。,DEAE-dextran,转染主要有两种不同的方法：,?,一种是先使,DNA,直接同,DEAE-dextran,混合，,形成,DNA,DEAE-dextran,复合物后，再用来处,理细胞。,?,另一种是受体细胞先用,DEAE,dextran,溶液,预处理，然后再用来与转染的,DNA,接触。,聚阳离子,-DMSO,转染法,?,采用聚阳离子,poly-brene,处理哺乳动物细,胞，增加细胞表面对,DNA,的吸附能力、然后,再用,25,-30,DMSO,短暂处理细胞，增加膜,的通透性，提高对,DNA,的捕获量。,显微注射转基因技术,?,微注射技术：一般是用微吸管吸取供体,DNA,溶液，,在高倍倒置显微镜下准确地插入受体细胞核中，,并将,DNA,注射进去。常用于转基因动物研究,?,用此方法转基因的效率很高。获得稳定转化子的,数量取决于注射的,DNA,的性质。,显微注射法其技术关键：,?,理想外源基因的制备。这种基因可处于质粒,上，但注射前质粒已经酶切而线性化。有的,载体,DNA,会干扰外源基因的表达，因此注射,前，需要先从载体上将它们切下。,?,收集受精卵。在受孕后的几小时内，父母双,方的遗传物质还未结合前，从供体动物中取,出单细胞的受精卵。,?,显微注射。利用极细的毛细玻璃管,(,外径为,0.5-1um),，将理想的遗传物质注入受精卵的,雄原核。这必须在父母双方遗传物质融合前,的,4h,间歇期内完成。当双亲染色体相遇后，,注入的理想基因有可能整合到染色体上。,?,在几次细胞分裂后，将带有理想基因的受精,卵移入母体，使受精卵孕育。,脂质体导入法,?,脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成,的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜,从而形成一种囊状物被称为脂质体。,?,脂质体导入法,:,将,DNA,或,RNA,包囊于脂质体内，然,后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细,胞,这种转染方法称为脂质体导入法。,?,脂质体介导转染的机制,?,阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸,根通过静电作用将,DNA,分子包裹人内，形成,DNA,一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸,附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔,也通过直接渗透作用,将,DNA,传递进入细胞，形,成包涵体或进入溶酶体,其中一小部分,DNA,能从,包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入,核内转录、表达。,?,利用脂质体介导法将外源,DNA,导入哺乳动物细,胞具有实用潜力。,?,由于脂质体具有无毒、无免疫原性的特点，不,仅可用于体外受体细胞的基因转化，而且可以在,动物体内将基因转入肝细胞、血管内皮细胞等靶,细胞或靶组织、靶器官位点，实现瞬间表达或稳,定表达，成为基因治疗的一种有效工具。,基因枪法,?,基因枪法,(,又称粒子轰击法,),?,用高压气体加速把粘有,DNA,的细微金粉,(,或钨粉,颗粒,),打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质,等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方法,?,基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细,菌及小动物等。用这种方法，已将,DNA,先后送人,酵母的线粒体和核、衣藻的叶绿体和核、洋葱,的表皮细胞以及玉米悬浮细胞中。,?,基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。,2019/1